En Mikrofluid baseret Elektrokemisk Bioflis efter etiket-fri DNA-hybridisering Analyse
Summary
Vi præsenterer en mikrofluidindretning-baserede elektrokemisk biochip for DNA hybridisering detektion. Efter ssDNA sonde funktionalisering er specificitet, sensitivitet, og detektionsgrænse den studerede med komplementære og ikke-komplementære ssDNA mål. Resultaterne viser indflydelsen af DNA-hybridisering begivenheder på den elektrokemiske system, med en detektionsgrænse på 3,8 nM.
Abstract
Miniaturisering af analytiske stationære procedurer ind i mikro-skala giver betydelige fordele i forhold til reaktionstid, omkostninger og integration af præ-procestrin. Ved hjælp af disse enheder mod analyse af DNA-hybridisering begivenheder er vigtigt, fordi det giver en teknologi til tidstro vurdering af biomarkører ved point-of-care til forskellige sygdomme. Men når enheden fodaftryk nedsætter dominans forskellige fysiske fænomener stiger. Disse fænomener påvirker fremstilling præcision og driftssikkerhed af enheden. Der er derfor et stort behov for nøjagtigt at fremstille og betjene disse enheder i en reproducerbar måde med henblik på at forbedre den samlede ydeevne. Her beskriver vi de protokoller og de metoder, der anvendes til fremstilling og drift af en mikrofluidindretning baserede elektrokemisk biochip til nøjagtig analyse af DNA-hybridisering begivenheder. Den biochippen er sammensat af to dele: en mikrofluid chip medtre parallelle mikrokanaler fremstillet af polydimethylsiloxan (PDMS), og en 3 x 3 array elektrokemisk mikrochip. De DNA-hybridisering begivenheder påvises ved hjælp af elektrokemisk impedans spektroskopi (EIS) analyse. EIS analyse muliggør overvågning variationer af egenskaberne af det elektrokemiske system, der er fremherskende på disse længdeskalaer. Med evnen til at overvåge ændringer i både ladningsoverførsel og diffusionsmodstanden med biosensoren viser vi selektiviteten komplementære ssDNA-mål, en beregnet detektionsgrænse på 3,8 nM og en 13% krydsreaktivitet med andre ikke-komplementære ssDNA efter 20 minutter inkubation. Denne metode kan forbedre ydeevnen af miniaturiserede enheder ved at belyse om adfærd diffusion på mikro-skala regime og ved at muliggøre en undersøgelse af DNA-hybridisering begivenheder.
Introduction
Mikrofluid lab-on-a-chip (LOC) enheder giver mange fordele i klinisk diagnostik, miljøovervågning og biomedicinsk forskning. Disse enheder udnytter mikrofluidkanaler at kontrollere væske flow til områder af chippen, hvor en række procedurer kan finde sted, herunder reagens blanding, affinitet baserede bindende, signaltransduktion, og celle dyrkning 1-4. Microfluidics giver mange fordele i forhold til konventionelle kliniske diagnostiske værktøjer såsom mikrobrønd pladelæsere eller elektroforetiske gel shift-assays. Mikrofluidenheder kræver 2 til 3 størrelsesordener (nanoliter modsætning til mikroliter) færre reagenser til at udføre lignende analyser. Desuden kan disse enheder øge hastigheden, hvormed visse biologiske hændelser opstår på grund af den mindre indespærring af arterne i kanalerne 5,6. For det tredje kan sensorer integreres i mikrofluide enheder ved hjælp af litografi og ætsning teknikker, som kan give etiket-fri detection. Endelig, disse enheder er billige at producere og kræver lidt arbejde på den del af tekniker til at drive 7-10.
Label-fri detektion typisk udføres med en optisk eller elektrisk transducer. Optiske enheder kan præsentere bedre føling ydeevne på grund af lavere interferens med analytter i prøven. Ikke desto mindre er deres præstationer kompromitteret i tilfælde, hvor prøven baggrund har den samme resonans bølgelængde som sensoren 11. Der er mange fordele ved at anvende elektriske signaler til at udføre biologisk og kemisk detektion i mikrofluide systemer. Fremstillingen er i sagens natur mindre kompliceret, da disse sensorer typisk kun kræve mønstrede elektroder til at operere. Endvidere kan elektriske signaler direkte interface med de fleste måleudstyr mens andre signal modaliteter kan kræve en transducer til at konvertere signalet 12-15. Elektriske sensorer almindeligvis måle ændringer i impedance 16,17, kapacitans 18 eller redoxaktiviteten 19. Men nye udfordringer, da disse systemer er miniaturiseret. De vigtigste udfordringer at overvinde, omfatter: prøveforberedelse og blanding af væsker (på grund af den lave prøvevolumen og Reynolds-tal), fysiske og kemiske virkninger (herunder kapillarkræfter, overfladeruhed, kemiske interaktioner mellem byggematerialer og analytter), lav signal- til-støj-forhold (produceret af det reducerede overfladeareal og volumen) 20-23, og potentiel interferens fra elektro-aktive analytter i komplekse biologiske prøver (fx blod og spyt). Yderligere undersøgelse af disse virkninger vil resultere i retningslinjerne for en nøjagtig fremstilling og drift af disse enheder i en reproducerbar måde, der vil forbedre deres samlede resultater.
DNA-hybridisering påvisning benyttes i vid udstrækning til at diagnosticere genetiske sygdomme 24,25 og forskellige former for CancER 26. Hvert år bliver flere stammer af influenza identificeret i patienter, der anvender resultaterne fra DNA-hybridiseringsteknikker 27. Influenzavirus tegner sig alene for 36.000 dødsfald hvert år i USA 28. Sådanne eksempler kunne drage fordel af en bench-top mikrofluid anordning, der kan udføre de samme analyseteknikker som en pladelæser eller gel shift assay med lavt prøvevolumen og til en brøkdel af omkostningerne uden at ofre sensitivitet eller specificitet. På grund af de mange fordele ved etiket-fri elektrokemisk sensing, er det blevet brugt i udstrakt grad til påvisning af DNA-hybridisering begivenheder 29,30. En opsætning, hvor makro-skala elektroder (i millimeter området) er dyppet i bægre med opløsningen af interesse, kan bruges til at give meget følsomme data vedrørende bindingskinetik af enkeltstrengede DNA-sekvenser til deres matchende komplementære sekvenser. For nylig har der været et par fremskridt i at indarbejde elektrokemiske sensing i MICRofluidics til DNA-hybridisering. Der er lavet undersøgelser om hybridiseringskinetik 31 og integration af sensorer til detektion 15 i mikrofluidkanaler. Imidlertid eksisterer der stadig et behov for en hurtig høj gennemløb mikrofluid enhed, der kan analysere DNA-hybridisering begivenheder parallelt uden komplicerede prøveforberedelse trin.
Apparatet præsenteret i dette arbejde tilvejebringer en platform, der giver mulighed for flere interaktioner skal screenes parallelt og uden komplicerede prøveforberedelse trin. Vores protokol præsenterer hvordan mikrofluid-baserede elektrokemiske biochips er mikrofabrikerede med mikro-elektromekaniske systemer (MEMS) teknologi 32,33. Vi beskriver produktionsprocessen både mikrofluid chip, lavet af polydimethylsiloxan (PDMS), og den elektrokemiske chip, der består af et array af elektroder. Den kemiske funktionalisering af biochippen med ssDNA sonder er også rettet. Endelig Abiltet af biosensoren til specifikt at spore og analysere ssDNA mål demonstreres. Samlet mikrofluid-baserede elektrokemisk biochip er en hurtig og høj-throughput analyse teknik. Det kan bruges til at undersøge interaktioner mellem biologiske molekyler og ledende transducere, og kan anvendes i en række af lab-on-a-chip anvendelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vores procedurer demonstrere fremstilling af en mikrofluidindretning-baserede elektrokemisk biochip og dens anvendelse til DNA-hybridisering begivenheder analyse. Gennem et højt udbytte kontrolleret mikrofabrikation proces udvikler vi en enhed bestående af mikroskala kanaler er integreret med et array af elektrokemiske transducere. Vi har udtænkt kontrollerede procesparametre for fotolitografi proceduren for den elektrokemiske chip og mikrofluid kanal formen gennem en iterativ fremgangsmåde. Disse trin giver retning…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne erkender Robert W. Deutsch Foundation, Defense Threat Reduction Agency (DTRA) og National Science Foundation Emerging Frontiers i forskning og innovation (EFRI) om økonomisk støtte. Forfatterne takker også Maryland Nanocenter og dets FabLab til renrum støtte.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Material | |||
| 4'' Silicon wafer | Ultrasil | 4-5664 | Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm*cm |
| Shipley 1813 photoresist ("PR1") | Microchem | positive photoresist | |
| AZ5214 photoresist ("PR2") | Hoechst Celanse | positive photoresist | |
| SU-8 50 photoresist ("PR3") | Microchem | negative photoresist | |
| Gold etchant | Transene | TFA | No dilution |
| Chromium etchant | Transene | 1020AC | No dilution |
| PDMS elastomer | Dow Corning | 3097366 1004 | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | 3097358 1004 | |
| Biopsy punching tool | Healthlink | BP20 | |
| Tygon flexible tubing | Cole Parmer | R 3603 | .015" |
| Tygon flexible adapter | Cole Parmer | 06417-41 | .0625" |
| 1 mL syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Monobasic potassium phosphate | Fluka | 1551139 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Sigma | RES20765-A7 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine | Aldrich | C4706 | |
| 6-mercapto-1-hexanol | Aldrich | 451088 | |
| 20x concentrated saline-sodium citrate buffer | Sigma | 93017 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Aldrich | 455946 | |
| Sodium ferrocyanide | Aldrich | CDS001589 | |
| Target ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/AAAGCTCCGATAGCGCTCCG TGGACGTCCC-3’ |
| Complementary ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3’ |
| Target ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3’ |
| Complementary ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3’ |
| Target ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3’ |
| Complementary ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3’ |
| Instrument | |||
| Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) | Oxford Instruments | PlasmaLab System 100 | Chamber pressure 1000 mTorr, Tempreture 200 celsius degrees, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Angstrom/minute. |
| DC sputtering unit | AJA International | ATC 1800-V | For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min. |
| E-beam evaporation system | Denton | Custom-built | For Titanium: Chamber pressure <2E-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5k W, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Angstrom/second. For Platinum: Chamber pressure <2E-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5k W, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Angstrom/second. |
| Potentiostat | CH Instruments | 660D | |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS230 |
Referências
- Hong, J., Edel, J. B., deMello, A. J. Micro- and nanofluidic systems for high-throughput biological screening. Drug Discov. Today. 14, 134-146 (2009).
- Sun, Y., Kwok, Y. C. Polymeric microfluidic system for DNA analysis. Anal. Chim. Acta. 556, 80-96 (2006).
- Xu, Y., Yang, X., Wang, E. Review: aptamers in microfluidic chips. Anal. Chim. Acta. 683, 12-20 (2010).
- Yang, W., Woolley, A. T. Integrated multiprocess microfluidic systems for automating analysis. J. Lab. Automat. 15, 198-209 (2010).
- Gervais, T., Jensen, K. F. Mass transport and surface reactions in microfluidic systems. Chem. Eng. Sci. 61, 1102-1121 (2006).
- Song, H., Ismagilov, R. F. Millisecond kinetics on a microfluidic chip using nanoliters of reagents. J. Am. Chem. Soc. 125, 14613-14619 (2003).
- Jiang, H., Weng, X. A., Li, D. Q. Microfluidic whole-blood immunoassays. Microfluid. Nanofluid. 10, 941-964 (2011).
- Dutse, S. W., Yusof, N. A. Microfluidics-based lab-on-chip systems in DNA-based biosensing: an overview. Sensors. 11, 5754-5768 (2011).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 5, 210-218 (2006).
- Craighead, H. Future lab-on-a-chip technologies for interrogating individual molecules. Nature. 442, 387-393 (2006).
- Hunt, H. K., Armani, A. M. Label-free biological and chemical sensors. Nanoscale. 2, 1544-1559 (2010).
- Dukkipati, V. R., Pang, S. W. Integrated microfluidic system for DNA analysis. IEEE-NANO 2006. Sixth IEEE Conference on Nanotechnology. 1, 162-165 (2006).
- Fang, T. H., et al. Real-time PCR microfluidic devices with concurrent electrochemical detection. Biosens. Bioelectron. 24, 2131-2136 (2009).
- Pavlovic, E., et al. Microfluidic device architecture for electrochemical patterning and detection of multiple DNA sequences. Langmuir. 24, 1102-1107 (2008).
- Xu, X., Zhang, S., Chen, H., Kong, J. Integration of electrochemistry in micro-total analysis systems for biochemical assays: recent developments. Talanta. 80, 8-18 (2009).
- Cai, H., Lee, T. M. -. H., Hsing, I. M. Label-free protein recognition using an aptamer-based impedance measurement assay. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 433-437 (2006).
- Iliescu, C., Poenar, D. P., Carp, M., Loe, F. C. A Microfluidic device for impedance spectroscopy analysis of biological samples. Sensor. Actuat. B-Chem. 123, 168-176 (2007).
- Prakash, S. B., Abshire, P. Tracking cancer cell proliferation on a CMOS capacitance sensor chip. Biosens. Bioelectron. 23, 1449-1457 (2008).
- Yamaguchi, A., et al. Rapid fabrication of electrochemical enzyme sensor chip using polydimethylsiloxane microfluidic channel. Anal. Chim. Acta. 468, 143-152 (2002).
- Beebe, D. J., Mensing, G. A., Walker, G. M. Physics and applications of microfluidics in biology. Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 261-286 (2002).
- Mariella, R. Sample preparation: the weak link in microfluidics-based biodetection. Biomed. Microdevices. 10, 777-784 (2008).
- Bhushan, B. . Springer handbook of nanotechnology. , (2010).
- Ghallab, Y. H., Badawy, W. . Lab-on-a-chip: Techniques, circuits, and biomedical applications. , (2010).
- Chee, M., et al. Accessing genetic information with high-density DNA arrays. Science. 25, 610-614 (1996).
- Ma, K. -. S., Zhou, H., Zoval, J., Madou, M. DNA hybridization detection by label free versus impedance amplifying label with impedance spectroscopy. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 58-64 (2006).
- Ito, T., Hosokawa, K., Maeda, M. Detection of single-base mismatch at distal end of DNA duplex by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 22, 1816-1819 (2007).
- Kao, L. T. -. H., et al. Multiplexed detection and differentiation of the DNA strains for influenza A (H1N1 2009) using a silicon-based microfluidic system. Biosens. Bioelectron. 26, 2006-2011 (2011).
- Li, J., Chen, S., Evans, D. H. Typing and subtyping influenza virus using DNA microarrays and multiplex reverse transcriptase PCR. J. Clin. Microbiol. 39, 696-704 (2001).
- Gautier, C., et al. Hybridization-induced interfacial changes detected by non-faradaic impedimetric measurements compared to faradaic approach. J. Electroanal. Chem. 610, 227-233 (2007).
- Ma, Y., Jiao, K., Yang, T., Sun, D. Sensitive PAT gene sequence detection by nano-SiO2/p-aminothiophenol self-assembled films DNA electrochemical biosensor based on impedance measurement. Sensor. Actuat. B-Chem. 131, 565-571 (2008).
- Kim, J. H. -. S., Marafie, A., Jia, X. -. Y., Zoval, J. V., Madou, M. J. Characterization of DNA hybridization kinetics in a microfluidic flow channel. Sensor. Actuat. B-Chem. 113, 281-289 (2006).
- Dykstra, P. H., Roy, V., Byrd, C., Bentley, W. E., Ghodssi, R. Microfluidic electrochemical sensor array for characterizing protein interactions with various functionalized surfaces. Anal. Chem. 83, 5920-5927 (2011).
- Ben-Yoav, H., Dykstra, P. H., Bentley, W. E., Ghodssi, R. A Microfluidic-based electrochemical biochip for label-free diffusion-restricted DNA hybridization analysis. Biosens. Bioelectron. 38, 114-120 (2012).
- Wink, T., van Zuilen, S. J., Bult, A., van Bennekom, W. P. Self-assembled monolayers for biosensors. Analyst. 122, 43R-50R (1997).
- McEwen, G. D., Chen, F., Zhou, A. Immobilization, hybridization, and oxidation of synthetic DNA on gold surface: Electron transfer investigated by electrochemistry and scanning tunneling microscopy. Anal. Chim. Acta. 643, 26-37 (2009).
- Arinaga, K., Rant, U., Tornow, M., Fujita, S., Abstreiter, G., Yokoyama, N. The role of surface charging during the coadsorption of mercaptohexanol to DNA layers on gold: Direct observation of desorption and layer reorientation. Langmuir. 22, 5560-5562 (2006).
- Katz, E., Willner, I. Probing biomolecular interactions at conductive and semiconductive surfaces by impedance spectroscopy: Routes to impedimetric immunosensors, DNA-sensors, and enzyme biosensors. Electroanalysis. 15, 913-947 (2003).
