Citotóxica eficacia de la terapia fotodinámica en células de osteosarcoma<em> In Vitro</em
Summary
El protocolo informado aquí permite la evaluación de la eficacia de la terapia fotodinámica (PDT) en líneas de células y la optimización de la configuración de PDT antes de aplicar la terapia en modelos animales.
Abstract
En los últimos años, ha sido la dificultad en la búsqueda de terapias más eficaces contra el cáncer con menos efectos secundarios sistémicos. Por lo tanto la terapia fotodinámica es un nuevo enfoque para el tratamiento selectivo del tumor más.
Terapia fotodinámica (PDT) que hace uso de un fotosensibilizador no tóxico (PS), que, tras la activación con luz de una longitud de onda específica en la presencia de oxígeno, genera radicales de oxígeno que provocan una respuesta citotóxica 1. A pesar de su aprobación hace casi veinte años por la FDA, PDT es hoy en día sólo se utiliza para tratar un número limitado de tipos de cáncer (de piel, de la vejiga) y las enfermedades no oncológico (psoriasis, queratosis actínica) 2.
La principal ventaja de la utilización de la PDT es la capacidad de realizar un tratamiento local, lo que evita efectos secundarios sistémicos. Además, permite el tratamiento de tumores en sitios delicados (por ejemplo, alrededor de los nervios o vasos sanguíneos). Aquí, un intraoperative aplicación de la TFD se considera en el osteosarcoma (OS), un tumor de la médula, para apuntar los satélites de tumor primario queda atrás en el tumor de tejido circundante después de la resección quirúrgica del tumor. El tratamiento tiene como objetivo disminuir el número de recurrencias y a reducir el riesgo de (postoperatoria) la metástasis.
En el presente estudio, se presentan pt los procedimientos in vitro PDT para establecer la configuración de PDT óptimas para el tratamiento eficaz de las líneas celulares usadas ampliamente OS que se utilizan para reproducir la enfermedad humana en modelos de ratón OS intratibial bien establecidos. La absorción de la PS mTHPC se examinó con un espectrofotómetro y fototoxicidad se provocaron con la luz láser de excitación de mTHPC a 652 nm para inducir la muerte celular evaluada con un ensayo de WST-1 y por el recuento de células supervivientes. Las técnicas establecidas nos permiten definir los ajustes óptimos PDT para futuros estudios en modelos animales. Son una herramienta fácil y rápida para la evaluación de la eficacia de la terapia fotodinámica <em> In vitro antes de una aplicación in vivo.
Introduction
Estado actual del tratamiento del arte del osteosarcoma (OS), un tumor óseo primario, abarca una combinación de quimioterapia adyuvante neo y la cirugía. Este régimen de tratamiento reveló un aumento en la tasa de supervivencia de los pacientes con enfermedad localizada de aproximadamente 20% antes del uso de la quimioterapia, a actualmente entre 60-70% 3, 4. Sin embargo, en las últimas dos décadas, la supervivencia global de los pacientes OS con enfermedad local se ha estancado 4, 5. Por otra parte, el 30-40% de los pacientes recae dentro de 3 años después del diagnóstico y los pacientes con enfermedad metastásica siguen teniendo una baja supervivencia de 20-30% 4, 6, 7. Para mejorar el resultado de estos pacientes, las nuevas estrategias terapéuticas deben ser desarrollados.
Terapia fotodinámica (PDT), en lugar de una nueva terapia contra el cáncer, utiliza la luz de una longitud de onda específica para la excitación de un fotosensibleTizer (PS), que se acumula en las células tumorales después de su inyección en el torrente sanguíneo. La luz del láser de excitación de la PS genera radicales de oxígeno en la presencia de oxígeno, que inducen reacción citotóxica en las células tumorales y la muerte celular. Además de este mecanismo primaria, dos adicionales PDT evocados procesos biológicos contribuyen al crecimiento del tumor reducida: PDT causa vasoconstricción y la formación de trombos de la microvasculatura del tumor y, por consiguiente, la hipoxia local y la anoxia el interior del tumor, lo que lleva a un infarto del tumor. Por último, PDT lesiona y mueren las células tumorales activan una respuesta inmune local, una característica muy especial de la TFD. Esto implica el sistema del complemento y la activación de células presentadoras de antígeno dendríticas 8. Por lo tanto, se crean condiciones para la presentación de antígenos tumorales con la posterior activación de las células linfoides, que conduce a la inmunidad específica de tumor.
Hasta ahora, la TFD se ha usado para tratar varios tipos de tumores de tejidos blandos y hyperplasia de, como queratosis actínica, el esófago de Barrett, los tumores endobronquiales, cáncer de vejiga, carcinomas de células basales y el tratamiento paliativo del cáncer de cabeza y cuello 2. El tratamiento se sabe que inducen, la necrosis local a gran escala con sólo pocos efectos secundarios, y por lo tanto tiene el potencial para erradicar selectivamente el tejido tumoral. A pesar de estas ventajas, la aplicación de la TFD sigue siendo técnicamente más exigente que la administración de fármacos quimioterapéuticos. Con el fin de lograr la máxima eficacia, la concentración de PS, el tiempo de exposición a la luz y la transferencia total de energía de la luz necesita ser optimizado. Esto se puede hacer en experimentos in vivo, pero, debido a la gran número relativo de parámetros que necesitan ser optimizados, es más eficiente para determinar inicialmente las condiciones óptimas in vitro.
En los experimentos que se describen a continuación, hemos probado la eficacia in vitro de la TFD con una EP 5,10,15,20-tetrakis (meta-hidroxifenil) chlorin, abreviado mTHPC (Figura 1A). mTHPC es la sustancia activa en el producto medicinal Foscan, que se utiliza actualmente en la clínica para el tratamiento paliativo del cáncer de cabeza y cuello. Es uno de los PS más potente, la inducción de daño celular masiva ya a bajas concentraciones, y se demostró que es superior a otra PS en términos de penetración en el tejido 9, 10. Su espectro de absorción de la luz (Figura 1B) muestra dos picos prominentes, uno a 417 nm y un segundo a 652 nm, que se utilizan para la localización de tejido de acumulación de PS y para PDT de inducción, respectivamente.
En la actualidad, una formulación liposomal de mTHPC está en desarrollo. A continuación, describimos los procedimientos para cuantificar la absorción de esta formulación liposomal, y para llevar a cabo la TFD en dos líneas celulares humanas OS, el bajo HOS metastásico y las células metastásicas 143B altos. Algunos de los datos que aquí se presentan han sido reportados anteriormente 11. Thenfoque E descrito aquí nos permite estudiar el efecto de un fenotipo metastásico en la eficacia de la TFD. 143B células ortotópicamente, inyectados en las extremidades traseras de los ratones SCID inmunodeficientes causan intratibial tumores primarios en metástasis, un modelo que imita estrechamente la enfermedad metástasis humana. Por lo tanto, los experimentos in vitro propuestas son perfectamente adecuados para evaluar los ajustes óptimos PDT que se utilizarán posteriormente en experimentos in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para lograr citotoxicidad óptimo en respuesta a PDT, es fundamental para elegir los ajustes de luz láser adecuados y los tiempos de incubación. Los procedimientos aquí descritos son consistentes y eficientes para determinar la absorción de PS y cuantificar la citotoxicidad inducida por la TFD in vitro. El uso de las longitudes de onda de absorción específica de la PS mTHPC, la absorción de PS celular se puede determinar de una manera directa, y la PS se puede activar para generar especies de oxígeno re…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a biolitec Research GmbH (Jena, Alemania) por la amabilidad de darnos la formulación liposomal mTHPC, con un agradecimiento especial a Susanna Gräfe y Arno Wiehe por su ayuda y conocimientos técnicos. También nos gustaría dar las gracias a Kerstin Reidy, que genera una gran parte de los resultados y fue corresponsable de su publicación 11.
Este trabajo fue apoyado por becas de la Schweizerischer Verein Balgrist, la Universidad de Zurich, el Krebsliga Zurich, así como por una beca de la Walter L. y Johanna Fundación Wolf, Zurich, Suiza, y una beca de EuroNanoMed ERA-NET / SNF suizo Fundación Nacional para la Ciencia 31NM30-131004/1. Este trabajo también fue apoyado por el programa (de Alta Especialidad de Medicina) para musculoesqueléticos Oncología del Cantón de Zurich HSM.
Materials
| DMEM | PAA GmbH, Freiburg, Germany | E15-883 | |
| HAM F12 | PAA GmbH, Freiburg, Germany | E15-817 | |
| heat-inactivated fetal calf serum | GIBCO, Basel, Switzerland | 10500-064 | |
| mTHPC | biolitec research GmbH, Jena, Germany | As this liposomal formulation is originating from R & D no catalogue number is available at the moment. Stock: 1.5mg/ml; provided in a 9:1 mixture of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; >99% purity) |
|
| Spectramax Gemini XS plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ID# 861 | |
| Microscope Zeiss Observer.Z1 | Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germany | ||
| Ceralas PDT 652 nm Laser | Biolitec AG, Jena, Germany | LD652nm2W400u | |
| Water-soluble tetrazolium (WST) reagent | Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland | 1644807 |
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