A-Microfluidic gebaseerd Elektrochemische Biochip voor-Label vrij DNA hybridisatie-analyse
Summary
We presenteren een microfluidic gebaseerde elektrochemische biochip voor DNA hybridisatie detectie. Na ssDNA probe functionalisering, de specificiteit, gevoeligheid en detectielimiet bestudeerd met complementaire en niet complementaire ssDNA targets. De resultaten tonen de invloed van de DNA hybridisatie aan het elektrochemische systeem, met een detectielimiet van 3,8 nM.
Abstract
Miniaturisatie van analytische procedures benchtop in de micro-schaal biedt aanzienlijke voordelen met betrekking tot reactietijd, kosten en integratie stappen voorbewerking. Gebruik makend van deze apparaten naar de analyse van DNA hybridisatie is belangrijk omdat het een technologie voor real time evaluatie van biomarkers in het point-of-care voor verschillende ziekten. Echter, wanneer de inrichting footprint vermindert de dominantie van verschillende fysische verschijnselen toeneemt. Deze fenomenen beïnvloeden de fabricage nauwkeurigheid en bedrijfszekerheid van de inrichting. Daarom is er een grote behoefte aan om de algemene prestaties verbeteren nauwkeurig fabriceren en gebruiken deze apparaten reproduceerbare wijze. Hier beschrijven we de protocollen en het wordt gebruikt voor de fabricage en de werking van een microfluïdische gebaseerd elektrochemische biochip voor een nauwkeurige analyse van DNA hybridisatie methoden. De biochip bestaat uit twee delen: een microfluïdische chip metdrie parallelle microkanalen van polydimethylsiloxaan (PDMS), en een 3 x 3 Arrayed elektrochemische micro-chip. De DNA hybridisatie gebeurtenissen worden gedetecteerd met behulp van elektrochemische impedantie spectroscopie (EIS) analyse. De EIS analyse stelt bewaking variaties van de eigenschappen van het elektrochemische systeem dat dominant op deze lengteschalen zijn. Met de mogelijkheid om veranderingen zowel ladingsoverdracht en diffusie weerstand met de biosensor monitoren tonen we de selectiviteit naar complementaire ssDNA doelen, een berekende detectielimiet van 3,8 nM, en een 13% kruisreactiviteit met andere niet-complementaire ssDNA na 20 min incubatie. Deze methode kan de prestaties van geminiaturiseerde inrichtingen verbeteren door het ophelderen van het gedrag van diffusie op micro-schaal regime en doordat de studie van DNA hybridisatie.
Introduction
Microfluïdische lab-on-a-chip (LOC)-apparaten bieden tal van voordelen in de klinische diagnostiek, bewaking van het milieu en biomedisch onderzoek. Deze apparaten maken gebruik van microkanalen te fluïdumstroming regio's van de chip waarbij een aantal verschillende werkwijzen kan plaatsvinden reagens zoals mengen, op basis van affiniteit binding, signaaltransductie en cel kweken 1-4. Microfluidics biedt vele voordelen ten opzichte van conventionele klinische diagnostische hulpmiddelen zoals microwell plaat lezers of elektroforetische gel shift assays. Microfluïdische apparaten vereisen 2 tot 3 orden van grootte (nanoliter tegenover microliter) minder reagentia vergelijkbare assays. Daarnaast kunnen deze apparaten op de snelheid waarmee een biologische gebeurtenissen door de kleinere opsluiting van de soorten van de kanalen 5,6 te verhogen. Ten derde kunnen de sensoren worden geïntegreerd binnen microfluïdische apparaten met behulp van lithografie en etsen technieken, die label-free detectio kan biedenn. Tenslotte, deze apparaten zijn goedkoop te produceren en vereisen weinig werk door de technicus te bedienen 7-10.
Labelvrije detectie wordt typisch uitgevoerd met een optische of elektrische transducer. Optische apparaten beter detectieprestaties presenteren door lagere interferentie met analyten in het monster. Toch is hun prestaties aangetast wanneer de achtergrond van het monster dezelfde resonerende golflengte als de sensor 11. Er zijn vele voordelen aan het gebruik van elektrische signalen aan biologische en chemische detectie uitvoeren in microfluïdische systemen. De fabricage is inherent minder ingewikkeld, omdat deze sensoren meestal alleen nodig patroon elektroden te bedienen. Bovendien kunnen elektrische signalen direct worden aangesloten op de meeste meetapparatuur terwijl andere modaliteiten een signaal transducer kan uitvoering van de signaal 12-15 converteren. Elektrische sensoren veranderingen in impedanc algemeen metene 16,17, capaciteit 18 of redox activiteit 19. Er zijn echter nieuwe uitdagingen gepresenteerd als deze systemen worden verkleind. De belangrijkste uitdagingen te overwinnen zijn: monstervoorbereiding en mengen van fluïda (vanwege de geringe hoeveelheid monster en Reynoldsgetal), fysische en chemische effecten (zoals capillaire krachten, oppervlakteruwheid, chemische interacties tussen bouwmaterialen en analyten), lage signaal- ruisverhouding (door het gereduceerde oppervlak en volume) 20-23 en mogelijke interferentie van elektro-actieve analyten in complexe biologische monsters (zoals bloed en speeksel). Nader onderzoek van deze effecten zal resulteren in richtlijnen voor een nauwkeurige fabricage en werking van deze inrichtingen op een reproduceerbare wijze die op hun prestaties zou verbeteren.
DNA hybridisatie detectie schaal gebruikt voor genetische aandoeningen 24,25 en verschillende vormen van canc diagnosticerener 26. Elk jaar, verschillende stammen van influenza geïdentificeerd bij patiënten die resultaten uit DNA hybridisatietechnieken 27. Het influenzavirus alleen al goed voor 36.000 doden per jaar in de Verenigde Staten 28. Deze voorbeelden zouden profiteren van een bench-top microfluïdische apparaat dat dezelfde assay technieken kunnen uitvoeren als een plaatlezer of gel shift assay met lage monstervolume en een fractie van de kosten zonder dat gevoeligheid of specificiteit. Door de vele voordelen van labelvrije elektrochemische detectie, is uitgebreid gebruikt voor de detectie van DNA hybridisatie 29,30. Een opstelling waarbij macroschaal elektroden (in het millimeterbereik) gedompeld in bekers met de oplossing van belang kan worden gebruikt om gevoelige gegevens over de bindingskinetiek van enkelstrengs DNA-sequenties aan hun bijpassende complementaire sequenties verschaffen. Onlangs zijn er een aantal ontwikkelingen in de integratie van elektrochemische sensing in micr geweestofluidics voor DNA hybridisatie. Er zijn studies verricht naar hybridisatiekinetiek 31 en integratie van sensoren voor detectie 15 in microkanalen. Er bestaat echter nog steeds behoefte aan een snelle high throughput microfluïdische apparaat dat kan analyseren DNA hybridisatie in parallel zonder complexe opzuivering.
De in dit werk inrichting een platform dat voor meerdere interacties te screenen in parallel en zonder ingewikkelde opzuivering. Ons protocol presenteert hoe microfluïdisch-gebaseerde elektrochemische biochips worden microfabricated met micro-elektromechanische systemen (MEMS) technologie 32,33. We beschrijven het fabricageproces van zowel de microfluïdische chip, gemaakt van polydimethylsiloxaan (PDMS) en de elektrochemische chip, bestaande uit een reeks elektroden. De chemische functionalisering van de biochip met ssDNA sondes is ook aan de orde. Ten slotte Abilheid van de biosensor specifiek ssDNA targets te detecteren en analyseren wordt aangetoond. Kortom, de microfluïdische gebaseerde elektrochemische biochip is een snelle en high-throughput analysetechniek. Het kan worden gebruikt om de interacties tussen biologische moleculen en houden transducers onderzoeken, en kan worden gebruikt in een verscheidenheid van lab-on-a-chip toepassingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Onze procedures tonen de productie van een-microfluïdische gebaseerd elektrochemische biochip en het gebruik ervan voor DNA hybridisatie analyse. Door een hoge opbrengst gecontroleerde microfabricage te ontwikkelen we een inrichting bestaande uit microschaal kanalen geïntegreerd met een reeks elektrochemische transducers. We hebben gecontroleerde verwerking parameters voor de fotolithografie procedure van de elektrochemische chip en de microfluïdische kanaal mal bedacht door een iteratieve aanpak. Deze stappen geven …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen de Robert W. Deutsch Foundation, het Defense Threat Reduction Agency (DTRA), en de National Science Foundation Emerging Frontiers in onderzoek en innovatie (EFRI) voor financiële steun. De auteurs danken ook de Maryland Nanocenter en het Fablab voor cleanroom faciliteit ondersteuning.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Material | |||
| 4'' Silicon wafer | Ultrasil | 4-5664 | Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm*cm |
| Shipley 1813 photoresist ("PR1") | Microchem | positive photoresist | |
| AZ5214 photoresist ("PR2") | Hoechst Celanse | positive photoresist | |
| SU-8 50 photoresist ("PR3") | Microchem | negative photoresist | |
| Gold etchant | Transene | TFA | No dilution |
| Chromium etchant | Transene | 1020AC | No dilution |
| PDMS elastomer | Dow Corning | 3097366 1004 | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | 3097358 1004 | |
| Biopsy punching tool | Healthlink | BP20 | |
| Tygon flexible tubing | Cole Parmer | R 3603 | .015" |
| Tygon flexible adapter | Cole Parmer | 06417-41 | .0625" |
| 1 mL syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Monobasic potassium phosphate | Fluka | 1551139 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Sigma | RES20765-A7 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine | Aldrich | C4706 | |
| 6-mercapto-1-hexanol | Aldrich | 451088 | |
| 20x concentrated saline-sodium citrate buffer | Sigma | 93017 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Aldrich | 455946 | |
| Sodium ferrocyanide | Aldrich | CDS001589 | |
| Target ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/AAAGCTCCGATAGCGCTCCG TGGACGTCCC-3’ |
| Complementary ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3’ |
| Target ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3’ |
| Complementary ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3’ |
| Target ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3’ |
| Complementary ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3’ |
| Instrument | |||
| Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) | Oxford Instruments | PlasmaLab System 100 | Chamber pressure 1000 mTorr, Tempreture 200 celsius degrees, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Angstrom/minute. |
| DC sputtering unit | AJA International | ATC 1800-V | For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min. |
| E-beam evaporation system | Denton | Custom-built | For Titanium: Chamber pressure <2E-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5k W, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Angstrom/second. For Platinum: Chamber pressure <2E-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5k W, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Angstrom/second. |
| Potentiostat | CH Instruments | 660D | |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS230 |
Referências
- Hong, J., Edel, J. B., deMello, A. J. Micro- and nanofluidic systems for high-throughput biological screening. Drug Discov. Today. 14, 134-146 (2009).
- Sun, Y., Kwok, Y. C. Polymeric microfluidic system for DNA analysis. Anal. Chim. Acta. 556, 80-96 (2006).
- Xu, Y., Yang, X., Wang, E. Review: aptamers in microfluidic chips. Anal. Chim. Acta. 683, 12-20 (2010).
- Yang, W., Woolley, A. T. Integrated multiprocess microfluidic systems for automating analysis. J. Lab. Automat. 15, 198-209 (2010).
- Gervais, T., Jensen, K. F. Mass transport and surface reactions in microfluidic systems. Chem. Eng. Sci. 61, 1102-1121 (2006).
- Song, H., Ismagilov, R. F. Millisecond kinetics on a microfluidic chip using nanoliters of reagents. J. Am. Chem. Soc. 125, 14613-14619 (2003).
- Jiang, H., Weng, X. A., Li, D. Q. Microfluidic whole-blood immunoassays. Microfluid. Nanofluid. 10, 941-964 (2011).
- Dutse, S. W., Yusof, N. A. Microfluidics-based lab-on-chip systems in DNA-based biosensing: an overview. Sensors. 11, 5754-5768 (2011).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 5, 210-218 (2006).
- Craighead, H. Future lab-on-a-chip technologies for interrogating individual molecules. Nature. 442, 387-393 (2006).
- Hunt, H. K., Armani, A. M. Label-free biological and chemical sensors. Nanoscale. 2, 1544-1559 (2010).
- Dukkipati, V. R., Pang, S. W. Integrated microfluidic system for DNA analysis. IEEE-NANO 2006. Sixth IEEE Conference on Nanotechnology. 1, 162-165 (2006).
- Fang, T. H., et al. Real-time PCR microfluidic devices with concurrent electrochemical detection. Biosens. Bioelectron. 24, 2131-2136 (2009).
- Pavlovic, E., et al. Microfluidic device architecture for electrochemical patterning and detection of multiple DNA sequences. Langmuir. 24, 1102-1107 (2008).
- Xu, X., Zhang, S., Chen, H., Kong, J. Integration of electrochemistry in micro-total analysis systems for biochemical assays: recent developments. Talanta. 80, 8-18 (2009).
- Cai, H., Lee, T. M. -. H., Hsing, I. M. Label-free protein recognition using an aptamer-based impedance measurement assay. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 433-437 (2006).
- Iliescu, C., Poenar, D. P., Carp, M., Loe, F. C. A Microfluidic device for impedance spectroscopy analysis of biological samples. Sensor. Actuat. B-Chem. 123, 168-176 (2007).
- Prakash, S. B., Abshire, P. Tracking cancer cell proliferation on a CMOS capacitance sensor chip. Biosens. Bioelectron. 23, 1449-1457 (2008).
- Yamaguchi, A., et al. Rapid fabrication of electrochemical enzyme sensor chip using polydimethylsiloxane microfluidic channel. Anal. Chim. Acta. 468, 143-152 (2002).
- Beebe, D. J., Mensing, G. A., Walker, G. M. Physics and applications of microfluidics in biology. Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 261-286 (2002).
- Mariella, R. Sample preparation: the weak link in microfluidics-based biodetection. Biomed. Microdevices. 10, 777-784 (2008).
- Bhushan, B. . Springer handbook of nanotechnology. , (2010).
- Ghallab, Y. H., Badawy, W. . Lab-on-a-chip: Techniques, circuits, and biomedical applications. , (2010).
- Chee, M., et al. Accessing genetic information with high-density DNA arrays. Science. 25, 610-614 (1996).
- Ma, K. -. S., Zhou, H., Zoval, J., Madou, M. DNA hybridization detection by label free versus impedance amplifying label with impedance spectroscopy. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 58-64 (2006).
- Ito, T., Hosokawa, K., Maeda, M. Detection of single-base mismatch at distal end of DNA duplex by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 22, 1816-1819 (2007).
- Kao, L. T. -. H., et al. Multiplexed detection and differentiation of the DNA strains for influenza A (H1N1 2009) using a silicon-based microfluidic system. Biosens. Bioelectron. 26, 2006-2011 (2011).
- Li, J., Chen, S., Evans, D. H. Typing and subtyping influenza virus using DNA microarrays and multiplex reverse transcriptase PCR. J. Clin. Microbiol. 39, 696-704 (2001).
- Gautier, C., et al. Hybridization-induced interfacial changes detected by non-faradaic impedimetric measurements compared to faradaic approach. J. Electroanal. Chem. 610, 227-233 (2007).
- Ma, Y., Jiao, K., Yang, T., Sun, D. Sensitive PAT gene sequence detection by nano-SiO2/p-aminothiophenol self-assembled films DNA electrochemical biosensor based on impedance measurement. Sensor. Actuat. B-Chem. 131, 565-571 (2008).
- Kim, J. H. -. S., Marafie, A., Jia, X. -. Y., Zoval, J. V., Madou, M. J. Characterization of DNA hybridization kinetics in a microfluidic flow channel. Sensor. Actuat. B-Chem. 113, 281-289 (2006).
- Dykstra, P. H., Roy, V., Byrd, C., Bentley, W. E., Ghodssi, R. Microfluidic electrochemical sensor array for characterizing protein interactions with various functionalized surfaces. Anal. Chem. 83, 5920-5927 (2011).
- Ben-Yoav, H., Dykstra, P. H., Bentley, W. E., Ghodssi, R. A Microfluidic-based electrochemical biochip for label-free diffusion-restricted DNA hybridization analysis. Biosens. Bioelectron. 38, 114-120 (2012).
- Wink, T., van Zuilen, S. J., Bult, A., van Bennekom, W. P. Self-assembled monolayers for biosensors. Analyst. 122, 43R-50R (1997).
- McEwen, G. D., Chen, F., Zhou, A. Immobilization, hybridization, and oxidation of synthetic DNA on gold surface: Electron transfer investigated by electrochemistry and scanning tunneling microscopy. Anal. Chim. Acta. 643, 26-37 (2009).
- Arinaga, K., Rant, U., Tornow, M., Fujita, S., Abstreiter, G., Yokoyama, N. The role of surface charging during the coadsorption of mercaptohexanol to DNA layers on gold: Direct observation of desorption and layer reorientation. Langmuir. 22, 5560-5562 (2006).
- Katz, E., Willner, I. Probing biomolecular interactions at conductive and semiconductive surfaces by impedance spectroscopy: Routes to impedimetric immunosensors, DNA-sensors, and enzyme biosensors. Electroanalysis. 15, 913-947 (2003).
