Estrategias para Anastasis Seguimiento, una célula de supervivencia Fenómeno que Invierte Apoptosis

Summary

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

Abstract

Anastasis (del griego, "el aumento de la vida") se refiere a la recuperación de las células que mueren. Antes de que estas células se recuperan, que han pasado a través de los puntos de control importantes de la apoptosis, incluyendo la fragmentación mitocondrial, la liberación de citocromo c mitocondrial en el citosol, la activación de las caspasas, condensación de la cromatina, el daño del ADN, fragmentación nuclear, formación de ampollas en la membrana plasmática, el encogimiento celular, la exposición de la superficie celular de fosfatidilserina, y la formación de cuerpos apoptóticos. Anastasis puede ocurrir cuando los estímulos apoptóticos se eliminan antes de la muerte, permitiendo así que las células que mueren para revertir la apoptosis y potencialmente otros mecanismos de muerte. Por lo tanto, anastasis parece implicar procesos de curación fisiológicos que también podrían sostener las células dañadas de manera inapropiada. Las funciones y mecanismos de anastasis aún no están claros, obstaculizada en parte por las limitadas herramientas para la detección de eventos pasados ​​después de la recuperación de las células aparentemente sanas. Estrategias para detectar anastasis permitirá a los estudios de los mecanismos fisiológicos, los peligros de las células no-muertos en patología de la enfermedad y posibles terapias para modular anastasis. A continuación, describimos las estrategias eficaces usando microscopia de células vivas y un biosensor caspasa mamífero para identificar y rastrear anastasis en células de mamíferos.

Introduction

La apoptosis (del griego, "caer a la muerte") en general se supone que ser un proceso unidireccional que termina en suicidio celular ^1-7. Alteración genética de genes pro-muerte como resultado la supervivencia de las células adicionales que de otro modo morirían en animales enteros, incluyendo las células que ya han iniciado el ^8,9 vía de la apoptosis. Del mismo modo, las manipulaciones genéticas permiten que las células de mamíferos sanos que artificialmente Display "Cómeme" señales o que pierden la adherencia a su matriz extracelular para escapar de la muerte por la fagocitosis de células enteras o entosis, respectivamente ^10,11. Sin embargo, nosotros y otros han demostrado que sin manipulación genética de células de mamíferos sanos normales y líneas celulares también pueden recuperarse de las primeras etapas de la apoptosis ^12-15. El uso de herramientas para rastrear células individuales, hemos demostrado aún más la recuperación de las últimas etapas de la apoptosis ^12,13, después de las células han pasado los puntos de control importantes que típicoly marcar el "punto de no retorno" ^2-6. Estos puntos de control de la apoptosis etapa tardía incluyen liberación mitocondrial de citocromo c, la activación de caspasas, la fragmentación nuclear, y formación de cuerpos apoptóticos. Adoptamos una palabra compuesta griega "Anastasis", que significa "resurrección a la vida", para describir esta inversión de la apoptosis en el borde de la muerte celular ^2-6.

A menos que todo el proceso de recuperación de morir es observado por imágenes de células vivas, es difícil distinguir las células que han sido objeto anastasis a partir de células que nunca experimentaron eventos apoptóticos. Décadas de trabajo han puesto de manifiesto que las características morfológicas de suicidio celular por apoptosis son impulsados ​​por eventos bioquímicos y moleculares conservadas evolutivamente ^16-19. Estos eventos promueven la auto-destrucción de las células para regular los procesos de desarrollo y homeostáticos en organismos unicelulares y pluricelulares mediante la eliminación de daños o dcélulas angerous ^16-19. Mientras que las células apoptóticas pueden distinguirse fácilmente por manifestaciones morfológicas, bioquímicas y moleculares estandarizados de apoptosis ^1,5,6,16,20, actualmente no se conoce ningún marcador específico para anastasis ^12,13. Es importante destacar que las células que han sido objeto anastasis parecen ser las células sanas normales y células que sólo empiezan revertir apoptosis aparecer células que mueren como apoptosis ^12,13. Por lo tanto, se necesitan nuevas herramientas para concluir con certeza que una célula sobrevive dado había experimentado previamente procesos apoptóticos activos.

La apoptosis se asume generalmente como una cascada irreversible porque es un proceso de destrucción rápida y masiva. Si bien se podría tardar minutos en días de algunas células para iniciar la apoptosis, una vez que las mitocondrias han lanzado factores apoptogénicos como citocromo c al citosol ^21,22, caspasas pueden ser activados en 5 minutos ^23,24, seguidos por citoplasmática ycondensación nuclear dentro de 10 min ^25-27, y la muerte celular poco después ^25-27. Las caspasas activadas orquestan la apoptosis mediante la escisión e inactivación de componentes estructurales y funcionales clave para el propósito de demolición celular ^2,28, tales como el inhibidor de la endonucleasa de DFF45 / ICAD ^29,30. Las caspasas también activan factores pro-apoptóticos, tales como BID miembro de familia Bcl-2, que se transloca a la mitocondria para promover la liberación de citocromo C ^31,32. Actividad caspasa también da lugar a la exposición de la superficie celular de fosfatidilserina como "comerme" señal para la promoción de inmersión de las células que mueren por los macrófagos o células vecinas a través de la fagocitosis ^33. Además, eventos apoptóticos hacen mitocondrias disfuncionales, lo que altera la bioenergética celular y el metabolismo ^34,35,36. Por lo tanto, la recuperación de dicha destrucción parece intuitivamente improbable.

Contrariamente a la original esperarciones, las células pueden revertir el proceso de muerte celular apoptótica incluso en una etapa tardía. Al monitorear continuamente el destino de morir las células en cultivo, se observó la reversibilidad de la apoptosis etapa tardía en una gama de células primarias y líneas celulares ^12,13. La eliminación del estímulo muerte permitió la recuperación de las características evidentes de la apoptosis, tales como la fragmentación mitocondrial, condensación de la cromatina, el daño del ADN, formación de ampollas en la membrana plasmática, la exposición de la superficie celular de la fosfatidilserina, la liberación de citocromo c mitocondrial, la activación de caspasas, la fragmentación nuclear, contracción celular, y formación de cuerpos apoptóticos. Estas observaciones plantean preguntas sin respuesta sobre las funciones, las consecuencias y los mecanismos de anastasis. Para abordar estas cuestiones, es un requisito previo para identificar de forma fiable las células que han sido objeto anastasis. A continuación, describimos los métodos de microscopía en vivo y un biosensor para la detección de caspasa células que han invertido previamente apoptosis etapa tardía y XXen sobrevivió.

Protocol

1. Preparación de células de imágenes de células vivas Para facilitar la detección de cambios morfológicos, elija células adherentes tales como las células que son planas sobre el sustrato para visualizar mejor la alteración de la membrana plasmática y orgánulos intracelulares HeLa (carcinoma cervical humano). Nota: Inversión de la apoptosis se ha observado en diversas células de mamíferos 12,13, incluyendo las células de hígado de ratón primario, macrófagos primarios de ra…

Representative Results

Para estudiar la reversión de la apoptosis, las células de cultivo de tejidos se expusieron primero a un estímulo muerte para activar la apoptosis. Cuando las células exhiben características de apoptosis, medio de cultivo fresco se aplica entonces para lavar el estímulo y luego se incuban las células que mueren para permitir la recuperación (Figura 1A). Aquí, la cuestión clave está abordando es hasta qué punto las células cultivadas que mueren individuales pueden progresar hacia la apoptosi…

Discussion

Anastasis se refiere al fenómeno por el cual las células que han de células activadas por vía de la muerte posteriormente revertir el proceso de muerte y sobrevivir. Aquí, hemos demostrado que imágenes de células vivas se puede utilizar para confirmar que las mismas células individuales, de hecho, pueden revertir proceso de muerte celular apoptótica en una etapa tardía, y luego continuar sobrevivir y reproducirse. Nuestros protocolos describen varias condiciones de tratamiento específicas del tipo de células…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
LSM780 confocal microscopy	Carl Zeiss	/
Glass bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-0-14-C
Transparent CultFoi	Carl Zeiss	000000-1116-084
CO2 independent medium	Life Technologies	18045-088
CellTracker	Life Technologies	C34552
Mitotracker Red CMXRos	Life Technologies	M-7512
Hoechst 33342	Life Technologies	H1399
Fluorescently labeled annexin V	Biovision	K201