Biochip אלקטרוכימי מבוסס Microfluidic לניתוח הכלאה DNA ללא תווית
Summary
אנו מציגים biochip אלקטרוכימיים המבוסס על microfluidic לגילוי הכלאת DNA. בעקבות functionalization הבדיקה ssDNA, הסגוליות, הרגישות, וגבול הגילוי נלמדים ביעדי ssDNA משלימים ולא משלימים. תוצאות ממחישות את השפעתם של אירועי הכלאת DNA על מערכת אלקטרוכימיים, עם גבול גילוי של 3.8 ננומטר.
Abstract
מזעור של נהלים המעבדתיים אנליטיים למייקרו בקנה המידה מספק יתרונות משמעותיים בכל הקשור לזמן תגובה, עלות, ושילוב של מדרגות עיבוד מראש. ניצול מכשירים אלה לקראת הניתוח של אירועי הכלאת DNA הוא חשוב משום שהיא מציעה טכנולוגיה להערכה בזמן אמת של סמנים ביולוגיים בנקודה של הטיפול למחלות שונות. עם זאת, כאשר טביעת רגל המכשיר מפחיתה את הדומיננטיות של עליות תופעות פיסיקליות שונות. תופעות אלה משפיעים על דיוק הייצור ואמינות תפעול של המכשיר. לכן, יש צורך גדול כדי להמציא באופן מדויק והפעלת מכשירים אלו באופן לשעתק על מנת לשפר את הביצועים הכוללים. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים ושיטות המשמשות לייצור והתפעול של biochip אלקטרוכימיים המבוסס על microfluidic לניתוח מדויק של אירועי הכלאת DNA. Biochip מורכב משני חלקים: שבב microfluidic עםשלושה מיקרו ערוצים מקבילים עשויים polydimethylsiloxane (PDMS), ו3 x 3 מיקרו שבב אלקטרוכימיים ערוך. אירועי הכלאת DNA מזוהים באמצעות ניתוח אלקטרוכימיים ספקטרוסקופיה עכבה (EIS). ניתוח EIS מאפשר וריאציות ניטור של המאפיינים של המערכת אלקטרוכימיים כי הם דומיננטיים בקני מידת אורך אלה. עם היכולת לעקוב אחר שינויים של שתי העברת המטען והתנגדות diffusional עם biosensor, אנחנו מדגימים את הסלקטיביות למטרות ssDNA משלימות, גבול גילוי מחושב של 3.8 ננומטר, ו13% תגובתיות צולבת עם ssDNA שאינו משלימים אחרים הבא 20 דקות של דגירה. מתודולוגיה זו יכולה לשפר את הביצועים של מכשירים ממוזערים על ידי הבהרה על ההתנהגות של דיפוזיה במשטר מיקרו בקנה מידה ועל ידי הפעלת המחקר של אירועי הכלאת DNA.
Introduction
מעבדה על שבב microfluidic מכשירים (LOC) מספקים יתרונות רבים באבחון קליני, ניטור סביבתי ומחקר ביו. התקנים אלה לנצל ערוצי microfluidic לשלוט זרימת נוזל לאזורים של השבב שבו מגוון רחב של נהלים יכול להתקיים כולל ערבוב מגיב, זיקה מבוססת מחייב, הולכים אותות, ותא culturing 1-4. מיקרופלואידיקה מספקת יתרונות רבים על פני כלי אבחון קליניים קונבנציונליים כגון קוראי צלחת microwell או מבחני משמרת ג'ל electrophoretic. מכשירי microfluidic דורשים 2 עד 3 סדרי הגודל (nanoliters בניגוד למיקרוליטר) פחות חומרים כימיים לביצוע מבחני דומים. כמו כן, מכשירים אלה יכולים להגדיל את המהירות שבה כמה אירועים ביולוגיים להתרחש עקב הכליאה קטנה יותר של המינים בתוך הערוצים 5,6. שלישית, ניתן לשלב חיישנים בתוך המכשירים microfluidic תוך שימוש בטכניקות ליתוגרפיה ותחריט, אשר יכול לספק detectio ללא תוויתn. לבסוף, התקנים אלה הם זולים לייצור ודורש קצת עבודה על החלק של הטכנאי לפעול 7-10.
זיהוי ללא תווית בדרך כלל מתבצע באמצעות מתמר אופטי או חשמלי. מכשירים אופטיים יכולים להציג ביצועים טובים יותר חישה עקב הפרעה נמוכה יותר עם analytes במדגם. עם זאת, הביצועים שלהם נפגעת במקרים בהם הרקע של המדגם יש את אותו אורך גל מהדהד כמו החיישן 11. ישנם יתרונות רבים לשימוש באותות חשמליים כדי לבצע זיהוי ביולוגי וכימי במערכות microfluidic. הייצור הוא מטבעו פחות מסובך מאז חיישנים אלה בדרך כלל דורשים רק אלקטרודות בדוגמת לפעול. בנוסף, אותות חשמליים יכולים להיות ממשק ישיר עם ציוד המדידה ביותר, תוך שיטות אות מסוימות עשויות לדרוש מתמר להמיר את האות 12-15. חיישנים חשמליים נפוצים למדוד שינויים בimpedancפעילות הדואר 16,17, קיבול 18, או חיזור 19. עם זאת, אתגרים חדשים מוצגים כמערכות אלה ממוזערים. האתגרים החשובים ביותר להתגבר כוללים: הכנת מדגם וערבוב של נוזלים (עקב נמוך נפח הדגימה ומספר ריינולדס), השפעות פיזיות וכימיות (כולל כוחות נימים, חספוס פני השטח, אינטראקציות כימיות בין חומרי הבנייה וanalytes), איתות נמוכה יחס לרעש (המיוצר על ידי האזור המופחת פני השטח ונפח) 20-23, והפרעה אפשרית מanalytes אלקטרו הפעיל בדגימות מורכבות ביולוגיות (למשל, דם ורוק). חקירה נוספת של תופעות אלה תגרום להנחיות לייצור ותפעול מדויקים של מכשירים אלה באופן לשחזור שישפרו על הביצועים הכוללים שלהם.
זיהוי הכלאת DNA נעשה שימוש נרחב כדי לאבחן הפרעות גנטיות 24,25 וצורות שונות של cancאה 26. בכל שנה, זנים רבים של שפעת מזוהות בחולים באמצעות תוצאות של טכניקות הכלאת DNA 27. נגיף שפעת חשבונות לבד עבור 36,000 מקרי מוות בכל שנה בארצות הברית 28. דוגמאות כאלה יכולות להפיק תועלת ממכשיר microfluidic ספסל העליון שיכול לבצע את אותן טכניקות assay כassay משמרת צלחת קורא או ג'ל עם נמוך נפח דגימה ובכל חלק של העלות מבלי להקריב את רגישות או סגוליות. בשל יתרונות הרבים של חישה אלקטרוכימיים ללא תווית, זה כבר בשימוש נרחב לגילוי של אירועי הכלאת DNA 29,30. התקנה שבו אלקטרודות מאקרו בקנה מידה (בטווח של מילימטר) טבולות בכוסות עם הפתרון של עניין יכול לשמש כדי לספק נתונים רגישים מאוד בנוגע לקינטיקה מחייבת של רצפי DNA חד גדילים לרצפים המשלימים ההתאמה שלהם. לאחרונה, יש כבר כמה התקדמות בשילוב חישה אלקטרוכימיים בMICRofluidics להכלאת DNA. מחקרים שבוצעו לגבי קינטיקה הכלאה יום 31 ובאינטגרציה של חיישנים לגילוי 15 בערוצי microfluidic. עם זאת, עדיין קיים צורך במכשיר מהיר תפוקה גבוהה microfluidic שיכול לנתח אירועי הכלאת DNA במקביל ללא צעדי הכנת מדגם מסובכים.
המכשיר שהוצג בעבודה זו מספק פלטפורמה שמאפשרת לאינטראקציות מרובות כדי להיות מוקרנים במקביל וללא צעדי הכנת מדגם מסובכים. הפרוטוקול שלנו מציג כיצד microfluidic מבוסס שבבים אלקטרוכימיים הם microfabricated עם מערכות מיקרו אלקטרו טכנולוגיה (MEMS) 32,33. אנו מתארים את תהליך הייצור של שני השבב microfluidic, עשוי polydimethylsiloxane (PDMS), והשבב אלקטרוכימיים, מורכב ממערך של אלקטרודות. Functionalization הכימי של biochip עם בדיקות ssDNA הוא התייחס גם. לבסוף, אבילity של biosensor כדי לזהות באופן ספציפי ולנתח מטרות ssDNA בא לידי ביטוי. בסך הכל, biochip אלקטרוכימיים המבוסס על microfluidic הוא טכניקה מהירה וניתוח תפוקה גבוהה. זה יכול לשמש כדי לחקור אינטראקציות בין מולקולות ביולוגיות ומתמר ביצוע, ויכול להיות מנוצל במגוון רחב של יישומי מעבדה על שבב.
Protocol
Representative Results
Discussion
הנהלים שלנו להדגים את הייצור של biochip אלקטרוכימיים המבוסס על microfluidic והניצול שלה לניתוח אירועי הכלאת DNA. באמצעות תהליך microfabrication תשואה גבוהה בשליטתנו לפתח מכשיר מורכב מערוצי microscale המשולבים עם מערך של חיישני אלקטרוכימיים. אנחנו פיתחנו פרמטרים עיבוד מבוקרים להליך photolithog…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים קרן רוברט וו דויטש, איום ביטחון הפחתת הסוכנות (DTRA), וקרן המדע מתעוררים הגבולות הלאומיים במחקר וחדשנות (אפרים) לתמיכה כספית. המחברים מודים גם ננוטכנולוגיה של אוניברסיטת מרילנד וFabLab לתמיכת מתקן חדר נקי.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Material | |||
| 4'' Silicon wafer | Ultrasil | 4-5664 | Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm*cm |
| Shipley 1813 photoresist ("PR1") | Microchem | positive photoresist | |
| AZ5214 photoresist ("PR2") | Hoechst Celanse | positive photoresist | |
| SU-8 50 photoresist ("PR3") | Microchem | negative photoresist | |
| Gold etchant | Transene | TFA | No dilution |
| Chromium etchant | Transene | 1020AC | No dilution |
| PDMS elastomer | Dow Corning | 3097366 1004 | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | 3097358 1004 | |
| Biopsy punching tool | Healthlink | BP20 | |
| Tygon flexible tubing | Cole Parmer | R 3603 | .015" |
| Tygon flexible adapter | Cole Parmer | 06417-41 | .0625" |
| 1 mL syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Monobasic potassium phosphate | Fluka | 1551139 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Sigma | RES20765-A7 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine | Aldrich | C4706 | |
| 6-mercapto-1-hexanol | Aldrich | 451088 | |
| 20x concentrated saline-sodium citrate buffer | Sigma | 93017 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Aldrich | 455946 | |
| Sodium ferrocyanide | Aldrich | CDS001589 | |
| Target ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/AAAGCTCCGATAGCGCTCCG TGGACGTCCC-3’ |
| Complementary ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3’ |
| Target ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3’ |
| Complementary ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3’ |
| Target ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3’ |
| Complementary ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3’ |
| Instrument | |||
| Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) | Oxford Instruments | PlasmaLab System 100 | Chamber pressure 1000 mTorr, Tempreture 200 celsius degrees, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Angstrom/minute. |
| DC sputtering unit | AJA International | ATC 1800-V | For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min. |
| E-beam evaporation system | Denton | Custom-built | For Titanium: Chamber pressure <2E-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5k W, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Angstrom/second. For Platinum: Chamber pressure <2E-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5k W, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Angstrom/second. |
| Potentiostat | CH Instruments | 660D | |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS230 |
Referências
- Hong, J., Edel, J. B., deMello, A. J. Micro- and nanofluidic systems for high-throughput biological screening. Drug Discov. Today. 14, 134-146 (2009).
- Sun, Y., Kwok, Y. C. Polymeric microfluidic system for DNA analysis. Anal. Chim. Acta. 556, 80-96 (2006).
- Xu, Y., Yang, X., Wang, E. Review: aptamers in microfluidic chips. Anal. Chim. Acta. 683, 12-20 (2010).
- Yang, W., Woolley, A. T. Integrated multiprocess microfluidic systems for automating analysis. J. Lab. Automat. 15, 198-209 (2010).
- Gervais, T., Jensen, K. F. Mass transport and surface reactions in microfluidic systems. Chem. Eng. Sci. 61, 1102-1121 (2006).
- Song, H., Ismagilov, R. F. Millisecond kinetics on a microfluidic chip using nanoliters of reagents. J. Am. Chem. Soc. 125, 14613-14619 (2003).
- Jiang, H., Weng, X. A., Li, D. Q. Microfluidic whole-blood immunoassays. Microfluid. Nanofluid. 10, 941-964 (2011).
- Dutse, S. W., Yusof, N. A. Microfluidics-based lab-on-chip systems in DNA-based biosensing: an overview. Sensors. 11, 5754-5768 (2011).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 5, 210-218 (2006).
- Craighead, H. Future lab-on-a-chip technologies for interrogating individual molecules. Nature. 442, 387-393 (2006).
- Hunt, H. K., Armani, A. M. Label-free biological and chemical sensors. Nanoscale. 2, 1544-1559 (2010).
- Dukkipati, V. R., Pang, S. W. Integrated microfluidic system for DNA analysis. IEEE-NANO 2006. Sixth IEEE Conference on Nanotechnology. 1, 162-165 (2006).
- Fang, T. H., et al. Real-time PCR microfluidic devices with concurrent electrochemical detection. Biosens. Bioelectron. 24, 2131-2136 (2009).
- Pavlovic, E., et al. Microfluidic device architecture for electrochemical patterning and detection of multiple DNA sequences. Langmuir. 24, 1102-1107 (2008).
- Xu, X., Zhang, S., Chen, H., Kong, J. Integration of electrochemistry in micro-total analysis systems for biochemical assays: recent developments. Talanta. 80, 8-18 (2009).
- Cai, H., Lee, T. M. -. H., Hsing, I. M. Label-free protein recognition using an aptamer-based impedance measurement assay. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 433-437 (2006).
- Iliescu, C., Poenar, D. P., Carp, M., Loe, F. C. A Microfluidic device for impedance spectroscopy analysis of biological samples. Sensor. Actuat. B-Chem. 123, 168-176 (2007).
- Prakash, S. B., Abshire, P. Tracking cancer cell proliferation on a CMOS capacitance sensor chip. Biosens. Bioelectron. 23, 1449-1457 (2008).
- Yamaguchi, A., et al. Rapid fabrication of electrochemical enzyme sensor chip using polydimethylsiloxane microfluidic channel. Anal. Chim. Acta. 468, 143-152 (2002).
- Beebe, D. J., Mensing, G. A., Walker, G. M. Physics and applications of microfluidics in biology. Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 261-286 (2002).
- Mariella, R. Sample preparation: the weak link in microfluidics-based biodetection. Biomed. Microdevices. 10, 777-784 (2008).
- Bhushan, B. . Springer handbook of nanotechnology. , (2010).
- Ghallab, Y. H., Badawy, W. . Lab-on-a-chip: Techniques, circuits, and biomedical applications. , (2010).
- Chee, M., et al. Accessing genetic information with high-density DNA arrays. Science. 25, 610-614 (1996).
- Ma, K. -. S., Zhou, H., Zoval, J., Madou, M. DNA hybridization detection by label free versus impedance amplifying label with impedance spectroscopy. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 58-64 (2006).
- Ito, T., Hosokawa, K., Maeda, M. Detection of single-base mismatch at distal end of DNA duplex by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 22, 1816-1819 (2007).
- Kao, L. T. -. H., et al. Multiplexed detection and differentiation of the DNA strains for influenza A (H1N1 2009) using a silicon-based microfluidic system. Biosens. Bioelectron. 26, 2006-2011 (2011).
- Li, J., Chen, S., Evans, D. H. Typing and subtyping influenza virus using DNA microarrays and multiplex reverse transcriptase PCR. J. Clin. Microbiol. 39, 696-704 (2001).
- Gautier, C., et al. Hybridization-induced interfacial changes detected by non-faradaic impedimetric measurements compared to faradaic approach. J. Electroanal. Chem. 610, 227-233 (2007).
- Ma, Y., Jiao, K., Yang, T., Sun, D. Sensitive PAT gene sequence detection by nano-SiO2/p-aminothiophenol self-assembled films DNA electrochemical biosensor based on impedance measurement. Sensor. Actuat. B-Chem. 131, 565-571 (2008).
- Kim, J. H. -. S., Marafie, A., Jia, X. -. Y., Zoval, J. V., Madou, M. J. Characterization of DNA hybridization kinetics in a microfluidic flow channel. Sensor. Actuat. B-Chem. 113, 281-289 (2006).
- Dykstra, P. H., Roy, V., Byrd, C., Bentley, W. E., Ghodssi, R. Microfluidic electrochemical sensor array for characterizing protein interactions with various functionalized surfaces. Anal. Chem. 83, 5920-5927 (2011).
- Ben-Yoav, H., Dykstra, P. H., Bentley, W. E., Ghodssi, R. A Microfluidic-based electrochemical biochip for label-free diffusion-restricted DNA hybridization analysis. Biosens. Bioelectron. 38, 114-120 (2012).
- Wink, T., van Zuilen, S. J., Bult, A., van Bennekom, W. P. Self-assembled monolayers for biosensors. Analyst. 122, 43R-50R (1997).
- McEwen, G. D., Chen, F., Zhou, A. Immobilization, hybridization, and oxidation of synthetic DNA on gold surface: Electron transfer investigated by electrochemistry and scanning tunneling microscopy. Anal. Chim. Acta. 643, 26-37 (2009).
- Arinaga, K., Rant, U., Tornow, M., Fujita, S., Abstreiter, G., Yokoyama, N. The role of surface charging during the coadsorption of mercaptohexanol to DNA layers on gold: Direct observation of desorption and layer reorientation. Langmuir. 22, 5560-5562 (2006).
- Katz, E., Willner, I. Probing biomolecular interactions at conductive and semiconductive surfaces by impedance spectroscopy: Routes to impedimetric immunosensors, DNA-sensors, and enzyme biosensors. Electroanalysis. 15, 913-947 (2003).
