Takip inişi, Apoptosisi tersine Cep Survival Fenomeni için Stratejiler
Summary
The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.
Abstract
Anastasis ("hayata yükselen" Yunanca) ölen hücrelerin iyileşme anlamına gelir. Bu hücreler kurtarmak önce, mitokondriyal parçalanma, sitozolüne mitokondriyal sitokrom c salınımı, kaspaz aktivasyonu, kromatin yoğunlaşması, DNA hasarı, nükleer parçalanma, plazma zar kabarmasını, hücre büzülmesi, hücre yüzeyi maruz kalma dahil olmak üzere apoptoz önemli kontrol noktaları aracılığıyla geçti fosfatidilserin ve apoptotik cisimlerin oluşumu. Apoptotik uyaranlara böylece ölen hücrelerin apoptoz ve potansiyel diğer ölüm mekanizmaları ters izin ölüm öncesinde kaldırıldığında Anastasis oluşabilir. Bu nedenle, inişi de uygunsuz hasarlı hücreleri sürdürmek olabilir fizyolojik iyileşme süreçleri dahil görünüyor. fonksiyonları ve inişi mekanizmaları görünüşte sağlıklı hücrelerin kurtarma sonra geçmiş olayları algılamak için sınırlı araçları tarafından kısmen engel, hala belirsiz. Stratejiler Anasta tespit etmek içinsis Anastasis modüle fizyolojik mekanizmaların çalışmalarını, hastalık patoloji ölümsüz hücre tehlikeleri ve potansiyel terapötik sağlayacaktır. Burada, canlı hücre mikroskopi ve memeli hücrelerinde Anastasis tespit ve takip etmek için, memeli bir kaspaz bio-sensor aracılığıyla etkili stratejiler açıklanmaktadır.
Introduction
Apoptoz ("ölüme düşen" Yunanca), genellikle hücre intihar 1-7 biten tek yönlü bir süreç olarak kabul edilir. Zaten apoptoz yolu 8,9 başlatmış bulunuyoruz hücreleri dahil aksi takdirde bütün hayvanlarda öleceğini ekstra hücrelerin, hayatta yanlısı ölüm genleri sonuçları Genetik bozulması. Benzer şekilde, genetik manipülasyonlar yapay görüntüler sinyalleri "Bana yemek" ya da hücre dışı matriks yapışma kaybetmek sağlıklı memeli hücreleri tam hücre fagositozu veya entosis, sırasıyla 10,11 ölümü kaçmasına izin. Ancak bizler ve başkaları da apoptoz 12-15 erken aşamalarında kurtulabilir Genetik manipülasyon, normal, sağlıklı, memeli hücreleri ve hücre çizgileri olmadan göstermiştir. Hücreler tipik önemli kontrol noktaları geçtikten sonra tek tek hücrelerin izlemek için araçlar kullanarak, daha fazla, apoptoz 12,13 geç aşamalarında kurtarma göstermiştirly 2-6 "dönüşü olmayan noktaya" işaretleyin. Geç evre apoptoz Bu kontrol noktaları mitokondriyal sitokrom c salınımını, kaspaz aktivasyonu, nükleer parçalanma ve apoptotik cisimlerin oluşumunu içerir. Biz hücre ölümü 2-6 eşiğinde apoptoz bu ters tanımlamak için, "hayata yükselen" anlamına gelen Yunanca bir bileşik sözcük "inişi", kabul.
Tüm ölüyor-kurtarma işlemi canlı hücre görüntüleme tarafından gözlemlenen sürece, bu apopitozisin yaşamamış hücrelerden Anastasis geçiren hücreleri ayırt etmek zordur. Iş Yılların apoptoz hücre intihar morfolojik özellikleri evrimsel olarak korunmuş biyokimyasal ve moleküler olayların 16-19 tarafından tahrik olduğunu ortaya koymuştur. Bu olaylar hasarlı veya d ortadan kaldırarak ile tek hücreli ve çok hücreli organizmalarda gelişimsel ve homoeostatic süreçleri düzenleyen hücrelerin kendini imha teşvikangerous hücreler 16-19. Apoptotik hücreler hali hazırda apoptoz 1,5,6,16,20 standart, morfolojik, biyokimyasal ve moleküler belirtileri ile ayırt edilebilir olsa da, şu anda inişi 12,13 özgü bilinen bir işaretleyici yoktur. Önemlisi, Anastasis geçirmiş hücreler normal sağlıklı hücreler, sadece apoptoz ters başlayın hücreleri görünür olarak apoptotik hücreler ölüyor 12,13 olduğu görülmektedir. Böylece, yeni araçlar belirli bir hayatta hücre önce aktif apoptotik süreçleri yaşamış kesinlikle sonuçlandırmak için gerekli.
Bu hızlı ve kitlesel imha süreci olduğundan Apoptoz genellikle geri dönüşümsüz kaskad olarak kabul edilir. Mitokondri gibi sitozolüne 21,22 içine sitokrom-c gibi apoptogenic faktörler yayımlandı kez bazı hücreler, apoptoz başlatmak için bu güne dakika sürebilir iken, kaspazlar, 5 dakika içinde aktif 23,24 sitoplazmik tarafından takip edilebilir veNükleer 10 dakika 25-27 içinde yoğuşma ve hücre ölümü kısa bir süre sonra 25-27. Aktif kaspazlar yarılması ve endonukleaz inhibitörü DFF45 / ICAD 29,30 olarak hücresel yıkım 2,28, amacıyla önemli yapısal ve işlevsel bileşenleri inaktive ederek apoptozu düzenlemişlerdir. Kaspazlar ayrıca 31,32 c sitokrom mitokondriyal serbest teşvik etmek mitokondri translocates BCL-2 aile üyesi BID, pro-apoptotik faktörler, etkinleştirin. Kaspaz aktivitesi fagositoz 33 ile makrofajlar veya komşu hücreleri hücreleri ölüyor yutulmasına teşvik etmek için bir "beni ye" sinyali olarak fosfatidilserin hücre yüzey maruz sonuçlanır. Ayrıca, apoptotik olaylar hücresel biyoenerjitiklerinin ve metabolizma 34,35,36 bozarak işlevsiz mitokondri, hale. Dolayısıyla, bu tür imha kurtarma sezgisel olası görünüyor.
Orijinal aksine bekliyoruzations, hücreler bile geç bir aşamada apoptotik hücre ölümü sürecini tersine çevirebilirsiniz. Sürekli kültür içinde ölen hücrelerden kaderi izleyerek, primer hücreler ve hücre çizgileri 12,13 bir dizi son evre apoptoz geri döndürülme oranı gözlendi. Ölüm uyaran kaldırılması gibi mitokondriyal parçalanma, kromatin yoğunlaşması, DNA hasarı, plazma zar kabarmasını, fosfatidilserin hücre yüzey maruz, mitokondriyal sitokrom c salınımı, kaspaz aktivasyonu, nükleer parçalanma, hücre büzülmesi gibi apoptoz açık özelliklerinden, kurtarma izin apoptotik cisimlerin ve oluşumu. Bu gözlemler inişi fonksiyonları, sonuçları ve mekanizmaları ile ilgili cevapsız soruları gündeme. Bu sorulara yanıt için, bir ön güvenilir Anastasis geçiren hücreleri tespit etmektir. Burada, biz canlı mikroskopi yöntemleri ve daha önce geç evre apoptoz ve th tersine çevirdi hücreleri tespit için bir kaspaz biyosensör tariftr kurtuldu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anastasis hücre ölümü yolu aktive olan hücreler daha sonra ölüyor süreci tersine ve hayatta fenomen ifade eder. Burada, canlı hücre görüntüleme aslında aynı tek tek hücreler bir son aşamada, apoptotik hücre ölümü sürecinin tersine ve yaşam ve çoğaltmaya devam onaylamak için kullanılabileceğini göstermişlerdir. Bizim protokolleri apoptoz teşvik ve doğrulama için çeşitli biyomarkerler ile izlenen apoptoz dönüşümüne maruz hücrelerin büyük bir kısmını sağlamak için birçok opt…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz kelime "Anastasis" apoptoz ters açıklamak için öne için Rev Dr Ralph Bohlmann ve Rev Dr James Voelz teşekkür; Stabil sitokrom c GFP ifade HeLa hücreleri Douglas R. Yeşil; H446 hücreleri Charles, M. Rudin ve Eric E. Gardner; Video karikatür çizim konusunda yardım almak için Heather Kuzu; Bu yazının değerli tartışma için Yee Hui Yeo. Bu çalışma Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), Dr. Walter Szeto Memorial Bursu (HLT), Fulbright hibe 007-2009 (HLT), Yaşam Bilim Araştırma Vakfı bursu (HLT) tarafından desteklenen, NIH NS037402 (JMH) verir ve NS083373 (JMH), ve Hong Kong Üniversitesi Hibeler Komitesi AoE / B-07/99 (MCF). Ho Lam Tang Yaşam Bilimleri Araştırma Vakfı Shurl ve Kay Curci Vakfı üyesidir.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| LSM780 confocal microscopy | Carl Zeiss | / | |
| Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Transparent CultFoi | Carl Zeiss | 000000-1116-084 | |
| CO2 independent medium | Life Technologies | 18045-088 | |
| CellTracker | Life Technologies | C34552 | |
| Mitotracker Red CMXRos | Life Technologies | M-7512 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | |
| Fluorescently labeled annexin V | Biovision | K201 |
Referências
- Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239-257 (1972).
- Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 897-907 (2004).
- Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
- Chipuk, J. E., Bouchier-Hayes, L., Green, D. R. Mitochondrial outer membrane permeabilization during apoptosis: the innocent bystander scenario. Cell Death and Differentiation. 13, 1396-1402 (2006).
- Kroemer, G., et al. Classification of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death and Differentiation. 16, 3-11 (2009).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death and Differentiation. 19, 107-120 (2012).
- Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nature Medicine. 18, 1630-1638 (2012).
- Reddien, P. W., Cameron, S., Horvitz, H. R. Phagocytosis promotes programmed cell death in C. elegans. Nature. 412, (2001).
- Hoeppner, D. J., Hengartner, M. O., Schnabel, R. Engulfment genes cooperate with ced-3 to promote cell death in Caenorhabditis elegans. Nature. 412, 202-206 (2001).
- Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
- Overholtzer, M., et al. A nonapoptotic cell death process, entosis, that occurs by cell-in-cell invasion. Cell. 131, 966-979 (2007).
- Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100, (2009).
- Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23, 2240-2252 (2012).
- Hammill, A. K., Uhr, J. W., Scheuermann, R. H. Annexin V staining due to loss of membrane asymmetry can be reversible and precede commitment to apoptotic death. Experimental Cell Research. 251, (1999).
- Geske, F. J., Lieberman, R., Strange, R., Gerschenson, L. E. Early stages of p53-induced apoptosis are reversible. Cell Death and Differentiation. 8, 182-191 (2001).
- Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
- Hardwick, J. M., Cheng, W. C. Mitochondrial programmed cell death pathways in yeast. Developmental Cell. 7, 630-632 (2004).
- Frohlich, K. U., Fussi, H., Ruckenstuhl, C. Yeast apoptosis-from genes to pathways. Seminars in Cancer Biology. 17, 112-121 (2007).
- Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
- Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 231-241 (2008).
- Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes & Development. 15, 2922-2933 (2001).
- Galluzzi, L., Kepp, O., Kroemer, G. Mitochondria: master regulators of danger signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 13, 780-788 (2012).
- Goldstein, J. C., Waterhouse, N. J., Juin, P., Evan, G. I., Green, D. R. The coordinate release of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kinetically invariant. Nature Cell Biology. 2, 156-162 (2000).
- Goldstein, J. C., et al. Cytochrome c is released in a single step during apoptosis. Cell Death and Differentiation. 12, 453-462 (2005).
- Tyas, L., Brophy, V. A., Pope, A., Rivett, A. J., Tavare, J. M. Rapid caspase-3 activation during apoptosis revealed using fluorescence-resonance energy transfer. EMBO Reports. 1, 266-270 (2000).
- Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. The Journal of Cell Biology. 160, 235-243 (2003).
- Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Molecular Cell. 30, 11-25 (2008).
- Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14, 641-650 (2007).
- Liu, X., Zou, H., Slaughter, C., Wang, X. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis. Cell. 89, 175-184 (1997).
- Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391, 43-50 (1998).
- Li, H., Zhu, H., Xu, C. J., Yuan, J. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell. 94, 491-501 (1998).
- Slee, E. A., Keogh, S. A., Martin, S. J. Cleavage of BID during cytotoxic drug and UV radiation-induced apoptosis occurs downstream of the point of Bcl-2 action and is catalysed by caspase-3: a potential feedback loop for amplification of apoptosis-associated mitochondrial cytochrome c release. Cell Death and Differentiation. 7, 556-565 (2000).
- Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341, 403-406 (2013).
- Kroemer, G., Martin, S. J. Caspase-independent cell death. Nature Medicine. 11, 725-730 (2005).
- Chipuk, J. E., Green, D. R. Do inducers of apoptosis trigger caspase-independent cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 6, 268-275 (2005).
- Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 621-632 (2010).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 2979-2984 (1998).
- Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. BioTechniques. 23, 525-531 (1997).
- Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).
- Fenech, M., et al. Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells. Mutagenesis. 26, 125-132 (2011).
- Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. Causes and consequences of aneuploidy in cancer. Nature Reviews Genetics. 13, (2012).
- Poreba, M., Strozyk, A., Salvesen, G. S., Drag, M. Caspase substrates and inhibitors. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a008680 (2013).
- Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. The Journal of Biological Chemistry. 272, 9677-9682 (1997).
- Logue, S. E., Elgendy, M., Martin, S. J. Expression, purification and use of recombinant annexin V for the detection of apoptotic cells. Nature Protocols. 4, 1383-1395 (2009).
- Kenis, H., et al. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. Journal of Nuclear Medicine. 51, 259-267 (2010).
- Ruegg, U. T., Staurosporine Burgess, G. M. K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10, 218-220 (1989).
- Bertrand, R., Solary, E., O’Connor, P., Kohn, K. W., Pommier, Y. Induction of a common pathway of apoptosis by staurosporine. Experimental Cell Research. 211, 314-321 (1994).
- Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42, 373-381 (2000).
- Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13367-13372 (2007).
- Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13901-13905 (2008).
- Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. The Journal of Cell Biology. 196, 513-527 (2012).
- Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genetics. 10, e1004437 (2014).
