Summary

Verfahren zur Erzeugung von Lungen Neutrophilie Mit aerosolisiertes Lipopolysaccharide

Published: December 15, 2014
doi:

Summary

Wir beschreiben ein Verfahren zur Induktion von neutrophilen Lungenentzündung durch Herausforderung aerosolized Lipopolysaccharid durch Vernebelung, akuter Lungenschädigung-Modell. Darüber hinaus werden grundlegende chirurgische Techniken für Lungen Isolation, Intubation und Bronchiallavage ebenfalls beschrieben.

Abstract

Akutem Lungenversagen (ALI) ist eine schwere Erkrankung, die alveoläre Neutrophilie, mit begrenzten Behandlungsmöglichkeiten und eine hohe Sterblichkeit. Experimentelle Modelle der ALI sind der Schlüssel bei der Verbesserung unseres Verständnisses der Pathogenese der Erkrankung. Lipopolysaccharid (LPS) aus grampositiven Bakterien stammt induziert neutrophile Entzündung in den Atemwegen und Lungenparenchym von Mäusen. Efficient pulmonalen Verabreichung von Verbindungen, wie LPS ist jedoch schwierig zu erreichen. In der hier beschriebenen Vorgehensweise wird pulmonalen Verabreichung bei Mäusen durch Herausforderung aerosolized Pseudomonas aeruginosa LPS erreicht. Gelöst LPS wurde durch einen Zerstäuber mit Druckluft angeschlossen vernebelt. Die Mäuse wurden in einen kontinuierlichen Strom von LPS Aerosol in einer Plexiglas-Box 10 Minuten lang ausgesetzt, gefolgt von 2 min Konditionierung nach dem Aerosol wurde abgebrochen. Intubation und anschließende Bronchiallavage, gefolgt von Formalin Perfusion wurde als nächstes durchgeführt, die für die Charakterisierung des sterilen p ermöglichtulmonary Entzündung. Aerosolized LPS erzeugt eine Lungenentzündung gekennzeichnet durch alveoläre Neutrophilie, in Bronchiallavage und durch histologische Begutachtung festgestellt. Diese Technik kann gegen eine geringe Gebühr mit wenigen Geräten eingestellt werden, und erfordert nur minimale Schulung und Know-how. Das Belichtungssystem durch eine Routinejeder Labor durchgeführt werden, mit dem Potential, das Verständnis der Lungenpathologie verbessern.

Introduction

Lipopolysaccharid (LPS) ist ein Zellwandkomponente von Gram-negativen Bakterien 1. Herausforderung LPS ist ein gut dokumentiertes Modell des akuten Lungenversagens, ein Syndrom, das durch eine akute neutrophile Entzündung und Ödem 2. Zusätzlich ist Lungen Neutrophilie auch ein Markenzeichen von chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) 3 und LPS bei Menschen verwendet wurde, um COPDExazerbationen 4 modellieren. So sind experimentellen Modellen der LPS Exposition klinisch relevante und wertvolle Werkzeuge für die menschliche Pathologie zu verstehen.

Das Ziel der pulmonalen Verabreichung von hier beschriebenen aerosolized LPS ist es, eine neutrophile Entzündungsreaktion in den leitenden und den Atemwegen, ohne systemische Beteiligung erzeugen. Verschiedene Techniken von LPS wurden bereits beschrieben. Intravenöse Injektion von LPS ist die am häufigsten verwendete Art der Verabreichung. Obwohl diese Technik ist leicht zugänglich, ter Primärschaden ist an das Endothel, mit sekundären Zerstörung der Lungenepithel folgenden neutrophilen Migration in die Lunge. Intravenöse Verabreichung induziert auch systemische Entzündung 2, die das klinische Bild in Tiermodellen erschweren kann. Systemische Entzündung ist hingegen nicht durch intratracheale Verabreichung beobachtet. Diese Technik ist jedoch arbeitsintensiv und erfordert Anästhetika sowie erhebliche Trainings 5, 6. Darüber hinaus ist Lung dieses Verabreichungsweg abhängig von Atem 7. Somit wird Lungenablagerung durch die Narkosetiefe für die intra tracheale Verabreichung und variable Abscheidung in den Atemwegen beobachtet werden benötigt betroffen. Im Gegensatz dazu pulmonalen Verabreichung mit aerosoli LPS erfordert minimales Training, und kann leicht zu einer großen Anzahl von Tieren, die mit wenig oder gar keine Variation zwischen Individuen 5, 8 durchgeführt werden.Eine aktuelle Studie bestätigt, dass die Aerosolabgabe ist besser als die intratracheal im Hinblick auf die Abscheidung und relevanter Dosen von LPS induziert neutrophilen Entzündung mit diesem Modell 8.

Frühere Studien haben gezeigt, dass diese Herausforderung vernebelt Pseudomonas aeruginosa LPS erzeugt eine deutliche Entzündungsreaktion in den Atemwegen Lumen und Lungenparenchym, einschließlich der Alveolarräumen 9, 10. Die Entzündung wird durch ein Vorherrschen der Neutrophilen und die Anwesenheit von Lungenödem gekennzeichnet und können daher verwendet werden, um die Pathogenese von akuter Lungenverletzung Adresse weiter und gewinnt die Kenntnis der Mechanismen Beitrag zur Krankheitspathologie.

Protocol

Die tierexperimentellen Studien wurden von der Nord Stockholm Tierschutz Ethikkommission genehmigt. Die experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit schwedischen Rechts durchgeführt. 1. Erstellen eines LPS Aerosol Man löst 0,5 g gereinigtes P. aeruginosa LPS in 50 ml steriler Kochsalzlösung unter leichtem Schütteln und überprüfen Sie die Auflösung. Gebrauchslösung: 1 ml LPS gelöst in 9 ml steriler Salzlösung bis zu einer Endkonzentration von 1 mg / m…

Representative Results

Herausforderung aerosolized P. aeruginosa LPS ergibt in der Regel eine starke entzündliche Reaktion in den Atemwegslumen und Alveolarraum, gekennzeichnet durch ein Vorherrschen der Neutrophilen an beiden frühen und späten Zeitpunkten. Aerosolized LPS induziert Lungen Neutrophilie C57BL / 6by und BALB / c-Mäuse wurden einem Aerosol ausgesetzt P. aeruginosa LPS oder Vehikel und Neutrophile wurden in BALF aufgezählt. Die Gesamtzellzahl in der BAL…

Discussion

Aerosolierte LPS erzeugt eine Entzündungsreaktion in den Atemwegen von Neutrophilen im epithelialen submucosa gekennzeichnet, umgebenden Räumen die leitenden Atemwege, sowie die Alveolen. Dies ist zusammen mit der erhöhten Gesamtproteingehalt in BALF anzeigt Plasmaleckage, repräsentativ für die Pathologie von akuter Lungenverletzung. LPS induziert eine sterile Entzündung ist die Reaktion unabhängig von der adaptiven Immunantwort, und es gibt Grenzen für die Relevanz für bakterielle Infektionen. Die Technik kann…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten Kerstin Thim (Astrazeneca, Lund, Schweden), Benita Dahlberg und Dr. Anders Eklund (Karolinska Institutet, Stockholm, Schweden) sowie Dr. Martin Stampfli (McMaster University, Hamilton, ON, Kanada) für geschickte Unterstützung danken und kompetente Beratung.

Materials

Name of the material/equipment  Company Catalog number Comments/Description
Purified Pseudomonas aeruginosa LPS  Sigma-Aldrich Harmful. Recomended purification. LPS purified from other bactria may be used.
Pari LC sprint star nebulizer PARI Respiratory Equipment Inc.  023G1250
TSI mass flowmeter 4040 TSI 4040 Alternative product from supplier may be used.
Saint-Gobain 15.9 mm Tygon tube Sigma-Aldrich Z685704 Recomended brand.
Plexiglas boxes with removable lids Custom built N/A 150 x 163 x 205 mm (a 2 mm hole on the side). 
3M Half Facepiece Reusable Respirator 3M 7503 Recomended brand.
3M Advanced Particulate Filters (P100)  3M 2291 Recomended brand.
Sissors VWR 233-1104 Preferred scissors may be used.
Forceps  VWR 232-1313 Preferred forceps may be used.
Intramedic PE50 polyethylene tube BD 427411 Recomended brand.
Ethicon 2-0 Perma-hand silk tread  VWR 95056-992 Recomended brand.
26 ½  gage needle  Alternative suppliers exist.
1 mL BD slip-tip syringe, non-sterile BD 301025 Alternative suppliers exist.
60 mL BD Luer-Lok syringe, non-sterile, polypropolene  BD 301035 Alternative suppliers exist.
Fluka Hematoxylin-Eosin Sigma-Aldrich 3972 Alternative suppliers exist.
Türk's solution Merck Millipore 109277
Table top centrifuge Alternative manufacturers exist.
Cytospin 4 cytocentrifuge Thermo Scientific A78300003 Alternative centrifuge can be used. 
HEMA-3 stat pack Fisher Scientific 23-123-869 Alternative staining kits exists.
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128  Alternative suppliers exist.

Referências

  1. King, J. D., Kocincova, D., Westman, E. L., Lam, J. S. Review: Lipopolysaccharide biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Innate Immun. 15, 261-312 (2009).
  2. Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of neutrophils to acute lung injury. Mol Med. 17, 293-307 (2011).
  3. Pesci, A., et al. Inflammatory cells and mediators in bronchial lavage of patients with chronic obstructive pulmonary disease. Eur Respir J. 12, 380-386 (1998).
  4. Hoogerwerf, J. J., et al. Lung Inflammation Induced by Lipoteichoic Acid or Lipopolysaccharide in Humans. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 178, 34-41 (2008).
  5. Scheuchenzuber, W. J., Eskew, M. L., Zarkower, A. Comparative humoral responses to Escherichia coli and sheep red blood cell antigens introduced via the respiratory tract. Exp Lung Res. 13, 97-112 (1987).
  6. Asti, C., et al. Lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. I. Concomitant evaluation of inflammatory cells and haemorrhagic lung damage. Pulm Pharmacol Ther. 13, 61-69 (2000).
  7. Brand, P., et al. Total deposition of therapeutic particles during spontaneous and controlled inhalations. Journal of pharmaceutical sciences. 89, 724-731 (2000).
  8. Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trubel, H., Wang, C. Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation. Toxicology. 304, 158-166 (2013).
  9. Skerrett, S. J., et al. Role of the type 1 TNF receptor in lung inflammation after inhalation of endotoxin or Pseudomonas aeruginosa. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 276, L715-L727 (1999).
  10. Roos, A. B., et al. Lung epithelial-C/EBPbeta contributes to LPS-induced inflammation and its suppression by formoterol. Biochem Biophys Res Commun. 423, 134-139 (2012).
  11. Didon, L., et al. Lung epithelial CCAAT/enhancer-binding protein-beta is necessary for the integrity of inflammatory responses to cigarette smoke. Am J Respir Crit Care Med. 184, 233-242 (2011).
  12. Silverpil, E., et al. Negative feedback on IL-23 exerted by IL-17A during pulmonary inflammation. Innate Immunity. 19, 479-492 (2013).
  13. Mercer, P. F., et al. Proteinase-Activated Receptor-1, CCL2 and CCL7 Regulate Acute Neutrophilic Lung Inflammation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. , (2013).
  14. Korkmaz, B., Horwitz, M. S., Jenne, D. E., Gauthier, F. . Neutrophil Elastase, Proteinase 3, and Cathepsin G as Therapeutic Targets in Human Diseases. Pharmacological Reviews. 62, 726-759 (2010).
  15. Bafadhel, M., et al. Acute Exacerbations of COPD: Identification of Biological Clusters and Their Biomarkers. Am. J. Respir. Crit. Care Med. , 201104-200597 (2011).
  16. Hurst, J. R., Perera, W. R., Wilkinson, T. M. A., Donaldson, G. C., Donaldson, G. C., Wedzicha, G. C. Systemic and Upper and Lower Airway Inflammation at Exacerbation of Chronic Obstructive Pulmonary. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 173, 71-78 (2006).
  17. Rabe, K. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease: GOLD Executive Summary. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 176, 532-555 (2007).
check_url/pt/51470?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Roos, A. B., Berg, T., Ahlgren, K. M., Grunewald, J., Nord, M. A Method for Generating Pulmonary Neutrophilia Using Aerosolized Lipopolysaccharide. J. Vis. Exp. (94), e51470, doi:10.3791/51470 (2014).

View Video