Stratégies pour le suivi Anastasis, une cellule de survie Phénomène qui renverse apoptose

Summary

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

Abstract

Anastasis (grec pour «la hausse à la vie») fait référence à la récupération des cellules mourantes. Avant que ces cellules se rétablissent, ils sont passés par des points de contrôle importants de l'apoptose, y compris la fragmentation mitochondriale, la libération du cytochrome c mitochondrial dans le cytosol, l'activation des caspases, la condensation de la chromatine, des dommages de l'ADN, la fragmentation nucléaire, bourgeonnement de la membrane plasmique, le rétrécissement des cellules, l'exposition de la surface cellulaire de phosphatidylsérine, et la formation de corps apoptotiques. Anastasis peut se produire lorsque les stimuli apoptotiques sont retirés avant la mort, permettant ainsi cellules mourantes pour inverser l'apoptose et potentiellement d'autres mécanismes de mort. Par conséquent, Anastasis semble impliquer des processus physiologiques de guérison qui pourrait également soutenir les cellules endommagées de façon inappropriée. Les fonctions et les mécanismes de Anastasis sont pas encore claires, entravée en partie par les outils limités pour détecter les événements passés après la récupération des cellules apparemment en bonne santé. Stratégies pour détecter AnastaSIS permettra des études sur les mécanismes physiologiques, les dangers de cellules morts-vivants dans la pathologie de la maladie, et des thérapies potentielles pour moduler Anastasis. Ici, nous décrivons des stratégies efficaces en utilisant la microscopie de cellules vivantes et un biocapteur de caspase mammifère pour l'identification et le suivi Anastasis dans des cellules mammifères.

Introduction

Apoptose (grec pour «tomber à la mort") est généralement supposé être un processus à sens unique se terminant par suicide cellulaire ^1-7. La perturbation génétique de gènes pro-mort conduit à la survie des cellules supplémentaires qui seraient autrement mourir dans des animaux entiers, y compris des cellules qui ont déjà ouvert la voie de ^8,9 apoptose. De même, les manipulations génétiques permettent aux cellules de mammifères en bonne santé qui affichent artificiellement "Eat Me" signaux ou qui perdent leur adhérence à la matrice extracellulaire pour échapper à la mort par phagocytose de cellules entières ou entose respectivement ^10,11. Cependant, nous et d'autres avons montré que, sans manipulation génétique des cellules de mammifères sains et de lignées cellulaires peuvent également récupérer dès les premiers stades de l'apoptose ^12-15. Utilisation d'outils pour suivre des cellules individuelles, nous avons encore démontré la récupération de stades tardifs de l'apoptose ^12,13, après que les cellules ont passé les postes de contrôle important que typiqueLy marquer le «point de non-retour" ^2-6. Ces points de contrôle de l'apoptose au stade avancé comprennent la libération du cytochrome c mitochondrial, l'activation des caspases, la fragmentation nucléaire, et la formation de corps apoptotiques. Nous avons adopté un mot composé grec "Anastasis", qui signifie "la hausse à la vie", pour décrire ce renversement de l'apoptose au bord de la mort cellulaire ^2-6.

Sauf tout le processus de recouvrement des mourants est observé par imagerie des cellules vivantes, il est difficile de distinguer les cellules qui ont subi Anastasis partir de cellules qui ne ont jamais connu les événements apoptotiques. Des décennies de travail ont révélé que les caractéristiques morphologiques de suicide cellulaire par apoptose sont entraînés par des événements biochimiques et moléculaires évolutives conservées ^16-19. Ces événements favorisent l'auto-destruction des cellules pour réguler les processus de développement et homéostatiques dans les organismes unicellulaires et multicellulaires en éliminant endommagé ou dcellules angerous ^16-19. Alors que les cellules apoptotiques peuvent être facilement distingués par des manifestations morphologiques, biochimiques et moléculaires de l'apoptose ^1,5,6,16,20 standardisés, il ne existe actuellement aucun marqueur spécifique connue Anastasis ^12,13. Fait important, les cellules qui ont subi anastasis semblent être les cellules saines normales et des cellules qui commencent juste inverser l'apoptose des cellules mourantes apparaître comme apoptotiques ^12,13. Ainsi, de nouveaux outils sont nécessaires pour conclure avec certitude qu'une cellule donnée survivant avait déjà connu des processus apoptotiques actifs.

L'apoptose est généralement admis comme une cascade irréversible parce que ce est un processus de destruction rapide et massive. Bien qu'il pourrait prendre quelques minutes à quelques jours pour certaines cellules pour initier l'apoptose, une fois mitochondries ont publié facteurs tels que apoptogènes cytochrome c dans le cytosol ^21,22, caspases peuvent être activées dans les 5 minutes ^23,24, suivis par cytoplasmique etcondensation nucléaire dans les 10 minutes ^{de 25 à 27,} et la mort cellulaire peu après ^25-27. Les caspases activées orchestrent l'apoptose par clivage et en inactivant des composants structuraux et fonctionnels clés dans le but de démolition ^2,28 cellulaire, tel que l'inhibiteur d'endonucléase DFF45 / CISD ^29,30. Caspases activent également des facteurs pro-apoptotiques, comme famille Bcl-2 BID membre, qui translocation vers les mitochondries pour favoriser la libération du cytochrome c mitochondrial ^31,32. l'activité de la caspase résulte également dans la cellule exposition de la surface de la phosphatidylsérine comme un signal "me manger" pour la promotion de l'engloutissement de mourir cellules par les macrophages ou les cellules voisines par phagocytose ^33. En outre, les événements apoptotiques rendent la dysfonction mitochondriale, perturbant bioénergétique cellulaire et métabolisme ^34,35,36. Ainsi, la récupération de cette destruction semble intuitivement peu probable.

Contrairement à l'original se attendretions, les cellules peuvent inverser le processus de mort cellulaire par apoptose, même à un stade tardif. En surveillant en permanence le sort de mourir des cellules en culture, nous avons observé la réversibilité de l'apoptose de stade tardif dans une plage de cellules primaires et des lignées cellulaires ^12,13. L'élimination du stimulus de mort a permis la récupération des éléments visibles de l'apoptose, telles que fragmentation mitochondriale, de la condensation de la chromatine, des dommages de l'ADN, le plasma membrane bourgeonnement, l'exposition de la surface cellulaire de la phosphatidylsérine, la libération du cytochrome c mitochondrial, l'activation des caspases, la fragmentation nucléaire, rétrécissement des cellules, et la formation de corps apoptotiques. Ces observations soulèvent des questions sans réponses concernant les fonctions, les conséquences et les mécanismes de Anastasis. Pour répondre à ces questions, une condition préalable est d'identifier de manière fiable des cellules qui ont subi Anastasis. Ici, nous décrivons des méthodes de microscopie vivants et un biocapteur de caspase pour détecter des cellules qui ont déjà inversé apoptose et e de stade tardifen survécu.

Protocol

1. Préparation des cellules pour imagerie de cellules vivantes Pour faciliter la détection des changements morphologiques, pour choisir des cellules adhérentes telles que HeLa (carcinome cervical humain) des cellules qui sont à plat sur le substrat afin de mieux visualiser l'altération de la membrane plasmique et les organites intracellulaires. Note: Inversion de l'apoptose a été observée dans diverses cellules de mammifères 12,13, y compris les cellules hépatiques de souri…

Representative Results

Pour étudier l'inversion de l'apoptose, des cellules de culture tissulaire sont d'abord exposés à un stimulus de mort pour déclencher l'apoptose. Lorsque les cellules affichent caractéristiques de l'apoptose, milieu de culture frais est ensuite appliqué à laver le stimulus et ensuite incuber les cellules mourantes pour permettre la récupération (figure 1A). Ici, la question clé étant adressée est de savoir jusqu'où cellules cultivées meurent individuels peuvent prog…

Discussion

Anastasis désigne le phénomène où les cellules qui ont activés voie de mort cellulaire inverse par la suite le processus de la mort et de survivre. Ici, nous avons démontré que l'imagerie des cellules vivantes peut être utilisée pour confirmer que les mêmes cellules individuelles en fait peuvent inverser apoptotique processus de mort cellulaire à un stade tardif, et puis continuer survivant et la reproduction. Nos protocoles décrivent différentes conditions de traitement spécifiques d'un type cellu…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
LSM780 confocal microscopy	Carl Zeiss	/
Glass bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-0-14-C
Transparent CultFoi	Carl Zeiss	000000-1116-084
CO2 independent medium	Life Technologies	18045-088
CellTracker	Life Technologies	C34552
Mitotracker Red CMXRos	Life Technologies	M-7512
Hoechst 33342	Life Technologies	H1399
Fluorescently labeled annexin V	Biovision	K201