Regia neuroni dopaminergici differenziazione da cellule staminali pluripotenti umane
Summary
We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson’s disease.
Abstract
Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson’s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.
Introduction
Dopaminergica (DA), i neuroni possono essere trovati in diverse regioni del cervello, tra cui il mesencefalo, l'ipotalamo, retina, e bulbi olfattivi. I neuroni A9 DA nella pars compacta della substantia nigra (SNPC) comportamento di controllo e il movimento proiettando alla striato nel proencefalo e formare il sistema motorio extrapiramidale. La degenerazione dei neuroni A9 DA conduce alla malattia di Parkinson (PD), che è la seconda malattia neurodegenerativa umana più comune e attualmente incurabile. Terapia di sostituzione cellulare è una delle strategie più promettenti per il trattamento della malattia di Parkinson 1, quindi, c'è stato un grande interesse derivante neuroni A9 DA da cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs), includendo sia le cellule staminali embrionali umane (hESC) e il recenti cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSCs).
Molta ricerca ha cercato di ricavare neuroni A9 DA da hPSCs utilizzando vari metodi. Le prime relazioni di tutti i neuroni DA generati attraverso una neuralefase progenitore rosetta. In co-coltura con MS5 2 o PA6 3-5 cellule stromali con o senza fattori di crescita esterna per 2-4 settimane, L. Studer e colleghi e di altri tre gruppi indotte con successo hESC per produrre rosette neurali. Hanno poi arricchito queste rosette di dissezione meccanica o digestione enzimatica per un'ulteriore differenziazione. In altri rapporti, i ricercatori hanno generato rosette neurali attraverso il corpo embrioide (EB) galleggianti cultura differenziazione 6-9. In seguito, i ricercatori hanno stabilito un monostrato basato metodo differenziazione 10,11, dove si placcati hESC e hiPSCs sulla matrice extracellulare, aggiunti diversi fattori di crescita nella cultura di indurre la differenziazione di hPSCs di neuroni DA, che imita il vivo DA sviluppo embrionale dei neuroni de . Anche se tutti questi studi ottenuti tirosina idrossilasi (TH) cellule esprimente con alcune caratteristiche di neuroni DA, l'intero processo di differenziazione è il tempo e il lavoro consumo,generalmente inefficiente, e, soprattutto, l'identità A9 di questi neuroni non sono state dimostrate nella maggior parte degli studi, eccetto quella con Lmx1a espressione ectopica 12. Recentemente, un piatto nuovo piano (FP) basata su protocollo è stato sviluppato 13-16, in cui i precursori FP con DA potenziale del neurone sono stati generati dall'attivazione del riccio Sonic e canoniche vie di segnalazione Wnt durante la fase iniziale della differenziazione, e quindi queste cellule FP sono stati ulteriormente specificati per neuroni DA. Anche se questo protocollo è più efficiente, ci sono ancora alcuni problemi; per esempio, l'intero processo di differenziazione richiede molto tempo (almeno 35 giorni) ed è dipendente cella alimentatore 15, o è dipendente EB 16 o l'identità A9 non è stato dimostrato 14.
Qui, sulla base delle conoscenze di sviluppo embrionale in vivo DA neurone e risultati pubblicati di altri ricercatori, abbiamo ottimizzato le condizioni di coltura per l'effgenerazione icient di DA neuroni da entrambi hESC e hiPSCs. In primo luogo abbiamo generato cellule FP precursori dalla attivazione del segnale Wnt canonica con piccola molecola CHIR99021 e sonic hedgehog segnalazione con piccole molecole SAG e purmorphamine. Queste cellule esprimono FP Foxa2, Lmx1a, CORIN, OTX2 e nestina. Abbiamo poi specificato queste cellule FP a neuroni DA con fattori di crescita, tra cui BDNF, GDNF, ecc. I neuroni DA generati sono di tipo cellulare A9 come sono positivi per GIRK2 mentre negativo per calbindin 17. Questo protocollo è cella alimentatore o EB indipendente, altamente efficiente e riproducibile. Usando questo protocollo, si può ricavare neuroni DA in meno di 4 settimane dalla hESC o hiPSCs di persone normali per lo studio trapianto di cellule, o da hiPSCs di pazienti PD per la modellazione in vitro di PD o testare potenziali agenti terapeutici per il PD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le cellule staminali pluripotenti umane (inclusi sia hESC e hiPSCs) possono essere differenziate in vitro per generare la maggior parte, se non tutti, i tipi di cellule del nostro corpo tra cui neuroni DA, che è stata dimostrata in studi precedenti 19. Qui, sulla base delle conoscenze da dopaminergici embrionale neurone sviluppo 20 e protocolli pubblicati da altri laboratori 14,15, abbiamo ottimizzato le condizioni di coltura per la generazione di neuroni DA provenienti da hESC…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank members of the Renee Reijo Pera laboratory for help during development of this protocol and during preparation of this manuscript. This work is supported by California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) shared laboratory (CL-00518).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM | Life Technologies | 10569-010 | |
| FBS | Life Technologies | 26140 | |
| penicillin/ampicillin | Life Technologies | 15140-122 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| KSR | Life Technologies | 10828-028 | |
| Non-essential amino acid | Life Technologies | 11140-050 | |
| b-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| mTesR1 | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | 17104-019 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Growth factor reduced matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Accutase | MP Biomedicals | 1000449 | |
| Thiazovivin | Santa Cruz Biotechnology | sc-361380 | |
| SB431542 | Tocris Bioscience | 1614 | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SAG | EMD Millipore | 566660-1MG | |
| Purmorphamine | Santa Cruz Biotechnology | sc-202785 | |
| FGF8b | R&D Systems | 423-F8-025 | |
| CHIR99021 | Cellagen Technology | C2447-2s | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010 | |
| TGF-beta3 | R&D Systems | 243-B3-002 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Mouse anti human NESTIN antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | 1/1000 dilution |
| Rabbit anti human OTX2 antibody | Millipore | AB9566 | 1/2000 dilutiion |
| Goat anti human FOXA2 antibody | R&D Systems | AF2400 | 1/200 dilution |
| rabbit anti human LMX1a antibody | Millipore | AB10533 | 1/1000 dilution |
| Rabbit anti human TH antibody | Pel Freez | P40101 | 1/500 dilution |
| Chicken anti human TH antibody | Millipore | AB9702 | 1/500 dilution |
| Mouse anti human TUJ1 antibody | Covance | MMS-435P | 1/2000 dilution |
| Rabbit anti human GIRK2 antibody | Abcam | ab30738 | 1/300 dilution |
| Rabbit anti human Calbindin antibody | Abcam | ab25085 | 1/400 dilution |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 |
Referências
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