ラベルフリーDNAハイブリダイゼーション分析のためのマイクロ流体ベースの電気化学バイオチップ
Summary
私たちは、DNAハイブリダイゼーション検出のためのマイクロ流体ベースの電気化学バイオチップを提供する。のssDNAプローブ官能化に続いて、特異性、感度、および検出限界は、相補的および非相補的なssDNA標的と研究されている。結果は、3.8 nMでの検出限界で、電気化学システム上のDNAハイブリダイゼーション事象の影響を例示する。
Abstract
マイクロスケールに分析ベンチトップ手順の小型化、反応時間、コスト、及び前処理ステップの統合に関して有意な利点を提供する。それはポイント·オブ·ケア各種疾患のバイオマーカーでのリアルタイム評価のための技術を提供するためのDNAハイブリダイゼーション事象の解析に向けて、これらのデバイスを利用することが重要です。しかし、デバイスのフットプリントは、さまざまな物理現象の増加優位性を低下させる。これらの現象は、加工精度や装置の動作信頼性に影響を与える。したがって、正確な全体的なパフォーマンスを改善するために、再現可能な方法でこれらのデバイスを製造し操作する大きな必要性がある。ここでは、プロトコルおよび製造およびDNAハイブリダイゼーション事象の正確な分析のためのマイクロ流体ベースの電気化学バイオチップの動作に用いられる方法を記載する。バイオチップは2つの部分から構成されています。マイクロ流体チップを搭載した3ポリジメチルシロキサン（PDMS）からなる平行マイクロチャネル、及び3×3配列の電気化学的マイクロチップ。 DNAハイブリダイゼーション事象は、電気化学インピーダンス分光法（EIS）分析を用いて検出される。 EISの分析は、これらの長さスケールでの支配的な電気化学システムのプロパティの監視のバリエーションを可能にします。バイオセンサーの両方の電荷移動と拡散抵抗の変化をモニターする能力によって、私達は20分以下、相補鎖DNA標的に対する選択性は3.8 nMでの計算された検出限界、および他の非相補的ssDNAを13％の交差反応性を実証インキュベーション。この方法は、マイクロスケールの領域における拡散の挙動に解明することによって、およびDNAハイブリダイゼーション事象の研究を可能にすることによって、小型化デバイスの性能を向上させることができる。
Introduction
マイクロ流体ラボ·オン·チップ（LOC）のデバイスは、臨床診断、環境モニタリングおよび生物医学研究に多くの利点を提供する。これらのデバイスは、処置の多様な試薬の混 合、結合ベースの親和性、シグナル伝達、および細胞培養を含む1-4に行うことができるチップの領域に流体の流れを制御するためのマイクロ流体チャネルを利用する。マイクロフルイディクスは、マイクロウェルプレートリーダーまたは電気泳動ゲルシフトアッセイのような従来の臨床診断ツールに比べて多くの利点を提供します。マイクロ流体デバイスは、同様のアッセイを実行するために大きさの2から3桁（マイクロリットルとは対照的にナノリットル）より少ない試薬を必要とします。また、これらのデバイスは、いくつかの生物学的事象は、チャネル5,6内の種の小さい閉じ込めに起因し発生することにより、速度を増加させることができる。第三に、センサは、無標識detectioを提供することができるリソグラフィ及びエッチング技術を用いて、マイクロ流体デバイス内に統合することができる。nは。最後に、これらのデバイスは製造が安価であり、7〜10を動作させるために、技術者の一部にはほとんどの作業を必要とします。
ラベルフリー検出は、典型的には、光学的または電気的変換器を用いて行われる。光デバイスが原因サンプル中の分析でより低い干渉により良いセンシング性能を提示することができます。それにもかかわらず、その性能は、サンプルのバックグラウンドは、センサ11と同じ共振波長を有する場合において損なわれる。マイクロ流体システムにおいて生物学的および化学的検出を行うために電気信号を使用することには多くの利点がある。これらのセンサは、一般的にのみ作動するようにパターニングされた電極を必要とするため製造が本質的にあまり複雑である。他の信号のモダリティは、信号12-15に変換するための変換器が必要になることがありながら、また、電気信号は、直接、ほとんどの測定機器とインターフェースすることができます。電気センサーは、一般的にimpedancの変化を測定電子16,17、容量18、またはレドックス活性が19。これらのシステムは小型化されるが、新たな課題が提示される。克服すべき最も重要な課題は、（低いサンプル体積及びレイノルズ数に対する）流体の試料調製、混合、（建設資材と分析物との間の毛管力、表面粗さ、化学的相互作用を含む）の物理的及び化学的効果、低い信号 – を20-23、複雑な生物学的サンプル（ 例えば 、血液および唾液）における電気活性分析物からの潜在的な干渉（縮小表面積および体積によって生成される）信号対雑音比。これらの効果の詳しい調査の結果、彼らの全体的なパフォーマンスを改善だろ再現可能な方法で、これらのデバイスの正確な製造および操作のためのガイドラインになります。
DNAハイブリダイゼーションの検出は、遺伝性疾患24,25とCANCのさまざまな形態を診断するために広く使用されているえー26。毎年、インフルエンザの複数の株は、DNAハイブリダイゼーション技術27からの結果を使用している患者において同定される。インフルエンザウイルスは、米国だけで28人が死亡、毎年36,000を占めています。このような例としては、感度または特異性を犠牲にすることなく低いサンプル体積とし、わずかなコストでプレートリーダーまたはゲルシフトアッセイと同じアッセイ技術を実行することができるベンチトップマイクロ流体デバイスから利益を得ることができる。によるラベルフリー電気化学センシングの多くの利点には、DNAハイブリダイゼーション事象29,30の検出のために広く使用されている。 （ミリメートルの範囲内）マクロスケール電極が関心の溶液ビーカー中に浸漬されている設定は、それらの一致する相補的配列への一本鎖DNA配列の結合キネティクスに関する非常に機密性の高いデータを提供するために使用することができる。最近では、MICR電気化学センシングを組み込んでも数少ない進歩があったDNAハイブリダイゼーションのためのofluidics。研究は、ハイブリダイゼーション動力学31とマイクロ流体チャネルにおける検出するためのセンサ15の統合に関して行われてきた。しかし、依然として複雑な試料調製工程なしで並列にDNAハイブリダイゼーション事象を分析することができる迅速なハイスループットマイクロ流体装置の必要性が存在する。
この研究で提示デバイスは、複数の相互作用が並行して、複雑な試料調製工程なしでスクリーニングされるのを可能にするプラットフォームを提供する。私たちのプロトコルは、電気化学バイオチップは、微小電気機械システム（MEMS）技術32,33で微細加工されているかを、マイクロ流体ベースの紹介。私たちは、ポリジメチルシロキサン（PDMS）製のマイクロ流体チップ、および電極のアレイで構成される電気化学チップ、両方の製造プロセスを説明する。一本鎖DNAプローブを用いたバイオチップの化学的機能も対処される。最後に、ABIL具体的なssDNA標的を検出および分析するためのバイオセンサーのITYが実証される。全体的に、マイクロ流体ベースの電気化学バイオチップは、迅速かつハイスループット分析技術である。これは、生物学的分子と導電性の変換器間の相互作用を調査するために使用することができ、ラボオンチップ、さまざまな用途に利用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
私たちの手順は、マイクロ流体ベースの電気化学バイオチップの製造およびDNAハイブリダイゼーション事象の分析のためのその利用を実証する。高収量制御微細加工プロセスを通して、私たちは、電気化学変換器のアレイに統合マイクロスケールチャネルから構成デバイスを開発しています。私たちは、反復的なアプローチを通じて、電気化学チップとマイクロ流体チャネル型のフォトリソ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、財政支援のためにロバート·W·ドイツ財団、防衛脅威削減局（DTRA）、研究とイノベーションの国立科学財団新興フロンティア（EFRI）を認める。著者はまた、クリーンルーム施設のサポートのためにメリーランド州NanocenterとそのFablabに感謝します。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Material | |||
| 4'' Silicon wafer | Ultrasil | 4-5664 | Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm*cm |
| Shipley 1813 photoresist ("PR1") | Microchem | positive photoresist | |
| AZ5214 photoresist ("PR2") | Hoechst Celanse | positive photoresist | |
| SU-8 50 photoresist ("PR3") | Microchem | negative photoresist | |
| Gold etchant | Transene | TFA | No dilution |
| Chromium etchant | Transene | 1020AC | No dilution |
| PDMS elastomer | Dow Corning | 3097366 1004 | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | 3097358 1004 | |
| Biopsy punching tool | Healthlink | BP20 | |
| Tygon flexible tubing | Cole Parmer | R 3603 | .015" |
| Tygon flexible adapter | Cole Parmer | 06417-41 | .0625" |
| 1 mL syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Monobasic potassium phosphate | Fluka | 1551139 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Sigma | RES20765-A7 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine | Aldrich | C4706 | |
| 6-mercapto-1-hexanol | Aldrich | 451088 | |
| 20x concentrated saline-sodium citrate buffer | Sigma | 93017 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Aldrich | 455946 | |
| Sodium ferrocyanide | Aldrich | CDS001589 | |
| Target ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/AAAGCTCCGATAGCGCTCCG TGGACGTCCC-3’ |
| Complementary ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3’ |
| Target ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3’ |
| Complementary ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3’ |
| Target ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3’ |
| Complementary ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3’ |
| Instrument | |||
| Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) | Oxford Instruments | PlasmaLab System 100 | Chamber pressure 1000 mTorr, Tempreture 200 celsius degrees, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Angstrom/minute. |
| DC sputtering unit | AJA International | ATC 1800-V | For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min. |
| E-beam evaporation system | Denton | Custom-built | For Titanium: Chamber pressure <2E-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5k W, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Angstrom/second. For Platinum: Chamber pressure <2E-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5k W, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Angstrom/second. |
| Potentiostat | CH Instruments | 660D | |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS230 |
Referências
- Hong, J., Edel, J. B., deMello, A. J. Micro- and nanofluidic systems for high-throughput biological screening. Drug Discov. Today. 14, 134-146 (2009).
- Sun, Y., Kwok, Y. C. Polymeric microfluidic system for DNA analysis. Anal. Chim. Acta. 556, 80-96 (2006).
- Xu, Y., Yang, X., Wang, E. Review: aptamers in microfluidic chips. Anal. Chim. Acta. 683, 12-20 (2010).
- Yang, W., Woolley, A. T. Integrated multiprocess microfluidic systems for automating analysis. J. Lab. Automat. 15, 198-209 (2010).
- Gervais, T., Jensen, K. F. Mass transport and surface reactions in microfluidic systems. Chem. Eng. Sci. 61, 1102-1121 (2006).
- Song, H., Ismagilov, R. F. Millisecond kinetics on a microfluidic chip using nanoliters of reagents. J. Am. Chem. Soc. 125, 14613-14619 (2003).
- Jiang, H., Weng, X. A., Li, D. Q. Microfluidic whole-blood immunoassays. Microfluid. Nanofluid. 10, 941-964 (2011).
- Dutse, S. W., Yusof, N. A. Microfluidics-based lab-on-chip systems in DNA-based biosensing: an overview. Sensors. 11, 5754-5768 (2011).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 5, 210-218 (2006).
- Craighead, H. Future lab-on-a-chip technologies for interrogating individual molecules. Nature. 442, 387-393 (2006).
- Hunt, H. K., Armani, A. M. Label-free biological and chemical sensors. Nanoscale. 2, 1544-1559 (2010).
- Dukkipati, V. R., Pang, S. W. Integrated microfluidic system for DNA analysis. IEEE-NANO 2006. Sixth IEEE Conference on Nanotechnology. 1, 162-165 (2006).
- Fang, T. H., et al. Real-time PCR microfluidic devices with concurrent electrochemical detection. Biosens. Bioelectron. 24, 2131-2136 (2009).
- Pavlovic, E., et al. Microfluidic device architecture for electrochemical patterning and detection of multiple DNA sequences. Langmuir. 24, 1102-1107 (2008).
- Xu, X., Zhang, S., Chen, H., Kong, J. Integration of electrochemistry in micro-total analysis systems for biochemical assays: recent developments. Talanta. 80, 8-18 (2009).
- Cai, H., Lee, T. M. -. H., Hsing, I. M. Label-free protein recognition using an aptamer-based impedance measurement assay. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 433-437 (2006).
- Iliescu, C., Poenar, D. P., Carp, M., Loe, F. C. A Microfluidic device for impedance spectroscopy analysis of biological samples. Sensor. Actuat. B-Chem. 123, 168-176 (2007).
- Prakash, S. B., Abshire, P. Tracking cancer cell proliferation on a CMOS capacitance sensor chip. Biosens. Bioelectron. 23, 1449-1457 (2008).
- Yamaguchi, A., et al. Rapid fabrication of electrochemical enzyme sensor chip using polydimethylsiloxane microfluidic channel. Anal. Chim. Acta. 468, 143-152 (2002).
- Beebe, D. J., Mensing, G. A., Walker, G. M. Physics and applications of microfluidics in biology. Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 261-286 (2002).
- Mariella, R. Sample preparation: the weak link in microfluidics-based biodetection. Biomed. Microdevices. 10, 777-784 (2008).
- Bhushan, B. . Springer handbook of nanotechnology. , (2010).
- Ghallab, Y. H., Badawy, W. . Lab-on-a-chip: Techniques, circuits, and biomedical applications. , (2010).
- Chee, M., et al. Accessing genetic information with high-density DNA arrays. Science. 25, 610-614 (1996).
- Ma, K. -. S., Zhou, H., Zoval, J., Madou, M. DNA hybridization detection by label free versus impedance amplifying label with impedance spectroscopy. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 58-64 (2006).
- Ito, T., Hosokawa, K., Maeda, M. Detection of single-base mismatch at distal end of DNA duplex by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 22, 1816-1819 (2007).
- Kao, L. T. -. H., et al. Multiplexed detection and differentiation of the DNA strains for influenza A (H1N1 2009) using a silicon-based microfluidic system. Biosens. Bioelectron. 26, 2006-2011 (2011).
- Li, J., Chen, S., Evans, D. H. Typing and subtyping influenza virus using DNA microarrays and multiplex reverse transcriptase PCR. J. Clin. Microbiol. 39, 696-704 (2001).
- Gautier, C., et al. Hybridization-induced interfacial changes detected by non-faradaic impedimetric measurements compared to faradaic approach. J. Electroanal. Chem. 610, 227-233 (2007).
- Ma, Y., Jiao, K., Yang, T., Sun, D. Sensitive PAT gene sequence detection by nano-SiO2/p-aminothiophenol self-assembled films DNA electrochemical biosensor based on impedance measurement. Sensor. Actuat. B-Chem. 131, 565-571 (2008).
- Kim, J. H. -. S., Marafie, A., Jia, X. -. Y., Zoval, J. V., Madou, M. J. Characterization of DNA hybridization kinetics in a microfluidic flow channel. Sensor. Actuat. B-Chem. 113, 281-289 (2006).
- Dykstra, P. H., Roy, V., Byrd, C., Bentley, W. E., Ghodssi, R. Microfluidic electrochemical sensor array for characterizing protein interactions with various functionalized surfaces. Anal. Chem. 83, 5920-5927 (2011).
- Ben-Yoav, H., Dykstra, P. H., Bentley, W. E., Ghodssi, R. A Microfluidic-based electrochemical biochip for label-free diffusion-restricted DNA hybridization analysis. Biosens. Bioelectron. 38, 114-120 (2012).
- Wink, T., van Zuilen, S. J., Bult, A., van Bennekom, W. P. Self-assembled monolayers for biosensors. Analyst. 122, 43R-50R (1997).
- McEwen, G. D., Chen, F., Zhou, A. Immobilization, hybridization, and oxidation of synthetic DNA on gold surface: Electron transfer investigated by electrochemistry and scanning tunneling microscopy. Anal. Chim. Acta. 643, 26-37 (2009).
- Arinaga, K., Rant, U., Tornow, M., Fujita, S., Abstreiter, G., Yokoyama, N. The role of surface charging during the coadsorption of mercaptohexanol to DNA layers on gold: Direct observation of desorption and layer reorientation. Langmuir. 22, 5560-5562 (2006).
- Katz, E., Willner, I. Probing biomolecular interactions at conductive and semiconductive surfaces by impedance spectroscopy: Routes to impedimetric immunosensors, DNA-sensors, and enzyme biosensors. Electroanalysis. 15, 913-947 (2003).
