Einem mikrofluidischen Biochip-basierte Elektrochemische für Markierungsfreie DNA-Hybridisierungsanalyse
Summary
Wir präsentieren einen mikrofluidischen Biochip-basierten elektrochemischen DNA-Hybridisierung für Erkennung. Folgende ssDNA-Sonde Funktionalisierung werden die Spezifität, Empfindlichkeit und Nachweisgrenze mit komplementären und nicht-komplementären ssDNA Ziele untersucht. Ergebnisse veranschaulichen den Einfluss der DNA-Hybridisierungsereignisse auf dem elektrochemischen System, mit einer Nachweisgrenze von 3,8 nM.
Abstract
Miniaturisierung von analytischen Laborbedingungen in den Mikromaßstab bietet erhebliche Vorteile in Bezug auf die Reaktionszeit, der Kosten und der Integration von Vorverarbeitungsschritte. Verwendung dieser Vorrichtungen zur Analyse von DNA-Hybridisierungsereignisse ist wichtig, weil es eine Technologie zur Echtzeit-Beurteilung von Biomarkern am Point-of-Care für verschiedene Krankheiten. Wenn die Vorrichtung Grundfläche verringert jedoch die Dominanz der verschiedenen physikalischen Erscheinungen zu. Diese Phänomene beeinflussen die Fertigungsgenauigkeit und Betriebssicherheit der Vorrichtung. Daher besteht ein großer Bedarf zur genauen Herstellung und Betrieb dieser Geräte in einer reproduzierbaren Weise, um die Gesamtleistung zu verbessern. Hier beschreiben wir die Protokolle und die für die Herstellung und den Betrieb eines Mikrofluidbasis elektro Biochips für die genaue Analyse von DNA-Hybridisierungsereignissen Methoden. Der Biochip besteht aus zwei Teilen: einem Mikrofluid-Chip mitdrei parallele Mikrokanäle aus Polydimethylsiloxan (PDMS) hergestellt, und ein 3 x 3 Feld aus elektrochemischen Mikrochip. Die DNA-Hybridisierungsereignisse werden durch elektrochemische Impedanzspektroskopie (EIS)-Analyse nachgewiesen. Die EIS-Analyse ermöglicht die Überwachung Variationen der Eigenschaften des elektrochemischen Systems, das dominant in diesen Längenskalen sind. Mit der Fähigkeit, Änderungen sowohl Ladungstransfer und Diffusionswiderstand mit dem Biosensor zu überwachen, die Selektivität für komplementäre ssDNA Ziele, eine berechnete Nachweisgrenze von 3,8 nm und eine 13% Kreuzreaktivität mit anderen, nicht-komplementäre ssDNA folgenden 20 min zeigen wir, Inkubation. Diese Methode kann die Leistung von miniaturisierten Geräten durch die Aufklärung über das Verhalten der Diffusion auf der Mikroskala Regime und durch Aktivieren der Untersuchung von DNA-Hybridisierungsereignissen zu verbessern.
Introduction
Mikrofluidischen Lab-on-a-Chip (LOC)-Geräte bieten zahlreiche Vorteile in der klinischen Diagnostik, der Umweltüberwachung und der biomedizinischen Forschung. Diese Vorrichtungen verwenden mikrofluidische Kanäle, um eine Fluidströmung zu Bereichen des Chips, wo eine Vielzahl von Verfahren, einschließlich Mischen Reagens, bezogen Affinität bindende, Signaltransduktion und der Zellkulti 1-4 erfolgen steuern. Mikrofluidik bietet viele Vorteile gegenüber herkömmlichen klinischen Diagnosewerkzeuge wie Mikrotiterplatte Leser oder Elektrophorese-Gel-Shift-Assays. Mikrofluidik-Vorrichtungen erfordern 2 bis 3 Grßenordnungen (Nanolitern, im Gegensatz zu Mikroliter) weniger Reagenzien ähnliche Tests durchzuführen. Auch können diese Geräte die Geschwindigkeit, mit der einige biologische Ereignisse aufgrund der kleineren Haft der Arten innerhalb der Kanäle 5,6 zu erhöhen. Drittens können Sensoren in Mikrofluidikeinheiten mittels Lithographie und Ätzverfahren, die markierungsfreie Erken bieten können integriert werdenn. Schließlich sind diese Vorrichtungen kostengünstig in der Herstellung und erfordern wenig Aufwand seitens des Technikers zu bedienen 7-10.
Markierungsfreien Detektion wird typischerweise unter Verwendung eines optischen oder elektrischen Wandlers. Optische Vorrichtungen besser Sensorleistung aufgrund der geringeren Beeinträchtigung Analyten in der Probe vorliegt. Dennoch ist ihre Leistung in Fällen, in denen die Proben Hintergrund die gleiche Resonanzwellenlänge als Sensor 11 beeinträchtigt werden. Es gibt viele Vorteile bei der Verwendung von elektrischen Signalen, um biologische und chemische Nachweis in mikrofluidischen Systemen durchzuführen. Die Herstellung von sich aus weniger kompliziert, da diese Sensoren in der Regel nur erforderlich strukturierten Elektroden zu bedienen. Zusätzlich können elektrische Signale direkt mit den meisten Messvorrichtung verbunden werden, während eine andere Signal Modalitäten kann ein Wandler erforderlich, um das Signal umzuwandeln 12-15. Elektrische Sensoren häufig Veränderungen in impedanc messenE 16,17, Kapazität 18, 19 oder Redox-Aktivität. Allerdings werden vor neue Herausforderungen gestellt, wie diese Systeme miniaturisiert werden. Die wichtigsten Herausforderungen zu meistern sind: Probenvorbereitung und Mischen von Flüssigkeiten (aufgrund der geringen Probenvolumen und Reynolds-Zahl), physikalische und chemische Effekte (einschließlich Kapillarkräfte, Oberflächenrauhigkeit, chemische Wechselwirkungen zwischen Baumaterialien und Analyten), niedrige signal Rausch-Verhältnis 20-23 und mögliche Interferenz von elektroaktiven Analyten in komplexen biologischen Proben (zB Blut und Speichel) (durch die verringerte Oberfläche und Volumen) gemessen. Weitere Untersuchungen dieser Effekte wird Richtlinien für eine genaue Fertigung und des Betriebs dieser Geräte in einer reproduzierbaren Art und Weise, auf die Gesamtleistung verbessern würde.
DNA-Hybridisierungsdetektion wird weitgehend verwendet, um genetische Erkrankungen 24,25 und verschiedene Formen von Canc diagnostizierenER 26. Jedes Jahr werden mehrere Stämme der Influenza bei Patienten, die Ergebnisse von DNA-Hybridisierungstechniken 27 identifiziert. Das Influenza-Virus allein entfallen 36.000 Todesfälle pro Jahr in den Vereinigten Staaten 28. Solche Beispiele könnten von einer Tisch-Mikrofluid-Vorrichtung, die die gleichen Testverfahren wie einem Plattenleser oder ein Gel-Shift-Assay mit geringen Probenvolumen und zu einem Bruchteil der Kosten, ohne die Empfindlichkeit oder Spezifität führen kann profitieren. Aufgrund der vielen Vorteile der markierungsfreien elektrochemischen Sensor, es wurde ausgiebig für den Nachweis von DNA-Hybridisierungsereignissen 29,30 verwendet. Ein Setup, wo Makro-Skala Elektroden (im Millimeterbereich) in Bechergläser mit der Lösung von Interesse getaucht werden können, verwendet werden, um sehr sensible Daten über die Bindung Kinetik von Einzelstrang-DNA-Sequenzen auf ihre passenden komplementären Sequenzen liefern. Kürzlich gab es ein paar Fortschritte bei der Einbeziehung elektrochemischen Mess in MICRofluidics für die DNA-Hybridisierung. Es wurden Studien durchgeführt über Hybridisierungskinetik 31 und Integration von Sensoren für die Erkennung 15 in mikrofluidischen Kanälen. Allerdings gibt es immer noch einen Bedarf für eine schnelle Hochdurchsatz-Mikrofluid-Gerät, das DNA-Hybridisierungsereignisse parallel analysieren kann, ohne komplizierte Probenvorbereitungsschritte.
Die in dieser Arbeit vorgestellten Vorrichtung ist eine Plattform, die mehrere Wechselwirkungen, die parallel und ohne aufwendige Probenvorbereitungsschritte durchmustert werden können. Unser Protokoll zeigt, wie Mikrofluidik-basierten elektrochemische Biochips sind mit mikroelektromechanische Systeme (MEMS)-Technologie 32,33 mikrofabriziert. Wir beschreiben den Herstellungsprozeß sowohl des mikrofluidischen Chips von Polydimethylsiloxan (PDMS) und die elektrochemische Chip, der eine Anordnung von Elektroden umfasst. Die chemische Funktionalisierung des Biochips mit ssDNA-Sonden wird ebenfalls angesprochen. Schließlich wird die Abilkeit des Biosensors speziell zu erkennen und zu analysieren, ssDNA Ziele demonstriert. Insgesamt ist die mikrofluidische Basis elektro Biochip eine schnelle und hohe Durchsatzanalyse-Technik. Es kann verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen biologischen Molekülen und Durchführung Wandler zu untersuchen, und können in einer Vielzahl von Lab-on-a-Chip-Anwendungen verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unsere Verfahren zeigen die Herstellung eines mikrofluidischen Basis elektro Biochip und seine Verwendung für die DNA-Hybridisierungsereignissen Analyse. Durch eine hohe Ausbeute gesteuert Mikroprozess entwickeln wir ein Gerät der Mikrokanäle mit einer Reihe von elektrochemischen Wandler integriert zusammen. Wir haben gesteuerten Bearbeitungsparameter für die Photolithographie Verfahren der elektrochemischen Chip und der mikrofluidischen Kanal Form durch einen iterativen Ansatz entwickelt. Diese Schritte stellen Lei…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren erkennen die Robert W. Deutsch-Stiftung, die Defense Threat Reduction Agency (DTRA) und der National Science Foundation Frontiers in Schwellen Forschung und Innovation (EFRI) für finanzielle Unterstützung. Die Autoren danken auch dem Maryland und seine Nanocenter FabLab für Reinraumanlage Unterstützung.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Material | |||
| 4'' Silicon wafer | Ultrasil | 4-5664 | Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm*cm |
| Shipley 1813 photoresist ("PR1") | Microchem | positive photoresist | |
| AZ5214 photoresist ("PR2") | Hoechst Celanse | positive photoresist | |
| SU-8 50 photoresist ("PR3") | Microchem | negative photoresist | |
| Gold etchant | Transene | TFA | No dilution |
| Chromium etchant | Transene | 1020AC | No dilution |
| PDMS elastomer | Dow Corning | 3097366 1004 | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | 3097358 1004 | |
| Biopsy punching tool | Healthlink | BP20 | |
| Tygon flexible tubing | Cole Parmer | R 3603 | .015" |
| Tygon flexible adapter | Cole Parmer | 06417-41 | .0625" |
| 1 mL syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Monobasic potassium phosphate | Fluka | 1551139 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Sigma | RES20765-A7 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine | Aldrich | C4706 | |
| 6-mercapto-1-hexanol | Aldrich | 451088 | |
| 20x concentrated saline-sodium citrate buffer | Sigma | 93017 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Aldrich | 455946 | |
| Sodium ferrocyanide | Aldrich | CDS001589 | |
| Target ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/AAAGCTCCGATAGCGCTCCG TGGACGTCCC-3’ |
| Complementary ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3’ |
| Target ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3’ |
| Complementary ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3’ |
| Target ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3’ |
| Complementary ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3’ |
| Instrument | |||
| Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) | Oxford Instruments | PlasmaLab System 100 | Chamber pressure 1000 mTorr, Tempreture 200 celsius degrees, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Angstrom/minute. |
| DC sputtering unit | AJA International | ATC 1800-V | For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min. |
| E-beam evaporation system | Denton | Custom-built | For Titanium: Chamber pressure <2E-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5k W, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Angstrom/second. For Platinum: Chamber pressure <2E-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5k W, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Angstrom/second. |
| Potentiostat | CH Instruments | 660D | |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS230 |
Referências
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