Un biochip electroquímico basado en microfluidos para el análisis de hibridación ADN-Label libre
Summary
Se presenta un biochip electroquímico basado en microfluídico para la detección de la hibridación de ADN. Tras ssDNA sonda funcionalización, la especificidad, sensibilidad y límite de detección se estudian con objetivos ssDNA complementarias y no complementarias. Resultados ilustran la influencia de los eventos de hibridación de ADN en el sistema electroquímico, con un límite de detección de 3,8 nM.
Abstract
La miniaturización de los procedimientos analíticos de sobremesa en la escala micro proporciona ventajas significativas en cuanto a tiempo de reacción, el coste, y la integración de las etapas de pre-procesamiento. La utilización de estos dispositivos hacia el análisis de los eventos de hibridación de ADN es importante porque ofrece una tecnología para la evaluación en tiempo real de los biomarcadores en el punto de atención para diversas enfermedades. Sin embargo, cuando la huella dispositivo disminuye el dominio de diversas ampliaciones de los fenómenos físicos. Estos fenómenos influyen en la precisión de fabricación y fiabilidad de funcionamiento del dispositivo. Por lo tanto, hay una gran necesidad de fabricar con precisión y operar estos dispositivos en una manera reproducible con el fin de mejorar el rendimiento global. A continuación, describimos los protocolos y los métodos utilizados para la fabricación y el funcionamiento de un biochip electroquímico basado en microfluidos para el análisis preciso de los eventos de hibridación de ADN. El biochip se compone de dos partes: un chip de microfluidos contres micro-canales paralelos hechos de polidimetilsiloxano (PDMS), y un Arrayed electroquímica micro-chip de 3 x 3. Los eventos de hibridación de ADN se detectan usando un análisis de espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS). El análisis EIS permite monitoreo de las variaciones de las propiedades del sistema electroquímico que son dominantes en estas escalas de longitud. Con la capacidad para monitorizar los cambios tanto de transferencia de carga y la resistencia difusional con el biosensor, se demuestra la selectividad a los objetivos de ADNss complementarios, un límite de detección calculado de 3,8 nM, y una reactividad cruzada del 13% con otros ssDNA no complementaria siguiente 20 min de incubación. Esta metodología puede mejorar el rendimiento de dispositivos miniaturizados por elucidar sobre el comportamiento de la difusión en el régimen de micro-escala y al permitir el estudio de los acontecimientos de hibridación de ADN.
Introduction
Lab-on-a-chip de microfluidos dispositivos (LOC) proporciona numerosas ventajas en el diagnóstico clínico, monitoreo ambiental y la investigación biomédica. Estos dispositivos utilizan canales de microfluidos para controlar el flujo de fluido a las regiones del chip donde una variedad de procedimientos puede tener lugar incluida la mezcla de reactivo, de afinidad basada en la unión, transducción de señales, y la célula de cultivo de 1-4. Microfluídica proporciona muchas ventajas sobre las herramientas de diagnóstico clínicos convencionales, tales como lectores de placas de micropocillos o ensayos de cambio de gel electroforético. Los dispositivos microfluídicos requieren de 2 a 3 órdenes de magnitud (nanolitros en oposición a microlitros) menos reactivos para llevar a cabo ensayos similares. Además, estos dispositivos pueden aumentar la velocidad por la cual algunos eventos biológicos se producen debido al confinamiento más pequeña de las especies dentro de los canales 5,6. En tercer lugar, los sensores pueden ser integrados dentro de los dispositivos de microfluidos que utilizan técnicas de litografía y aguafuerte, que pueden proporcionar Detectio sin etiquetasn. Por último, estos dispositivos son baratos de producir y requieren poco trabajo por parte del técnico para operar 7-10.
Detección libre de etiquetas típicamente se realiza usando un transductor óptico o eléctrico. Los dispositivos ópticos pueden presentar un mejor rendimiento de detección debido a la interferencia menor con analitos en la muestra. Sin embargo, su rendimiento se ve comprometida en los casos en que el fondo de la muestra tiene la misma longitud de onda de resonancia como el sensor 11. Hay muchas ventajas de utilizar las señales eléctricas para realizar la detección química y biológica en los sistemas de microfluidos. La fabricación es inherentemente menos complicado ya que estos sensores por lo general sólo requieren electrodos estampados para operar. Además, las señales eléctricas pueden conectarse directamente con la mayoría del equipo de medición, mientras que otras modalidades de señal pueden requerir un transductor para convertir la señal 12-15. Sensores eléctricos comúnmente medir los cambios en impedance 16,17, capacitancia 18, o redox actividad 19. Sin embargo, nuevos desafíos se presentan como estos sistemas son miniaturizados. Los retos más importantes para superar incluyen: preparación de la muestra y la mezcla de fluidos (debido a el volumen de muestra bajo y el número de Reynolds), efectos físicos y químicos (incluyendo las fuerzas capilares, rugosidad de la superficie, las interacciones químicas entre los materiales de construcción y analitos), bajo señalización relación a ruido (producido por el área reducida de la superficie y volumen) 20-23, y la interferencia potencial de analitos electro-activas en muestras biológicas complejas (por ejemplo, de sangre y de saliva). Investigaciones posteriores de estos efectos se traducirá en las directrices para una fabricación precisa y manejo de estos dispositivos de una manera reproducible que mejoren en su desempeño general.
Detección de la hibridación de ADN se utiliza ampliamente para diagnosticar trastornos genéticos 24,25 y diversas formas de Cancer 26. Cada año, varias cepas de la gripe se identifican en los pacientes que utilizan los resultados de las técnicas de hibridación de ADN 27. El virus de la gripe por sí sola representa 36.000 muertes cada año en los Estados Unidos 28. Tales ejemplos podrían beneficiarse de un dispositivo de sobremesa de microfluidos que puede realizar las mismas técnicas de ensayo como un ensayo de desplazamiento en gel de lector de placas o con bajo volumen de muestra y en una fracción del costo sin sacrificar la sensibilidad o especificidad. Debido a las muchas ventajas de detección electroquímica libre de etiquetas, se ha utilizado ampliamente para la detección de eventos de hibridación de ADN 29,30. Una configuración donde los electrodos escala macro (en el rango de milímetros) se sumergen en vasos de precipitados con la solución de interés puede ser utilizado para proporcionar datos muy sensibles con respecto a la cinética de unión de secuencias de ADN de cadena sencilla a sus emparejan secuencias complementarias. Recientemente, ha habido algunos avances en la incorporación de la detección electroquímica en microfluidics para la hibridación de ADN. Se han realizado estudios en relación con la cinética de hibridación 31 y la integración de sensores para la detección de 15 en los canales de microfluidos. Sin embargo, todavía existe una necesidad de un dispositivo de microfluidos rápida de alto rendimiento que puede analizar los eventos de hibridación de ADN en paralelo sin complicados pasos de preparación de muestras.
El dispositivo se presenta en este trabajo proporciona una plataforma que permite múltiples interacciones que se proyectarán en paralelo y sin complicados pasos de preparación de muestras. Nuestro protocolo presenta la forma de microfluidos basada en biochips electroquímicos se microfabricados con la tecnología de sistemas micro-electromecánicos (MEMS) 32,33. Se describe el proceso de fabricación tanto del chip de microfluidos, hecho de polidimetilsiloxano (PDMS), y el chip electroquímica, compuesto por una matriz de electrodos. La funcionalización química del biochip con ssDNA sondas también se aborda. Finalmente, el Abildad del biosensor para detectar específicamente y analizar los objetivos de ssDNA se demuestra. En general, el biochip electroquímico basado en microfluidos es una técnica rápida y el análisis de alto rendimiento. Se puede utilizar para investigar las interacciones entre moléculas biológicas y transductores de conductores, y se puede utilizar en una variedad de aplicaciones de laboratorio en un chip.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nuestros procedimientos demuestran la fabricación de un biochip electroquímico basado en microfluidos y su utilización para el análisis de los eventos de hibridación de ADN. A través de un proceso de microfabricación de alto rendimiento controlada desarrollamos un dispositivo compuesto por canales microescala integrados con una serie de transductores electroquímicos. Hemos ideado parámetros de procesamiento controlados para el procedimiento de fotolitografía del chip electroquímica y el molde a través de un …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen la Fundación Robert W. Deutsch, la Agencia de Reducción de Amenazas de Defensa (DTRA), y la Fundación Nacional de Ciencias Emergentes Fronteras en la Investigación y la Innovación (EFRI) para el apoyo financiero. Los autores también agradecen a la Maryland NanoCenter y su FabLab apoyo instalación de salas limpias.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Material | |||
| 4'' Silicon wafer | Ultrasil | 4-5664 | Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm*cm |
| Shipley 1813 photoresist ("PR1") | Microchem | positive photoresist | |
| AZ5214 photoresist ("PR2") | Hoechst Celanse | positive photoresist | |
| SU-8 50 photoresist ("PR3") | Microchem | negative photoresist | |
| Gold etchant | Transene | TFA | No dilution |
| Chromium etchant | Transene | 1020AC | No dilution |
| PDMS elastomer | Dow Corning | 3097366 1004 | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | 3097358 1004 | |
| Biopsy punching tool | Healthlink | BP20 | |
| Tygon flexible tubing | Cole Parmer | R 3603 | .015" |
| Tygon flexible adapter | Cole Parmer | 06417-41 | .0625" |
| 1 mL syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Monobasic potassium phosphate | Fluka | 1551139 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Sigma | RES20765-A7 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine | Aldrich | C4706 | |
| 6-mercapto-1-hexanol | Aldrich | 451088 | |
| 20x concentrated saline-sodium citrate buffer | Sigma | 93017 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Aldrich | 455946 | |
| Sodium ferrocyanide | Aldrich | CDS001589 | |
| Target ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/AAAGCTCCGATAGCGCTCCG TGGACGTCCC-3’ |
| Complementary ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3’ |
| Target ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3’ |
| Complementary ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3’ |
| Target ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3’ |
| Complementary ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3’ |
| Instrument | |||
| Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) | Oxford Instruments | PlasmaLab System 100 | Chamber pressure 1000 mTorr, Tempreture 200 celsius degrees, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Angstrom/minute. |
| DC sputtering unit | AJA International | ATC 1800-V | For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min. |
| E-beam evaporation system | Denton | Custom-built | For Titanium: Chamber pressure <2E-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5k W, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Angstrom/second. For Platinum: Chamber pressure <2E-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5k W, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Angstrom/second. |
| Potentiostat | CH Instruments | 660D | |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS230 |
Referências
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