Um método para gerar Pulmonar Neutrofilia Usando Aerosolized Lipopolysaccharide

Summary

Descreve-se um método para a indução de inflamação pulmonar neutrofílica desafio por aerossol para lipopolissacarídeo por nebulização, para modelar a lesão pulmonar aguda. Além disso, também são descritas as técnicas cirúrgicas básicas para isolamento pulmonar, intubação traqueal e lavado bronco-alveolar.

Abstract

A lesão pulmonar aguda (LPA) é uma doença grave, caracterizada por neutrofilia alveolar, com opções limitadas de tratamento e alta mortalidade. Modelos experimentais de ALI são fundamentais para melhorar a nossa compreensão da patogênese da doença. O lipopolissacárido (LPS) derivadas a partir de bactérias gram positivas induz inflamação neutrofílica nas vias aéreas e do parênquima pulmonar de ratos. Administração pulmonar eficaz de compostos, tais como LPS é, no entanto, difícil de alcançar. Na abordagem aqui descrita, a administração pulmonar em ratinhos é obtido por desafio com aerossol Pseudomonas aeruginosa LPS. LPS foi dissolvido em aerossol através de um nebulizador conectado ao ar comprimido. Os ratinhos foram expostos a um fluxo contínuo de aerossol de LPS numa caixa de plexiglas durante 10 minutos, seguido de 2 minutos após o condicionamento de aerossol foi descontinuado. Entubação traqueal e subsequente lavagem broncoalveolar, seguido por perfusão de formalina foi realizada próximo, o que permite a caracterização do p estérilinflamação ulmonar. Aerosolized LPS gera uma inflamação pulmonar caracterizada por neutrofilia alveolar, detectado no lavado bronco-alveolar e pela avaliação histológica. Esta técnica pode ser configurado com um custo pequeno, com poucos aparelhos, e exige treinamento e experiência mínima. O sistema de exposição pode, portanto, ser realizado rotineiramente em qualquer laboratório, com o potencial de melhorar a nossa compreensão da patologia pulmonar.

Introduction

O lipopolissacárido (LPS) é um componente da parede celular de bactérias gram-negativas ^1. Desafio ao LPS é um modelo bem documentado da lesão pulmonar aguda, uma síndroma caracterizada por inflamação e edema agudo neutrofílica ^2. Além disso, a neutrofilia pulmonar é também uma característica da doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC) ^3, e provocação com LPS em seres humanos tem sido utilizado para modelar as exacerbações da DPOC ^4. Assim, modelos experimentais de exposição LPS são clinicamente relevantes e ferramentas valiosas para entender a patologia humana.

O objetivo da administração pulmonar de LPS aerossol descritas aqui é gerar uma resposta inflamatória neutrofílica na condução e vias respiratórias, sem envolvimento sistêmico. Várias técnicas de provocação com LPS foram descritos anteriormente. Injecção intra-venosa do LPS é a via de administração mais utilizada. Embora esta técnica é facilmente acessível, tele dano primário é para o endotélio, com destruição secundário do epitélio pulmonar após a migração de neutrófilos para o pulmão. A administração intra-venosa também induz inflamação sistémica ^2, o que pode complicar o quadro clínico em modelos animais. Inflamação sistémica está em contraste não observados com a administração intra-traqueal. Esta técnica, no entanto, é trabalhoso e requer anestésicos, bem como treinamento considerável ^{5, 6.} Além disso, a deposição pulmonar por esta via de administração é dependente de respiração ^7. Assim, a deposição pulmonar é afectada pela profundidade da anestesia necessários para a administração intra traqueal e variável deposição nas vias aéreas pode ser observada. Em contraste, a administração pulmonar com LPS requer o mínimo de formação de aerossol, e pode ser facilmente conseguido com um grande número de animais com pouca ou nenhuma variação entre indivíduos ^{5, 8.}Um estudo recente confirmou que o fornecimento de aerossol é superior a via intra-traqueal em relação à deposição, e que doses mais pertinentes do LPS induzir inflamação neutrofílica com este modelo ^8.

Estudos anteriores demonstraram que a desafio aerossolizado Psuedomonas aeruginosa LPS gera uma resposta inflamatória significativa no lúmen das vias aéreas e do parênquima pulmonar, incluindo os espaços alveolares ^{9, 10.} A inflamação é caracterizada pela predominância de neutrófilos e presença de edema pulmonar, e pode, assim, ser usado para endereçar patogénese da lesão pulmonar aguda e ganhar conhecimento adicional sobre os mecanismos que contribuem para a patologia da doença.

Protocol

Os estudos com animais foram aprovados pelo comitê de ética bem-estar animal do Norte Estocolmo. Os procedimentos experimentais foram realizados em conformidade com a lei sueca. 1. Gerando um LPS Aerosol Dissolve-se 0,5 g purificado P. aeruginosa LPS em 50 ml de solução salina estéril com agitação suave e verificar dissolução. Dilui-se 1 ml de LPS dissolvidos em 9 ml de solução salina estéril, a uma concentração final de 1 mg / ml. Proteger da luz com papel …

Representative Results

Desafio para aerossol P. aeruginosa LPS geralmente produz uma resposta inflamatória marcado no lúmen das vias aéreas e do espaço alveolar, caracterizado por uma predominância de neutrófilos em ambos os pontos de tempo precoces e tardios. Aerosolized LPS induz neutrophilia pulmonar C57BL / 6BY e BALB / c foram expostos a aerossol P. aeruginosa LPS ou veículo sozinho e neutrófilos foram enumerados no LBA. O número total de células no FLBA d…

Discussion

Em aerossol de LPS gera uma resposta inflamatória nas vias aéreas, caracterizada por neutrófilos na submucosa epitelial, espaços circundantes as vias aéreas de condução, bem como os espaços alveolares. Isto é, em conjunto com o aumento do conteúdo de proteína total na LBA, indicativo de perda de plasma, representativo da patologia da lesão pulmonar aguda. Como LPS induz uma inflamação estéril, a reacção é independente da resposta imune adaptativa, e existem limitações para a relevância para infecç?…

Materials

Name of the material/equipment	Company	Catalog number	Comments/Description
Purified Pseudomonas aeruginosa LPS	Sigma-Aldrich		Harmful. Recomended purification. LPS purified from other bactria may be used.
Pari LC sprint star nebulizer	PARI Respiratory Equipment Inc.	023G1250
TSI mass flowmeter 4040	TSI	4040	Alternative product from supplier may be used.
Saint-Gobain 15.9 mm Tygon tube	Sigma-Aldrich	Z685704	Recomended brand.
Plexiglas boxes with removable lids	Custom built	N/A	150 x 163 x 205 mm (a 2 mm hole on the side).
3M Half Facepiece Reusable Respirator	3M	7503	Recomended brand.
3M Advanced Particulate Filters (P100)	3M	2291	Recomended brand.
Sissors	VWR	233-1104	Preferred scissors may be used.
Forceps	VWR	232-1313	Preferred forceps may be used.
Intramedic PE50 polyethylene tube	BD	427411	Recomended brand.
Ethicon 2-0 Perma-hand silk tread	VWR	95056-992	Recomended brand.
26 ½  gage needle			Alternative suppliers exist.
1 mL BD slip-tip syringe, non-sterile	BD	301025	Alternative suppliers exist.
60 mL BD Luer-Lok syringe, non-sterile, polypropolene	BD	301035	Alternative suppliers exist.
Fluka Hematoxylin-Eosin	Sigma-Aldrich	3972	Alternative suppliers exist.
Türk's solution	Merck Millipore	109277
Table top centrifuge			Alternative manufacturers exist.
Cytospin 4 cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003	Alternative centrifuge can be used.
HEMA-3 stat pack	Fisher Scientific	23-123-869	Alternative staining kits exists.
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Alternative suppliers exist.