Een methode voor het genereren van Pulmonale neutrofilie behulp Aerosolized Lipopolysaccharide

Summary

We beschrijven een werkwijze voor het induceren neutrofiele longontsteking door uitdaging om vernevelde lipopolysacharide door verneveling, te modelleren acute longbeschadiging. Daarnaast worden fundamentele chirurgische technieken long isolatie, tracheale intubatie en bronchoalveolaire lavage beschreven.

Abstract

Acute lung injury (ALI) is een ernstige ziekte die wordt gekenmerkt door alveolaire neutrofilie, met beperkte behandelingsmogelijkheden en een hoge mortaliteit. Experimentele modellen van ALI zijn sleutel in het verbeteren van ons begrip van de pathogenese van de ziekte. Lipopolysaccharide (LPS) afkomstig van grampositieve bacteriën induceert neutrofiele ontsteking in de luchtwegen en longen parenchym muizen. Efficiënte pulmonaire afgifte van verbindingen zoals LPS is echter moeilijk te realiseren. In de hier beschreven aanpak wordt pulmonaire toediening bij muizen bereikt door uitdaging om vernevelde Pseudomonas aeruginosa LPS. Opgelost LPS werd verstoven door een vernevelaar aangesloten op perslucht. Muizen werden blootgesteld aan een continue stroom van LPS aerosol in een plexiglas doos gedurende 10 minuten, gevolgd door 2 minuten conditioneren nadat de aerosol werd beëindigd. Tracheale intubatie en daaropvolgende bronchoalveolaire lavage, gevolgd door formaline perfusie werd vervolgens uitgevoerd, die het mogelijk maakt karakterisering van de steriele pulmonary ontsteking. Aerosolized LPS genereert een longontsteking gekenmerkt door alveolaire neutrofilie, gedetecteerd in bronchoalveolaire lavage en door histologische evaluatie. Deze techniek kan worden ingesteld tegen een kleine prijs met weinig apparatuur, en vereist een minimale training en expertise. Het belichtingssysteem kan dus routinematig worden uitgevoerd bij elk laboratorium, met het potentieel om ons begrip van longpathologie verbeteren.

Introduction

Lipopolysaccharide (LPS) is een celwand component van Gram-negatieve bacteriën ^1. Uitdaging aan LPS is een goed gedocumenteerde model van acute longbeschadiging, een syndroom gekenmerkt door acute neutrofiele ontsteking en oedeem ^2. Bovendien, pulmonaire neutrofiel is een kenmerk van chronische obstructieve longziekte (COPD) ³ en LPS uitdaging bij mensen werd gebruikt om het model COPD exacerbaties ^4. Zo, experimentele modellen van LPS blootstelling zijn klinisch relevante en waardevolle instrumenten voor de menselijke pathologie te begrijpen.

Doel van de pulmonaire toediening van aërosol LPS hier beschreven om een ​​neutrofiele ontstekingsreactie in de geleidende en luchtwegen, zonder systemische betrokkenheid genereren. Verscheidene technieken van LPS uitdaging zijn eerder beschreven. Intra-veneuze injectie van LPS is de meest gebruikte toedieningsweg. Hoewel deze techniek is gemakkelijk te bereiken, tHij primaire schade aan het endotheel, met secundaire vernietiging van de longepitheel volgende neutrofiel migratie naar de longen. Intra-veneuze toediening induceert ook systemische inflammatie ^2, waarbij het ​​ziektebeeld bemoeilijken in diermodellen. Systemische ontsteking in tegenstelling niet waargenomen met intratracheale toediening. Deze techniek is echter arbeidsintensief en vereist anesthetica en aanzienlijke training ^{5, 6.} Bovendien pulmonaire depositie door deze wijze van toediening is afhankelijk van de ademhaling ^7. Aldus wordt pulmonaire depositie beïnvloed door de diepte van anesthesie nodig voor de intra- tracheale toediening en differentiële depositie in de luchtwegen kan worden waargenomen. Daarentegen pulmonaire toediening met aërosol LPS vereist minimale training, en kan gemakkelijk worden bereikt op een groot aantal dieren met weinig of geen variatie tussen individuen ^{5, 8.}Een recente studie bevestigt dat aerosolafgifte superieur is aan de intratracheaal inzake depositie die relevanter doses LPS induceren neutrofiele ontsteking met dit model ^8.

Eerdere studies hebben aangetoond dat uitdaging aërosol Pseudomonas aeruginosa LPS genereert een sterke ontstekingsreactie in de luchtwegen lumen longparenchym, waaronder de alveolaire ruimten ^{9, 10.} De ontsteking wordt gekenmerkt door een overwegend neutrofielen en aanwezigheid van longoedeem, en kan dus worden gebruikt om pathogenese van acute longbeschadiging te pakken en krijgen verdere kennis van de mechanismen die bijdragen aan ziekte pathologie.

Protocol

Het dier studies werden goedgekeurd door de Noordelijke Stockholm dierenwelzijn ethische commissie. De experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Zweedse wetgeving. 1. Het genereren van een LPS Aerosol Los 0,5 g gezuiverd P. aeruginosa LPS in 50 ml steriele zoutoplossing onder zacht schudden en controleer of ontbinding. Verdun 1 ml LPS opgelost in 9 ml steriele zoutoplossing tot een eindconcentratie van 1 mg / ml. Beschermen tegen licht met alumi…

Representative Results

Uitdaging om vernevelde P. aeruginosa LPS levert meestal een duidelijke ontstekingsreactie lumen van de luchtwegen en alveolaire ruimte, gekenmerkt door een overwegend neutrofielen zowel vroege als late tijdstippen. Aerosolized LPS induceert pulmonale neutrofilie C57BL / 6BY en BALB / c-muizen werden blootgesteld aan vernevelde P. aeruginosa LPS of voertuig alleen en neutrofielen werden in BALF opgesomd. Het totale celaantal in BALF van C57BL / 6BY…

Discussion

Aerosolized LPS genereert een ontstekingsreactie in de luchtwegen, gekenmerkt door neutrofielen in epitheel submucosa, ruimten rond de geleidende luchtwegen, alsmede de alveolaire ruimten. Dit, samen met de verhoogde totale eiwitgehalte in BALF, indicatief plasmalekkage, vertegenwoordiger van de pathologie van acute longbeschadiging. Als LPS induceert een steriele ontsteking, de reactie is onafhankelijk van de adaptieve immuunrespons, en er zijn beperkingen voor de relevantie voor bacteriële infecties. De techniek kan …

Materials

Name of the material/equipment	Company	Catalog number	Comments/Description
Purified Pseudomonas aeruginosa LPS	Sigma-Aldrich		Harmful. Recomended purification. LPS purified from other bactria may be used.
Pari LC sprint star nebulizer	PARI Respiratory Equipment Inc.	023G1250
TSI mass flowmeter 4040	TSI	4040	Alternative product from supplier may be used.
Saint-Gobain 15.9 mm Tygon tube	Sigma-Aldrich	Z685704	Recomended brand.
Plexiglas boxes with removable lids	Custom built	N/A	150 x 163 x 205 mm (a 2 mm hole on the side).
3M Half Facepiece Reusable Respirator	3M	7503	Recomended brand.
3M Advanced Particulate Filters (P100)	3M	2291	Recomended brand.
Sissors	VWR	233-1104	Preferred scissors may be used.
Forceps	VWR	232-1313	Preferred forceps may be used.
Intramedic PE50 polyethylene tube	BD	427411	Recomended brand.
Ethicon 2-0 Perma-hand silk tread	VWR	95056-992	Recomended brand.
26 ½  gage needle			Alternative suppliers exist.
1 mL BD slip-tip syringe, non-sterile	BD	301025	Alternative suppliers exist.
60 mL BD Luer-Lok syringe, non-sterile, polypropolene	BD	301035	Alternative suppliers exist.
Fluka Hematoxylin-Eosin	Sigma-Aldrich	3972	Alternative suppliers exist.
Türk's solution	Merck Millipore	109277
Table top centrifuge			Alternative manufacturers exist.
Cytospin 4 cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003	Alternative centrifuge can be used.
HEMA-3 stat pack	Fisher Scientific	23-123-869	Alternative staining kits exists.
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Alternative suppliers exist.