A Biochip eletroquímica microfluídica à base de Análise de hibridação DNA livre-Label
Summary
Nós apresentamos um biochip electroquímica à base de microfluidos para a detecção de hibridação de ADN. Após a funcionalização ADNcs sonda, a especificidade, a sensibilidade, e o limite de detecção são estudadas com alvos de ADNcs complementares e não complementares. Os resultados ilustram a influência dos eventos de hibridação de ADN no sistema electroquimico, com um limite de detecção de 3,8 nM.
Abstract
A miniaturização de procedimentos analíticos de bancada para a micro-escala fornece vantagens significativas em relação ao tempo de reacção, o custo, e a integração dos passos de pré-processamento. Utilizando estes dispositivos para a análise de eventos de hibridação de ADN é importante porque oferece uma tecnologia para a avaliação em tempo real dos marcadores no ponto de atendimento para várias doenças. No entanto, quando a pegada dispositivo diminui o domínio de vários aumentos de fenômenos físicos. Estes fenómenos influenciar a precisão de fabrico e a fiabilidade de operação do dispositivo. Portanto, há uma grande necessidade de fabricar e operar com precisão estes dispositivos de uma maneira reprodutível, a fim de melhorar o desempenho global. Aqui, descrevemos os protocolos e os métodos utilizados para a fabricação e operação de um biochip eletroquímica microfluídica à base para a análise precisa de eventos de hibridização DNA. O biochip é composto por duas partes: um chip de microfluidos comtrês micro-canais paralelos feitos de polidimetilsiloxano (PDMS), e um 3 x 3 dispostas electroquímica de micro-chip. Os eventos de hibridização DNA são detectados através da análise de espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS). A análise EIS permite variações de monitoramento das propriedades do sistema eletroquímico que são dominantes nessas escalas de comprimento. Com a capacidade de monitorar as alterações de ambos e de transferência de carga com a resistência à difusão do biossensor, que demonstram a selectividade para alvos de ADNcs complementares, calculado um limite de detecção de 3,8 nM, e uma reactividade cruzada de 13% com outro ADNcs não complementar a seguir 20 min de incubação. Esta metodologia pode melhorar o desempenho dos dispositivos miniaturizados por elucidar sobre o comportamento de difusão no regime de micro-escala e por permitir o estudo de eventos de hibridação de ADN.
Introduction
Lab-on-a-chip dispositivos microfluídicos (LOC) oferecem inúmeras vantagens em diagnósticos clínicos, monitoramento ambiental e pesquisa biomédica. Estes dispositivos utilizam canais de microfluidos para controlar o fluxo do fluido às regiões do chip em que uma variedade de processos pode ocorrer incluindo a mistura de reagente, a afinidade de ligação com base, a transdução de sinal, e a cultura de células 1-4. Microfluídica oferece muitas vantagens sobre as ferramentas de diagnóstico clínicos convencionais, tais como leitores de microplaca ou eletroforéticos testes de desvio de gel. Dispositivos de microfluidos requerem 2 a 3 ordens de magnitude (em oposição nanolitros a microlitros) menos reagentes para efectuar ensaios semelhantes. Além disso, estes dispositivos podem aumentar a velocidade com que alguns eventos biológicos ocorrer devido ao menor confinamento das espécies dentro dos canais 5,6. Em terceiro lugar, os sensores podem ser integrados dentro de dispositivos microfluídicos usando técnicas de litografia e gravura, que podem fornecer detectio sem rótulon. Finalmente, estes dispositivos são de produção barata e exigem pouco trabalho por parte do técnico para operar 7-10.
Detecção livre de marcador é tipicamente realizada usando um transdutor óptico ou eléctrico. Dispositivos ópticos podem apresentar um melhor desempenho de detecção devido a menor interferência com analitos presentes na amostra. No entanto, seu desempenho fica comprometida nos casos em que o fundo da amostra tem o mesmo comprimento de onda ressonante como o sensor 11. Há muitas vantagens em usar sinais elétricos para realizar a detecção biológica e química em sistemas microfluídicos. A fabricação é inerentemente menos complicada, uma vez que estes sensores geralmente requerem apenas eléctrodos padronizados para operar. Além disso, os sinais eléctricos podem ser directamente em interface com a maioria do equipamento de medição, enquanto outras modalidades de sinalização pode exigir um transdutor para converter o sinal de 12-15. Sensores elétricos comumente medir as mudanças na impedance 16,17, capacitância 18, ou redox atividade 19. No entanto, novos desafios são apresentados como estes sistemas são miniaturizados. Os desafios mais importantes para superar incluem: preparação de amostras e mistura de fluidos (devido ao baixo volume de amostra e número de Reynolds), efeitos físicos e químicos (incluindo forças capilares, rugosidade da superfície, interações químicas entre materiais de construção e analitos), de baixo sinal para-ruído (produzido pela redução da área de superfície e volume) 20-23, e a interferência potencial de analitos electroactivas em amostras biológicas complexas (por exemplo, de sangue e de saliva). Outras investigações destes efeitos resultarão em diretrizes para uma fabricação precisa e operação destes dispositivos de forma reproduzível que iria melhorar em seu desempenho geral.
A detecção de hibridação de ADN é usado extensivamente para o diagnóstico de doenças genéticas 24,25 e várias formas de cancer 26. Todos os anos, várias cepas de influenza são identificados em pacientes que utilizam os resultados de técnicas de hibridização DNA 27. O vírus da gripe responde sozinho por 36 mil mortes por ano nos Estados Unidos 28. Tais exemplos poderiam beneficiar de uma bancada dispositivo de microfluidos, que pode executar as mesmas técnicas de teste como um teste de desvio de leitor de placas ou de gel com baixo volume de amostra e a uma fracção do custo, sem sacrificar a sensibilidade ou especificidade. Devido às muitas vantagens da detecção electroquímica livre de marcador, tem sido amplamente utilizado para a detecção de eventos de hibridação de ADN 29,30. A configuração em que os eléctrodos de macro-escala (na gama de milímetro) são imersas em provetas com a solução de interesse pode ser utilizado para proporcionar dados muito sensíveis em relação à cinética de ligação de sequências de ADN de cadeia simples, que correspondem às suas sequências complementares. Recentemente, tem havido alguns avanços na incorporação de sensor eletroquímico em microfluidics para hibridação de ADN. Estudos têm sido realizados sobre a cinética de hibridização 31 e integração de sensores para detecção de 15 em canais microfluídicos. No entanto, continua a existir a necessidade de um dispositivo de microfluidos de alto rendimento e que pode analisar eventos de hibridação de ADN em paralelo, sem complicados passos de preparação de amostra.
O dispositivo apresentado neste trabalho fornece uma plataforma que permite múltiplas interações para ser exibido em paralelo e sem complicadas etapas de preparação da amostra. Nosso protocolo apresenta como microfluídicos baseados em biochips eletroquímicos são microfabricados com sistemas micro-eletromecânicos (MEMS) 32,33. Descreve-se o processo de fabricação, tanto o chip de microfluidos, feita de polidimetilsiloxano (PDMS), e o chip de electroquímica, composta por uma matriz de eléctrodos. A funcionalização química do biochip com sondas ssDNA também é abordada. Finalmente, o abildade do biossensor para detectar especificamente e analisar alvos de ADNcs é demonstrada. Em geral, o biochip electroquímica à base de microfluidos é uma técnica rápida e análises de elevado rendimento. Ele pode ser usado para investigar interacções entre moléculas biológicas e realizando transdutores, e pode ser utilizado em uma variedade de aplicações lab-on-a-chip.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nossos procedimentos demonstram a fabricação de um biochip eletroquímico baseado em microfluídica e sua utilização para a análise de eventos de hibridização DNA. Através de um processo de alto rendimento microfabricação controlada desenvolvemos um dispositivo composto por canais em microescala integrados com uma matriz de transdutores electroquímicos. Nós planejamos parâmetros de processamento controlados para o procedimento de fotolitografia do chip eletroquímica eo molde canal microfluídicos através …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem o Robert W. Deutsch Foundation, a Agência de Redução de Ameaças à Defesa (DTRA) ea National Science Foundation Emerging Frontiers in Investigação e Inovação (EFRI) pelo apoio financeiro. Os autores também agradecem a NanoCenter Maryland e sua Fablab para suporte instalação de sala limpa.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Material | |||
| 4'' Silicon wafer | Ultrasil | 4-5664 | Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm*cm |
| Shipley 1813 photoresist ("PR1") | Microchem | positive photoresist | |
| AZ5214 photoresist ("PR2") | Hoechst Celanse | positive photoresist | |
| SU-8 50 photoresist ("PR3") | Microchem | negative photoresist | |
| Gold etchant | Transene | TFA | No dilution |
| Chromium etchant | Transene | 1020AC | No dilution |
| PDMS elastomer | Dow Corning | 3097366 1004 | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | 3097358 1004 | |
| Biopsy punching tool | Healthlink | BP20 | |
| Tygon flexible tubing | Cole Parmer | R 3603 | .015" |
| Tygon flexible adapter | Cole Parmer | 06417-41 | .0625" |
| 1 mL syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Monobasic potassium phosphate | Fluka | 1551139 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Sigma | RES20765-A7 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine | Aldrich | C4706 | |
| 6-mercapto-1-hexanol | Aldrich | 451088 | |
| 20x concentrated saline-sodium citrate buffer | Sigma | 93017 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Aldrich | 455946 | |
| Sodium ferrocyanide | Aldrich | CDS001589 | |
| Target ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/AAAGCTCCGATAGCGCTCCG TGGACGTCCC-3’ |
| Complementary ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3’ |
| Target ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3’ |
| Complementary ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3’ |
| Target ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3’ |
| Complementary ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3’ |
| Instrument | |||
| Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) | Oxford Instruments | PlasmaLab System 100 | Chamber pressure 1000 mTorr, Tempreture 200 celsius degrees, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Angstrom/minute. |
| DC sputtering unit | AJA International | ATC 1800-V | For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min. |
| E-beam evaporation system | Denton | Custom-built | For Titanium: Chamber pressure <2E-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5k W, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Angstrom/second. For Platinum: Chamber pressure <2E-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5k W, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Angstrom/second. |
| Potentiostat | CH Instruments | 660D | |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS230 |
Referências
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