Un metodo per generare polmonare Neutrofilia Uso inalato Lipopolisaccaride

Summary

Descriviamo un metodo per indurre l'infiammazione polmonare neutrofila dalla sfida di lipopolysaccharide aerosol per nebulizzazione, per modellare danno polmonare acuto. Inoltre, sono anche descritti tecniche chirurgiche di base per l'isolamento del polmone, l'intubazione tracheale e lavaggio broncoalveolare.

Abstract

Danno polmonare acuto (ALI) è una grave malattia caratterizzata da neutrofilia alveolare, con opzioni di trattamento limitate e alta mortalità. Modelli sperimentali di ALI sono fondamentali nel migliorare la nostra comprensione della patogenesi della malattia. Lipopolisaccaride (LPS) derivato da batteri Gram-positivi induce infiammazione neutrofila delle vie aeree e del parenchima polmonare dei topi. Consegna polmonare efficiente di composti quali LPS è tuttavia difficile da raggiungere. Nell'approccio qui descritto, consegna polmonare nei topi si ottiene sfida di aerosol di Pseudomonas aeruginosa LPS. Disciolto LPS era aerosol da un nebulizzatore collegato ad aria compressa. I topi sono stati esposti a un flusso continuo di LPS aerosol in una scatola plexiglas per 10 minuti, seguito da 2 minuti condizionata, dopo l'aerosol è stato interrotto. L'intubazione tracheale e successivo lavaggio broncoalveolare, seguita da perfusione formalina è stata eseguita successiva, che consente caratterizzazione del p steriliinfiammazione ulmonary. Inalato LPS genera una infiammazione polmonare caratterizzata da neutrofilia alveolare, rilevata in lavaggio broncoalveolare e da una valutazione istologica. Questa tecnica può essere impostato ad un piccolo costo con pochi elettrodomestici, e richiede un minimo di formazione e competenza. Il sistema di esposizione può quindi essere eseguita di routine in qualsiasi laboratorio, con la possibilità di migliorare la nostra comprensione della patologia polmonare.

Introduction

Lipopolisaccaride (LPS) è un componente della parete cellulare di batteri gram negativi ^1. Sfida a LPS è un modello ben documentato di danno polmonare acuto, una sindrome caratterizzata da infiammazione neutrofila acuta e l'edema ^2. Inoltre, neutrofilia polmonare è anche un segno distintivo della broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) ^3, e LPS sfida negli esseri umani è stato utilizzato per modellare riacutizzazioni della BPCO ^4. Così, modelli sperimentali di esposizione LPS sono clinicamente rilevanti e preziosi strumenti per comprendere la patologia umana.

L'obiettivo della consegna polmonare di LPS aerosol qui descritte è quello di generare una risposta infiammatoria neutrofili nella conduzione e vie respiratorie, senza coinvolgimento sistemico. Diverse tecniche di LPS sfida sono stati descritti in precedenza. Iniezione intra-venosa di LPS è il percorso più comunemente usato di somministrazione. Sebbene questa tecnica è facilmente accessibile, tche danno primario è all'endotelio, distruzione secondaria dell'epitelio polmonare conseguente migrazione dei neutrofili al polmone. Somministrazione intra-venosa induce anche l'infiammazione sistemica ^2, che può complicare il quadro clinico in modelli animali. Infiammazione sistemica è in contrasto non osservati con la somministrazione intra-tracheale. Questa tecnica, tuttavia, è laborioso e richiede anestetici e notevole formazione ^{5, 6.} Inoltre, la deposizione polmonare da questa via di somministrazione dipende respirazione ^7. Così, la deposizione polmonare è influenzato dalla profondità dell'anestesia necessari per la somministrazione intra tracheale e la deposizione nelle vie aeree variabili possono essere osservate. Al contrario, la consegna polmonare con LPS aerosol richiede un addestramento minimo, e può essere facilmente realizzata su un gran numero di animali con poca o nessuna variazione tra individui ^{5, 8.}Un recente studio conferma che la consegna aerosol è superiore al percorso intra-tracheale in materia di deposito, e che dosi più rilevanti di LPS induce infiammazione neutrofila con questo modello ^8.

Studi precedenti hanno dimostrato che sfida per aereosol Psuedomonas aeruginosa LPS genera una risposta infiammatoria marcato nel lume delle vie aeree e del parenchima polmonare, inclusi gli spazi alveolari ^{9, 10.} L'infiammazione è caratterizzata da una predominanza di neutrofili e presenza di edema polmonare, e può quindi essere utilizzato per affrontare patogenesi del danno polmonare acuto e acquisire ulteriori conoscenze dei meccanismi che contribuiscono alla patologia malattia.

Protocol

Gli studi su animali sono state approvate dal comitato etico del benessere degli animali del nord di Stoccolma. Le procedure sperimentali sono state eseguite in conformità con il diritto svedese. 1. Creazione di un LPS Aerosol Sciogliere 0,5 g purificato P. aeruginosa LPS in 50 ml di soluzione fisiologica sterile e scuotendo con cautela e verificare la dissoluzione. Diluire 1 ml LPS disciolti in 9 ml salina sterile ad una concentrazione finale di 1 mg / ml. Proteggere da…

Representative Results

Sfida di aerosol P. aeruginosa LPS solito produce una risposta infiammatoria marcata nel lume delle vie aeree e lo spazio alveolare, caratterizzato da una predominanza di neutrofili in entrambi i punti temporali precoce e tardiva. Inalato LPS induce neutrofilia polmonare C57BL / 6BY e BALB / c topi sono stati esposti ad aerosol P. aeruginosa LPS o solo veicolo e neutrofili sono stati enumerati in BALF. Il numero totale di cellule in BALF di C57BL /…

Discussion

Inalato LPS genera una risposta infiammatoria nelle vie aeree, caratterizzata dai neutrofili nella sottomucosa epiteliale, spazi circostanti vie aeree di conduzione, nonché gli spazi alveolari. Questo è, unitamente alla maggiore contenuto proteico totale BALF, indicative di perdite plasma, rappresentativo della patologia del danno polmonare acuto. Come LPS induce una infiammazione sterili, la reazione è indipendente della risposta immunitaria adattativa, e ci sono limitazioni alla rilevanza alle infezioni batteriche….

Materials

Name of the material/equipment	Company	Catalog number	Comments/Description
Purified Pseudomonas aeruginosa LPS	Sigma-Aldrich		Harmful. Recomended purification. LPS purified from other bactria may be used.
Pari LC sprint star nebulizer	PARI Respiratory Equipment Inc.	023G1250
TSI mass flowmeter 4040	TSI	4040	Alternative product from supplier may be used.
Saint-Gobain 15.9 mm Tygon tube	Sigma-Aldrich	Z685704	Recomended brand.
Plexiglas boxes with removable lids	Custom built	N/A	150 x 163 x 205 mm (a 2 mm hole on the side).
3M Half Facepiece Reusable Respirator	3M	7503	Recomended brand.
3M Advanced Particulate Filters (P100)	3M	2291	Recomended brand.
Sissors	VWR	233-1104	Preferred scissors may be used.
Forceps	VWR	232-1313	Preferred forceps may be used.
Intramedic PE50 polyethylene tube	BD	427411	Recomended brand.
Ethicon 2-0 Perma-hand silk tread	VWR	95056-992	Recomended brand.
26 ½  gage needle			Alternative suppliers exist.
1 mL BD slip-tip syringe, non-sterile	BD	301025	Alternative suppliers exist.
60 mL BD Luer-Lok syringe, non-sterile, polypropolene	BD	301035	Alternative suppliers exist.
Fluka Hematoxylin-Eosin	Sigma-Aldrich	3972	Alternative suppliers exist.
Türk's solution	Merck Millipore	109277
Table top centrifuge			Alternative manufacturers exist.
Cytospin 4 cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003	Alternative centrifuge can be used.
HEMA-3 stat pack	Fisher Scientific	23-123-869	Alternative staining kits exists.
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Alternative suppliers exist.