Réalisé neurone dopaminergique différenciation de cellules pluripotentes humaines souches
Summary
We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson’s disease.
Abstract
Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson’s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.
Introduction
Dopaminergique (DA) des neurones peuvent être trouvés dans plusieurs régions du cerveau, y compris le mésencéphale, hypothalamus, la rétine et bulbes olfactifs. Les neurones DA A9 dans la substantia nigra pars compacta (SNpc) et un comportement de commande de mouvement en projetant dans le striatum du cerveau antérieur et formant le système moteur extrapyramidal. La dégénérescence des neurones DA A9 conduit à la maladie de Parkinson (PD), qui est la deuxième maladie neurodégénérative humaine la plus courante et actuellement incurable. la thérapie de remplacement cellulaire est l'une des stratégies les plus prometteuses pour le traitement de PD 1, par conséquent, il ya eu un grand intérêt pour dériver neurones A9 DA à partir de cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs), y compris les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et la cellules dernières anthropiques souches pluripotentes (hiPSCs).
Beaucoup de recherches ont tenté de tirer les neurones A9 DA de hPSCs en utilisant diverses méthodes. Les premiers rapports tous les neurones DA générés par un neuronalstade rosette progénitrices. En co-culture avec MS5 2 ou PA6 3-5 cellules stromales avec ou sans facteurs de croissance externe pour 2-4 semaines, L. Studer et collègues et trois autres groupes induits succès CSEh pour produire des rosettes de neurones. Ils ont ensuite enrichi ces rosettes par dissection mécanique ou digestion enzymatique pour une différenciation plus poussée. Dans d'autres rapports, les chercheurs ont généré des rosettes de neurones par corps embryoïdes (EB) la différenciation de culture 6-9 flottants. Par la suite, les chercheurs ont établi un procédé de différenciation de la monocouche à base de 10,11, où ils étalées cellules hES et hiPSCs sur la matrice extra-cellulaire, ajouter différents facteurs de croissance dans la culture pour induire la différenciation de hPSCs de neurones dopaminergiques, qui imite l'vivo DA embryonnaire du développement dans des neurones . Bien que toutes ces études obtenus tyrosine hydroxylase (TH) cellules exprimant certaines caractéristiques des neurones dopaminergiques, le processus de différenciation ensemble est temps et de travail consommant,généralement inefficaces, et plus important encore, l'identité A9 de ces neurones n'ont pas été démontrée dans la plupart des études, sauf celle avec Lmx1a expression ectopique 12. Récemment, une nouvelle plaque de plancher (FP) du protocole à base a été développé 13-16, dans lequel les précurseurs de PF avec DA potentiel de neurone ont d'abord été générés par l'activation de la sonic hedgehog et canoniques voies de signalisation Wnt au cours de la phase précoce de la différenciation, puis ces cellules PF ont été précisées pour les neurones dopaminergiques. Bien que ce protocole est plus efficace, il ya encore quelques problèmes; par exemple, l'ensemble du processus de différenciation prend beaucoup de temps (au moins 35 jours) et de cellules nourricières est dépendante 15, ou EB est dépendante de l'identité ou de 16 A9 14 n'a pas été démontrée.
Ici, sur la base de la connaissance de in vivo développement embryonnaire DA neurone et les résultats publiés d'autres chercheurs de, nous avons optimisé les conditions de culture pour l'effgénération isant des neurones dopaminergiques de deux CSEh et hiPSCs. Nous avons généré des cellules précurseurs première FP par l'activation de la signalisation Wnt canonique avec une petite molécule et CHIR99021 signalisation Sonic Hedgehog avec de petites molécules et purmorphamine SAG. Ces cellules expriment PF FOXA2, Lmx1a, CORIN, OTX2 et nestine. Nous avons ensuite précisé ces cellules PF à neurones dopaminergiques avec des facteurs de croissance, y compris BDNF, GDNF, etc. Les neurones dopaminergiques sont générés de A9 type de cellule car ils sont positifs pour GIRK2 tout négatif pour Calbindin 17. Ce protocole est une cellule d'alimentation ou EB indépendante, hautement efficace et reproductible. En utilisant ce protocole, on peut dériver neurones DA en moins de 4 semaines à partir de CSEh ou hiPSCs des personnes normales pour l'étude de la transplantation de cellules, ou de hiPSCs de patients parkinsoniens pour la modélisation in vitro de PD ou de tester des agents thérapeutiques potentiels pour PD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les cellules souches pluripotentes humaines (y compris les cellules hES hiPSCs) et peuvent être différenciées in vitro afin de générer la plupart, sinon tous, les types de notre corps, y compris les neurones dopaminergiques, qui a été démontré dans des études précédentes 19 cellules. Ici, basée sur la connaissance de dopaminergique développement embryonnaire des neurones 20 et protocoles publiés par les autres laboratoires 14,15, nous avons optimisé les condition…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank members of the Renee Reijo Pera laboratory for help during development of this protocol and during preparation of this manuscript. This work is supported by California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) shared laboratory (CL-00518).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM | Life Technologies | 10569-010 | |
| FBS | Life Technologies | 26140 | |
| penicillin/ampicillin | Life Technologies | 15140-122 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| KSR | Life Technologies | 10828-028 | |
| Non-essential amino acid | Life Technologies | 11140-050 | |
| b-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| mTesR1 | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | 17104-019 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Growth factor reduced matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Accutase | MP Biomedicals | 1000449 | |
| Thiazovivin | Santa Cruz Biotechnology | sc-361380 | |
| SB431542 | Tocris Bioscience | 1614 | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SAG | EMD Millipore | 566660-1MG | |
| Purmorphamine | Santa Cruz Biotechnology | sc-202785 | |
| FGF8b | R&D Systems | 423-F8-025 | |
| CHIR99021 | Cellagen Technology | C2447-2s | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010 | |
| TGF-beta3 | R&D Systems | 243-B3-002 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Mouse anti human NESTIN antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | 1/1000 dilution |
| Rabbit anti human OTX2 antibody | Millipore | AB9566 | 1/2000 dilutiion |
| Goat anti human FOXA2 antibody | R&D Systems | AF2400 | 1/200 dilution |
| rabbit anti human LMX1a antibody | Millipore | AB10533 | 1/1000 dilution |
| Rabbit anti human TH antibody | Pel Freez | P40101 | 1/500 dilution |
| Chicken anti human TH antibody | Millipore | AB9702 | 1/500 dilution |
| Mouse anti human TUJ1 antibody | Covance | MMS-435P | 1/2000 dilution |
| Rabbit anti human GIRK2 antibody | Abcam | ab30738 | 1/300 dilution |
| Rabbit anti human Calbindin antibody | Abcam | ab25085 | 1/400 dilution |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 |
Referências
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