Het protocol hier vermeld kan de evaluatie van de effectiviteit van fotodynamische therapie (PDT) in cellijnen en de optimalisering van de PDT instellingen alvorens de therapie diermodellen.
De laatste jaren is het moeilijk een efficiëntere therapie tegen kanker met minder systemische bijwerkingen geweest. Daarom fotodynamische therapie is een nieuwe benadering voor een tumor selectieve behandeling.
Fotodynamische therapie (PDT) die gebruik maakt van een niet-toxisch fotosensibilisator (PS), dat na activering met licht van een bepaalde golflengte in aanwezigheid van zuurstof, genereert zuurstof radicalen die een cytotoxische reactie 1 wekken. Ondanks de goedkeuring van bijna twintig jaar geleden door de FDA, is PDT tegenwoordig alleen gebruikt voor een beperkt aantal soorten kanker (huid, blaas) en nononcological aandoeningen (psoriasis, actinische keratose) 2 te behandelen.
Het grote voordeel van het gebruik van PDT is de mogelijkheid om een lokale behandeling, die systemische bijwerkingen voorkomt voeren. Bovendien kan de behandeling van tumoren bij gevoelige locaties (bijvoorbeeld rond zenuwen of bloedvaten). Hier, een intraoperative toepassing van PDT wordt beschouwd in osteosarcoom (OS), een tumor van het bot, om de primaire tumor satellieten richten achtergelaten in tumor omliggende weefsel na chirurgische resectie van de tumor. De behandeling is gericht op het verminderen van het aantal herhalingen en op het verminderen van het risico van (postoperatieve) metastase.
In de huidige studie geven we in vitro PDT procedures om de optimale PDT instellingen voor effectieve behandeling van veel gebruikte OS cellijnen die worden gebruikt om de menselijke ziekte reproduceren gevestigde intratibial OS muismodellen stellen. De opname van de PS mTHPC werd onderzocht met een spectrofotometer en fototoxiciteit werd uitgelokt met laserlicht excitatie van mTHPC bij 652 nm tot celdood beoordeeld met een WST-1 test en door het tellen van de overlevende cellen induceren. De gevestigde technieken stellen ons in staat om de optimale PDT instellingen voor toekomstige studies in diermodellen definiëren. Ze zijn gemakkelijk en snel hulpmiddel voor de evaluatie van de werkzaamheid van PDT <em> In vitro voordat een aanvraag in vivo.
Staat vandaag of the art behandeling van osteosarcoom (OS), een primaire bottumor, omvat een combinatie van neo adjuvante chemotherapie en chirurgie. Deze behandeling regime onthulde een verhoging van de overleving van patiënten met gelokaliseerde ziekte van ongeveer 20% voor het gebruik van chemotherapie, om nog 60-70% 3, 4. Echter, in de laatste twee decennia, de algehele overleving van OS patiënten met plaatselijke ziekte is plateaued 4, 5. Bovendien 30-40% van de patiënten een recidief binnen 3 jaar na diagnose en patiënten met metastasen steeds een slechte overleving van 20-30% 4, 6, 7 hebben. De uitkomst van deze patiënten te verbeteren, moeten nieuwe therapeutische strategieën worden ontwikkeld.
Fotodynamische therapie (PDT), een vrij nieuwe therapie tegen kanker, maakt gebruik van licht van een specifieke golflengte voor excitatie van een photosensiTizer (PS), dat zich ophoopt in de tumorcellen na injectie in de bloedbaan. Laserlicht excitatie van de PS genereert zuurstofradicalen in aanwezigheid van zuurstof cytotoxische reactie in tumorcellen en celdood induceren. Naast deze primaire mechanisme, twee extra PDT opgeroepen biologische processen bijdragen aan verminderde tumorgroei: PDT veroorzaakt vasoconstrictie en bloedpropvorming van de tumor microvasculature en bijgevolg lokale hypoxie en anoxie in de tumor, wat leidt tot tumor infarct. Tenslotte PDT gewond en stervende tumorcellen leiden tot een lokale immuunreactie, een vrij unieke eigenschap van PDT. Dit houdt het complementsysteem en de activering van antigeen-presenterende dendritische cellen 8. Zo worden voorwaarden geschapen voor de presentatie van tumorantigenen met daaropvolgende activatie van lymfoïde cellen, leidend tot tumorspecifieke immuniteit.
Tot dusver is PDT gebruikt om verschillende soorten wekedelentumoren en hyperpl behandelenazië, zoals actinische keratose, Barrett-slokdarm, endobronchiale tumoren, blaaskanker, basaalcelcarcinoom en palliatieve behandeling van hoofd-halskanker 2. De behandeling is bekend dat lokale, grootschalige necrose met weinig bijwerkingen, en heeft dus de potentie om tumorweefsel selectief roeien. Ondanks deze voordelen, de toepassing van PDT blijft technisch veeleisender dan de toediening van chemotherapeutische geneesmiddelen. Met het oog op maximale efficiëntie, de PS concentratie, blootstelling aan licht en de totale licht energie-overdracht te realiseren moeten worden geoptimaliseerd. Dit kan in vivo experimenten, maar vanwege het relatief grote aantal parameters die moeten worden geoptimaliseerd, is het efficiënter om eerst te bepalen optimale omstandigheden in vitro.
In de hieronder beschreven experimenten hebben we de in vitro werkzaamheid van PDT getest met PS 5,10,15,20-tetrakis (meta-hydroxyfenyl) chlOrin, afgekort mTHPC (Figuur 1A). mTHPC is de werkzame stof in het geneesmiddel foscan, die momenteel wordt gebruikt in de kliniek voor palliatieve behandeling van hoofd-en halskanker. Het is een van de meest potente PS, induceren massieve celbeschadiging reeds bij lage concentraties, en werd aangetoond superieur aan andere PS zijn in termen van weefselpenetratie 9, 10. Het licht absorptiespectrum (figuur 1B) toont twee prominente pieken, een bij 417 nm en een tweede bij 652 nm, die worden gebruikt voor weefsellokalisatie van het verzamelen PS en PDT inductie, respectievelijk.
Momenteel is een liposomale formulering voor mTHPC is in ontwikkeling. Hier beschrijven we de procedures om de opname van deze liposomale formulering te kwantificeren, en PDT presteren in twee menselijke OS cellijnen, de lage metastatische HOS en de hoge metastatische 143B cellen. Sommige van de hier gepresenteerde gegevens zijn eerder 11 vermeld. The hier beschreven aanpak stelt ons in staat om het effect van een metastatische fenotype op PDT effectiviteit te bestuderen. 143B cellen, orthotopically geïnjecteerd in de achterste ledematen van immuun deficiënte SCID muizen veroorzaken intratibial metastasizing primaire tumoren, een model nauw nabootsen van de menselijke uitzaaiingen ziekte. Dus de voorgestelde in vitro experimenten zijn uitermate geschikt om te beoordelen de optimale instellingen PDT later gebruik in in vivo experimenten.
Om optimale cytotoxiciteit in reactie op PDT bereiken, is het cruciaal om de juiste laserlicht instellingen en incubatietijden kiezen. De hier beschreven procedures zijn consistent en efficiënt naar PS opname te bepalen en PDT geïnduceerde cytotoxiciteit kwantificeren in vitro. De specifieke absorptie golflengten van de PS mTHPC, kan de cellulaire PS opname worden bepaald in een directe wijze en het PS kan worden geactiveerd om cytotoxische reactieve zuurstof species genereren.
Me…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen graag biolitec Research GmbH (Jena, Duitsland) bedanken voor het vriendelijk ons met de liposomale mTHPC formulering, met speciale dank aan Susanna Gräfe en Arno Wiehe voor hun hulp en technische expertise. We willen ook graag Kerstin Reidy, die een groot deel van de gegenereerde resultaten en was medeverantwoordelijk voor de publicatie 11 bedanken.
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Schweizerischer Verein Balgrist, de Universiteit van Zürich, de Krebsliga Zürich alsook door een subsidie van de Walter L. en Johanna Wolf Foundation, Zürich, Zwitserland en een subsidie van EuroNanoMed ERA-NET / SNF Zwitserse National Science Foundation 31NM30-131004/1. Dit werk werd ook ondersteund door de HSM (zeer gespecialiseerde Medicine) programma Musculoskeletale Oncologie van het Kanton Zürich.
DMEM | PAA GmbH, Freiburg, Germany | E15-883 | |
HAM F12 | PAA GmbH, Freiburg, Germany | E15-817 | |
heat-inactivated fetal calf serum | GIBCO, Basel, Switzerland | 10500-064 | |
mTHPC | biolitec research GmbH, Jena, Germany | As this liposomal formulation is originating from R & D no catalogue number is available at the moment. Stock: 1.5mg/ml; provided in a 9:1 mixture of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; >99% purity) |
|
Spectramax Gemini XS plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ID# 861 | |
Microscope Zeiss Observer.Z1 | Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germany | ||
Ceralas PDT 652 nm Laser | Biolitec AG, Jena, Germany | LD652nm2W400u | |
Water-soluble tetrazolium (WST) reagent | Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland | 1644807 |