Riktad dopaminerga nerv Differentiering från Human pluripotenta stamceller
Summary
We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson’s disease.
Abstract
Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson’s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.
Introduction
Dopaminerga (DA) nervceller kan hittas i flera delar av hjärnan, inklusive mellanhjärnan, hypotalamus, näthinnan, och luktsinnet glödlampor. De A9 DA nervceller i substantia nigra pars compacta (SNPC) kontrollbeteende och rörelse genom att projicera till striatum i framhjärnan och bildar det extrapyramidala motoriska systemet. Degeneration av A9 DA nervceller leder till Parkinsons sjukdom (PD), som är den näst vanligaste mänskliga neurodegenerativa sjukdomar och idag obotliga. Cell substitutionsbehandling är en av de mest lovande strategier för behandling av PD 1, därför har det funnits ett stort intresse för att härleda A9 DA nervceller från humana pluripotenta stamceller (hPSCs), inklusive både mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och senaste mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs).
Mycket forskning har försökt att härleda A9 DA nervceller från hPSCs med olika metoder. De tidigaste rapporterna alla genererade DA nervceller genom ett neuraltrosett progenitor skede. Genom samodling med MS5 2 eller PA6 3-5 stromaceller med eller utan externa tillväxtfaktorer för 2-4 veckor, L. Studer och kollegor och tre andra grupper framgångsrikt inducerade hESCs att producera neurala rosetter. De berikade då dessa rosetter genom mekanisk dissektion eller enzymatisk nedbrytning för ytterligare differentiering. I andra rapporter, forskare genererade neurala rosetter genom embryoid kropp (EB) flytande kultur differentiering 6-9. Senare etablerade forskare ett monolager baserad differentiering metod 10,11, där de pläterade hESCs och hiPSCs på extracellulär matrix, tillade olika tillväxtfaktorer i kulturen att inducera differentiering av hPSCs till DA-neuroner, som härmar in vivo embryonala DA neuron utveckling . Även om alla dessa studier erhölls tyrosinhydroxylas (TH) -uttryckande celler med vissa egenskaper DA nervceller, är hela differentieringsprocessen tid och arbetskraft krävande,allmänhet ineffektiva, och ännu viktigare, var A9 vilka dessa nervceller inte visat i de flesta studier utom en med Lmx1a ektopisk uttryck 12. Nyligen har en ny golvplatta (FP) baserad protokoll som utvecklats 13-16, där FP prekursorer med DA neuron potential först genereras genom aktivering av Sonic Hedgehog och kanoniska Wnt signaleringsvägar under det tidiga stadiet av differentiering, och sedan Dessa FP celler specificeras ytterligare till DA nervceller. Även om detta protokoll är mer effektiva, finns det fortfarande vissa problem; till exempel, tar hela differentieringsprocessen lång tid (minst 35 dagar) och är matarcellsberoende 15, eller är EB beroende 16 eller A9 identiteten inte visat 14.
Här, på grundval av kunskap från in vivo embryonal DA neuron utveckling och andra forskares publicerade resultat har vi optimerat odlingsbetingelsema för efficient generation av DA-neuroner från både hESCs och hiPSCs. Vi genererade först FP prekursorceller genom aktivering av den kanoniska Wnt signaler med småmolekylära CHIR99021 och Sonic Hedgehog-signalering med små molekyler SAG och purmorphamine. Dessa FP celler uttrycker FOXA2, Lmx1a, CORIN, OTX2 och nestin. Vi sedan specificerat dessa FP celler till DA neuron med tillväxtfaktorer inklusive BDNF, GDNF, osv. De genererade DA nervceller är av A9 celltyp som de är positiva för GIRK2 medan negativ för Calbindin 17. Detta protokoll är matarcell eller EB oberoende, effektiv och reproducerbar. Med hjälp av detta protokoll, kan man härleda DA nervceller i mindre än 4 veckor från hESCs eller hiPSCs normala personer för celltransplantation studie eller från hiPSCs av PD-patienter för in vitro-modellering av PD eller testa potentiella terapeutiska medel för PD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Humant pluripotenta stamceller (inklusive både hESCs och hiPSCs) kan differentieras in vitro för att generera de flesta, om inte alla, celltyper av vår kropp inklusive DA-neuroner, vilket har visats i tidigare studier 19. Här, baserade på kunskap från embryonala dopaminerga neuron utveckling 20 och publicerade protokoll från andra laboratorier 14,15, vi optimerat odlingsbetingelsema för generering av DA nervceller från hESCs och hiPSCs. Detta protokoll är effektiv, rep…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank members of the Renee Reijo Pera laboratory for help during development of this protocol and during preparation of this manuscript. This work is supported by California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) shared laboratory (CL-00518).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM | Life Technologies | 10569-010 | |
| FBS | Life Technologies | 26140 | |
| penicillin/ampicillin | Life Technologies | 15140-122 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| KSR | Life Technologies | 10828-028 | |
| Non-essential amino acid | Life Technologies | 11140-050 | |
| b-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| mTesR1 | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | 17104-019 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Growth factor reduced matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Accutase | MP Biomedicals | 1000449 | |
| Thiazovivin | Santa Cruz Biotechnology | sc-361380 | |
| SB431542 | Tocris Bioscience | 1614 | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SAG | EMD Millipore | 566660-1MG | |
| Purmorphamine | Santa Cruz Biotechnology | sc-202785 | |
| FGF8b | R&D Systems | 423-F8-025 | |
| CHIR99021 | Cellagen Technology | C2447-2s | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010 | |
| TGF-beta3 | R&D Systems | 243-B3-002 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Mouse anti human NESTIN antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | 1/1000 dilution |
| Rabbit anti human OTX2 antibody | Millipore | AB9566 | 1/2000 dilutiion |
| Goat anti human FOXA2 antibody | R&D Systems | AF2400 | 1/200 dilution |
| rabbit anti human LMX1a antibody | Millipore | AB10533 | 1/1000 dilution |
| Rabbit anti human TH antibody | Pel Freez | P40101 | 1/500 dilution |
| Chicken anti human TH antibody | Millipore | AB9702 | 1/500 dilution |
| Mouse anti human TUJ1 antibody | Covance | MMS-435P | 1/2000 dilution |
| Rabbit anti human GIRK2 antibody | Abcam | ab30738 | 1/300 dilution |
| Rabbit anti human Calbindin antibody | Abcam | ab25085 | 1/400 dilution |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 |
Referências
- Freed, C. R. Will embryonic stem cells be a useful source of dopamine neurons for transplant into patients with Parkinson’s disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 1755-1757 (2002).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 12543-12548 (2004).
- Park, C. H., et al. In vitro and in vivo analyses of human embryonic stem cell-derived dopamine neurons. Journal of Neurochemistry. 92, 1265-1276 (2005).
- Buytaert-Hoefen, K. A., Alvarez, E., Freed, C. R. Generation of tyrosine hydroxylase positive neurons from human embryonic stem cells after coculture with cellular substrates and exposure to GDNF. Stem Cells. 22, 669-674 (2004).
- Zeng, X., et al. Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells. 22, 925-940 (2004).
- Yan, Y., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
- Schulz, T. C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to dopaminergic neurons in serum-free suspension culture. Stem Cells. 22, 1218-1238 (2004).
- Park, S., et al. Generation of dopaminergic neurons in vitro from human embryonic stem cells treated with neurotrophic factors. Neuroscience Letters. 359, 99-103 (2004).
- Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3392-3397 (2008).
- Cooper, O., et al. Differentiation of human ES and Parkinson’s disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid. Molecular and Cellular Neurosciences. 45, 258-266 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27, 275-280 (2009).
- Sanchez-Danes, A., et al. Efficient generation of A9 midbrain dopaminergic neurons by lentiviral delivery of LMX1A in human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Human Gene Therapy. 23, 56-69 (2012).
- Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6, 336-347 (2010).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
- Xi, J., et al. Specification of midbrain dopamine neurons from primate pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 1655-1663 (2012).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1, 703-714 (2012).
- Mendez, I., et al. Cell type analysis of functional fetal dopamine cell suspension transplants in the striatum and substantia nigra of patients with Parkinson’s disease. Brain: a Journal of Neurology. 128, 1498-1510 (2005).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Nishimura, K., Takahashi, J. Therapeutic application of stem cell technology toward the treatment of Parkinson’s disease. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 171-175 (2013).
- Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nature Reviews. Neuroscience. 8, 21-32 (2007).
- Wang, G., et al. Noggin and bFGF cooperate to maintain the pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 330, 934-942 (2005).
- Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14071-14076 (2002).
