Dirigido neurônios dopaminérgicos Diferenciação de Células-Tronco pluripotentes humanas
Summary
We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson’s disease.
Abstract
Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson’s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.
Introduction
Dopaminérgico (DA) neurônios pode ser encontrada em várias regiões do cérebro, incluindo o mesencéfalo, hipotálamo, retina, e bulbos olfatórios. Os neurônios A9 DA na substância negra pars compacta (SNPC) comportamento de controle e movimento, projetando para o estriado na parte frontal do cérebro e formando o sistema motor extrapiramidal. A degeneração de neurónios DA A9 leva à doença de Parkinson (PD), que é a segunda doença neurodegenerativa mais comum e humano actualmente incurável. A terapia de substituição de células é uma das mais promissoras para o tratamento da DP 1, por conseguinte, tem havido um grande interesse na determinação neurónios A9 DA a partir de células estaminais pluripotentes humanas (hPSCs), incluindo ambas as células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e o células humanas recentes tronco pluripotentes induzidas (hiPSCs).
Muitas pesquisas têm tentado obter neurônios A9 DA de hPSCs usando vários métodos. Os primeiros relatórios de todos os neurônios DA gerados através de uma neuralroseta estágio progenitor. Por co-cultura com MS5 2 ou PA6 3-5 células estromais com ou sem fatores de crescimento externo para 2-4 semanas, L. Studer e colegas e três outros grupos induzidos com sucesso hESCs para produzir rosetas neurais. Eles, então, enriquecido essas rosetas por dissecção mecânica ou digestão enzimática para uma maior diferenciação. Em outros relatos, os pesquisadores geraram rosetas neurais através do corpo embrióide (EB) flutuantes cultura diferenciação 6-9. Mais tarde, os investigadores estabeleceram um método de diferenciação de monocamada com base 10,11, onde banhado hESCs e hiPSCs na matriz extra-celular, adicionou diferentes factores de crescimento em cultura para induzir a diferenciação de hPSCs de neurónios DA, que imita o in vivo DA desenvolvimento embrionário neurónio . Apesar de todos estes estudos obtidos tirosina hidroxilase (TH) células -expressing com algumas características de neurônios DA, todo o processo de diferenciação é o tempo e trabalho consumindo,geralmente ineficiente, e mais importante ainda, a identidade A9 destes neurónios não foram demonstradas na maioria dos estudos, com excepção de um com Lmx1a expressão ectópica 12. Recentemente, uma placa de novo piso (FP) protocolo baseada foi desenvolvido 13-16, em que os precursores PF com DA potencial neurônio foram gerados primeiro pela ativação do sonic hedgehog e canônicas vias de sinalização Wnt durante a fase inicial de diferenciação, e, em seguida, essas células FP foram melhor especificados para os neurônios de DA. Apesar de este protocolo é mais eficiente, ainda existem alguns problemas; por exemplo, todo o processo de diferenciação leva muito tempo (pelo menos 35 dias) e é dependente de células alimentador 15, ou seja 16 ou EB dependente da identidade A9 não foi demonstrada 14.
Aqui, a partir do conhecimento do desenvolvimento in vivo DA neurônio embrionário e os resultados publicados por outros pesquisadores, nós otimizamos as condições de cultivo para o FEPgeração icient de neurônios DA de ambos os hESCs e hiPSCs. Nós primeiro gerado células precursoras FP pela ativação da via de sinalização Wnt canônica com pequena molécula CHIR99021 e sonic hedgehog sinalização com pequenas moléculas SAG e purmorphamine. Estas células FP expressar Foxa2, Lmx1a, CORIN, OTX2 e nestin. Em seguida, essas células especificado PF para neurônios DA com fatores de crescimento, incluindo BDNF, GDNF, etc. Os neurônios DA gerados são do tipo de célula A9 como eles são positivos para GIRK2 enquanto negativo para calbindina 17. Este protocolo é de células de alimentação ou EB independente, altamente eficiente e reprodutível. Usando este protocolo, pode-se derivar neurônios DA em menos de 4 semanas a partir de hESCs ou hiPSCs de pessoas normais para estudo transplante de células, ou de hiPSCs de pacientes com DP para in vitro modelagem de PD ou testar agentes terapêuticos potenciais para a DP.
Protocol
Representative Results
Discussion
As células estaminais pluripotentes humanas (incluindo ambos os hESCs e hiPSCs) podem ser diferenciadas in vitro para gerar a maioria, se não todos, os tipos de células do nosso corpo, incluindo neurónios DA, o que foi demonstrado em estudos anteriores 19. Aqui, com base no conhecimento do desenvolvimento embrionário neurônio dopaminérgico 20 e protocolos publicados a partir de outros laboratórios 14,15, otimizamos as condições de cultura para a geração de neurônios…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank members of the Renee Reijo Pera laboratory for help during development of this protocol and during preparation of this manuscript. This work is supported by California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) shared laboratory (CL-00518).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM | Life Technologies | 10569-010 | |
| FBS | Life Technologies | 26140 | |
| penicillin/ampicillin | Life Technologies | 15140-122 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| KSR | Life Technologies | 10828-028 | |
| Non-essential amino acid | Life Technologies | 11140-050 | |
| b-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| mTesR1 | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | 17104-019 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Growth factor reduced matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Accutase | MP Biomedicals | 1000449 | |
| Thiazovivin | Santa Cruz Biotechnology | sc-361380 | |
| SB431542 | Tocris Bioscience | 1614 | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SAG | EMD Millipore | 566660-1MG | |
| Purmorphamine | Santa Cruz Biotechnology | sc-202785 | |
| FGF8b | R&D Systems | 423-F8-025 | |
| CHIR99021 | Cellagen Technology | C2447-2s | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010 | |
| TGF-beta3 | R&D Systems | 243-B3-002 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Mouse anti human NESTIN antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | 1/1000 dilution |
| Rabbit anti human OTX2 antibody | Millipore | AB9566 | 1/2000 dilutiion |
| Goat anti human FOXA2 antibody | R&D Systems | AF2400 | 1/200 dilution |
| rabbit anti human LMX1a antibody | Millipore | AB10533 | 1/1000 dilution |
| Rabbit anti human TH antibody | Pel Freez | P40101 | 1/500 dilution |
| Chicken anti human TH antibody | Millipore | AB9702 | 1/500 dilution |
| Mouse anti human TUJ1 antibody | Covance | MMS-435P | 1/2000 dilution |
| Rabbit anti human GIRK2 antibody | Abcam | ab30738 | 1/300 dilution |
| Rabbit anti human Calbindin antibody | Abcam | ab25085 | 1/400 dilution |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 |
Referências
- Freed, C. R. Will embryonic stem cells be a useful source of dopamine neurons for transplant into patients with Parkinson’s disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 1755-1757 (2002).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 12543-12548 (2004).
- Park, C. H., et al. In vitro and in vivo analyses of human embryonic stem cell-derived dopamine neurons. Journal of Neurochemistry. 92, 1265-1276 (2005).
- Buytaert-Hoefen, K. A., Alvarez, E., Freed, C. R. Generation of tyrosine hydroxylase positive neurons from human embryonic stem cells after coculture with cellular substrates and exposure to GDNF. Stem Cells. 22, 669-674 (2004).
- Zeng, X., et al. Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells. 22, 925-940 (2004).
- Yan, Y., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
- Schulz, T. C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to dopaminergic neurons in serum-free suspension culture. Stem Cells. 22, 1218-1238 (2004).
- Park, S., et al. Generation of dopaminergic neurons in vitro from human embryonic stem cells treated with neurotrophic factors. Neuroscience Letters. 359, 99-103 (2004).
- Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3392-3397 (2008).
- Cooper, O., et al. Differentiation of human ES and Parkinson’s disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid. Molecular and Cellular Neurosciences. 45, 258-266 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27, 275-280 (2009).
- Sanchez-Danes, A., et al. Efficient generation of A9 midbrain dopaminergic neurons by lentiviral delivery of LMX1A in human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Human Gene Therapy. 23, 56-69 (2012).
- Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6, 336-347 (2010).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
- Xi, J., et al. Specification of midbrain dopamine neurons from primate pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 1655-1663 (2012).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1, 703-714 (2012).
- Mendez, I., et al. Cell type analysis of functional fetal dopamine cell suspension transplants in the striatum and substantia nigra of patients with Parkinson’s disease. Brain: a Journal of Neurology. 128, 1498-1510 (2005).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Nishimura, K., Takahashi, J. Therapeutic application of stem cell technology toward the treatment of Parkinson’s disease. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 171-175 (2013).
- Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nature Reviews. Neuroscience. 8, 21-32 (2007).
- Wang, G., et al. Noggin and bFGF cooperate to maintain the pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 330, 934-942 (2005).
- Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14071-14076 (2002).
