Zytotoxische Wirksamkeit von Photodynamische Therapie in Osteosarkomzellen<em> In-vitro-</em

Summary

Das Protokoll ermöglicht die hier berichteten Bewertung der Wirksamkeit der photodynamischen Therapie (PDT) in Zelllinien und der Optimierung der PDT Einstellungen, bevor die Therapie in Tiermodellen.

Abstract

In den letzten Jahren gab es die Schwierigkeit, wirksamer Therapien gegen Krebs mit weniger systemische Nebenwirkungen. Daher Photodynamische Therapie ist ein neuer Ansatz für eine Tumor selektive Behandlung.

Photodynamische Therapie (PDT), die Verwendung eines nicht-toxischen macht Photosensibilisators (PS), die bei Aktivierung mit Licht einer spezifischen Wellenlänge in Gegenwart von Sauerstoff, Sauerstoff-Radikale erzeugt, die eine zytotoxische Reaktion ¹ hervorzurufen. Trotz seiner Zustimmung vor fast zwanzig Jahren von der FDA wird PDT heute nur noch verwendet, um eine begrenzte Anzahl von Krebsarten (Haut, Blase) und nononcological Erkrankungen (Psoriasis, aktinische Keratose) ² zu behandeln.

Der Hauptvorteil der Anwendung der PDT ist die Fähigkeit, eine lokale Behandlung, die systemischen Nebenwirkungen verhindert zuführen. Darüber hinaus ermöglicht es die Behandlung von Tumoren an empfindlichen Stellen (zB um Nerven oder Blutgefäße). Hier wird ein intraoperative Anwendung der PDT wird als in Osteosarkom (OS), einem Tumor des Knochens, um Primärtumor Satelliten gezielt in Tumor umgebende Gewebe nach chirurgischer Tumorentfernung hinter sich gelassen. Die Behandlung zielt auf die Verringerung der Anzahl von Wiederholungen und zur Verringerung der Gefahr für die (postoperativ) Metastasierung.

In der vorliegenden Studie, in vitro PDT präsentieren wir Verfahren, um die optimalen Einstellungen für die PDT effektive Behandlung der weit verbreiteten OS-Zelllinien, die verwendet werden, um die menschliche Krankheit in etablierten intratibial OS Mausmodelle reproduzieren zu etablieren. Die Aufnahme des PS mTHPC wurde mit einem Spektrophotometer und Phototoxizität wurde mit Laserlichtanregung bei 652 nm mTHPC provoziert Zelltod mit einem WST-1-Assay und durch das Zählen der überlebenden Zellen beurteilt induzieren sucht. Die etablierten Techniken ermöglichen es uns, die optimalen Einstellungen PDT für zukünftige Studien in Tiermodellen zu definieren. Sie sind eine einfache und schnelle Werkzeug für die Bewertung der Wirksamkeit der PDT <em> In vitro vor einer Anwendung in vivo.

Introduction

Der heutige Stand der Technik Behandlung von Osteosarkom (OS), eine primäre Knochentumor, umfasst eine Kombination von neo adjuvante Chemotherapie und Chirurgie. Dieses Behandlungsschema ergab eine Erhöhung der Überlebensrate von Patienten mit lokalisierter Erkrankung von etwa 20% vor der Verwendung der Chemotherapie zu Zeit zwischen 60-70% ^{3, 4.} Doch in den letzten zwei Jahrzehnten hat sich die Gesamtüberlebenszeit von Patienten mit OS lokale Erkrankung Plateau ^{4, 5.} Außerdem 30-40% dieser Patienten einen Rückfall innerhalb von 3 Jahren nach der Diagnose und bei Patienten mit metastatischen Erkrankung weiterhin eine schlechte Überleben von 20-30% ^{4, 6, 7} aufweisen. Um die Ergebnisse dieser Patienten zu verbessern, müssen neue therapeutische Strategien entwickelt werden.

Photodynamische Therapie (PDT), eine ziemlich neuartige Antikrebstherapie verwendet Licht einer bestimmten Wellenlänge zur Anregung eines phototizer (PS), die nach der Injektion in den Blutstrom in den Tumorzellen akkumuliert. Laserlichtanregung der PS erzeugt Sauerstoffradikale in Gegenwart von Sauerstoff, die zytotoxische Reaktion in Tumorzellen und Zelltod induzieren. Neben dieser Hauptmechanismus, zwei zusätzliche PDT hervorgerufen biologische Prozesse tragen zu reduziertem Tumorwachstum: PDT verursacht Vasokonstriktion und Thrombosebildung des Tumors Mikrovaskulatur und damit lokale Hypoxie und Anoxie im Tumor, was zu Tumorinfarkt. Schließlich verletzt PDT und sterbenden Tumorzellen auslösen, eine lokale Immunantwort, eine ziemlich einzigartige Merkmal der PDT. Dies beinhaltet das Komplementsystem und die Aktivierung von Antigen-präsentierenden dendritischen Zellen ^8. Somit sind die Bedingungen für die Präsentation von Tumorantigenen mit anschließender Aktivierung lymphoider Zellen erzeugt, was zu tumorspezifischen Immunität.

So weit, PDT wurde verwendet, um verschiedene Arten von Weichteiltumoren und hyperpl behandelnAsiens, wie aktinische Keratose, Barrett-Ösophagus, Endobronchialtumor, Blasenkrebs, Basaliome und palliative Behandlung von Kopf-und Halskrebs ^2. Die Behandlung ist bekannt, lokal, Groß Nekrose mit wenig Nebenwirkungen zu induzieren, und hat damit das Potenzial, Tumorgewebe selektiv zu beseitigen. Trotz dieser Vorteile bleibt die Anwendung der PDT technisch anspruchsvoller als die Verabreichung von Chemotherapeutika. Um die maximale Wirksamkeit, die PS-Konzentration, Belichtungszeit und Gesamtlichtenergieübertragung zu erreichen müssen optimiert werden. Dies kann in in vivo-Experimenten gemacht werden, aber aufgrund der relativ großen Anzahl von Parametern, die optimiert werden müssen, ist es effizienter, um optimale Bedingungen in vitro zunächst bestimmen.

In den unten beschriebenen Experimenten testeten wir die in vitro Wirksamkeit der PDT mit der PS 5,10,15,20-Tetrakis-(meta-hydroxyphenyl)-chlOrin, abgekürzt mTHPC (Abbildung 1A). mTHPC ist der Wirkstoff in dem Arzneimittel Foscan, die derzeit in der Klinik für die palliative Behandlung von Kopf-und Halstumoren eingesetzt wird. Es ist eines der stärksten PS, Induktion massiven Zellschäden bereits bei niedrigen Konzentrationen, und es wurde gezeigt, besser als andere zu sein PS in Bezug auf Gewebepenetration ^{9, 10.} Die Lichtabsorptionsspektrum (Abbildung 1B) zeigt zwei prominente Peaks, einen bei 417 nm und eine zweite bei 652 nm, die für die Gewebe Lokalisierung der anfall PS und für die PDT Induktion verwendet werden, auf.

Derzeit ist eine liposomale Formulierung für mTHPC in der Entwicklung. Hier beschreiben wir die Verfahren für die Aufnahme von diesem liposomale Formulierung zu quantifizieren und PDT in zwei menschlichen Zelllinien OS durchzuführen; die niedrige metastasierendem HOS und die hohen metastatischen 143B-Zellen. Einige der hier vorgestellten Daten wurden zuvor ¹¹ gemeldet. Thhier beschriebenen e-Ansatz ermöglicht es uns, die Wirkung einer metastatischen Phänotyp PDT Wirksamkeit zu untersuchen. 143B-Zellen, orthotop in die Hinterbeine von immundefizienten SCID-Mäusen injiziert verursachen intratibial metastasierenden Primärtumoren, ein Modell genau imitiert die menschliche metastasierende Erkrankung. So sind die vorgeschlagenen in vitro Experimente perfekt geeignet zur Beurteilung der optimalen Einstellungen PDT später in in vivo-Experimenten verwendet werden.

Protocol

1. Vergleich der Aufnahme von mTHPC in den jeweiligen Nieder-und Hoch Metastatische HOS und 143B OS-Zelllinien Vorbereitung Zellkulturmedium, das DMEM, Ham F12 und hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum in einem Verhältnis 4.5:4.5:1. Hinweis: Die liposomale Formulierung der PS mTHPC wurde in Wasser in einer Endkonzentration von 1,5 mg / ml mTHPC gelöst. Platte 0,2 x 10 6 HOS und 143B Zellen / Well in 6-Well-Platten (dreifacher Ausführung für jede Bedingung) un…

Representative Results

Mit den hier berichteten Techniken untersuchten wir mTHPC-basierte PDT in menschlichen Zellen OS. Zuerst wurde die Zeit-und Dosis-abhängige Aufnahme von mTHPC im niedrigen metastatischen HOS und in den hoch metastatischen 143B OS Zelllinien untersucht. mTHPC Aufnahme kann durch Messung der Fluoreszenz des mTHPC mit einem Fluoreszenz-Spektrophotometer (Abbildung 2, mit freundlicher Genehmigung von Reidy et al. 11 wiedergegeben) beurteilt werden. 2A veranschaulicht di…

Discussion

Um eine optimale Zytotoxizität in Reaktion auf die PDT zu erreichen, ist es entscheidend, die richtigen Laser Lichteinstellungen und Inkubationszeiten zu wählen. Die hier beschriebenen Verfahren sind konsistent und effizient zu PS-Aufnahme zu bestimmen und PDT induzierte Zytotoxizität in vitro zu quantifizieren. Verwendung der spezifischen Absorptionswellenlängen der PS mTHPC kann die zelluläre Aufnahme PS in direkter Weise bestimmt werden, und die PS kann aktiviert werden, um zytotoxische reaktive Sauerst…

Materials

DMEM	PAA GmbH, Freiburg, Germany	E15-883
HAM F12	PAA GmbH, Freiburg, Germany	E15-817
heat-inactivated fetal calf serum	GIBCO, Basel, Switzerland	10500-064
mTHPC	biolitec research GmbH, Jena, Germany		As this liposomal formulation is originating from R & D no catalogue number is available at the moment. Stock: 1.5mg/ml; provided in a 9:1 mixture of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; >99% purity)
Spectramax Gemini XS plate reader	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	ID# 861
Microscope Zeiss Observer.Z1	Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germany
Ceralas PDT 652 nm Laser	Biolitec AG, Jena, Germany	LD652nm2W400u
Water-soluble tetrazolium (WST) reagent	Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland	1644807