추적 아나스타시스, 세포 사멸을 취소 세포 생존 현상에 대한 전략
Summary
The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.
Abstract
아나스타시스 ( "생활에 상승"에 대한 그리스어) 죽어가는 세포의 회복을 의미한다. 이들 세포의 회복 전에, 미토콘드리아 단편화, 세포질 내로 미토콘드리아 사이토 크롬 C의 방출, 카스파 제 활성화, 크로 마틴 응축, DNA 손상, 핵 분열, 세포막에 blebbing, 세포 수축, 세포 표면 노출을 포함한 세포 사멸 중요한 체크 포인트를 통과 한 포스파티딜 세린, 및 세포 사멸 기관의 형성. 세포 사멸 자극함으로써 죽어가는 세포가 사멸하고 잠재적으로 다른 죽음의 메커니즘을 취소 할 수 있도록, 죽음 이전에 제거 될 때 아나스타시스가 발생할 수 있습니다. 따라서, 아나스타시스는 부적절하게 손상된 세포를 유지할 수있는 생리적 치유 과정을 포함 나타납니다. 기능 및 메커니즘 아나스타시스 명백하게 건강한 세포의 복구 후에 과거 사건을 검출하기위한 제한된 도구에 의해 부분적으로 방해, 여전히 불분명하다. 전략 anasta를 검출SIS는 아나스타시스를 변조 생리 메커니즘 연구, 질병 병리 언데드 세포의 유해성과 잠재적 인 치료제를 가능하게 할 것이다. 여기서 우리는 살아있는 세포 현미경 및 포유 동물 세포에 아나스타시스를 식별하고 추적하기위한 포유 동물 카스파 바이오 센서를 사용하여 효과적인 전략을 설명합니다.
Introduction
세포 사멸 ( "죽음에 떨어지는"에 대한 그리스어)는 일반적으로 세포 자살 1-7로 끝나는 단방향 프로세스로 간주됩니다. 이미 세포 사멸 경로의 8,9을 시작했다 세포를 포함, 그렇지 않으면 전체 동물에 죽을 것 여분의 세포의 생존에 프로 죽음 유전자 결과의 유전 중단. 마찬가지로, 유전자 조작 인위적으로 표시 신호를 "날 먹고"또는 자신의 세포 외 기질 접착 성을 잃게 건강한 포유 동물 세포는 모든 세포의 식균 작용 또는 entosis 각각 10, 11에 의해 죽음을 탈출 할 수 있습니다. 그러나, 우리와 다른 사람들은 또한 세포 사멸 12-15의 초기 단계에서 복구 할 수 있습니다 유전자 조작 정상적인 건강한 포유 동물 세포 및 세포 선없이 것을 보여 주었다. 세포는 전형적인 중요 체크 포인트를 통과 한 후 각각의 세포를 추적 할 수있는 도구를 사용하여, 우리는 또한, 세포 사멸 (12, 13)의 후반 단계에서 복구를 증명하고있다해동 2-6 "니나"를 표시합니다. 최종 단계의 세포 사멸이 체크 포인트는 미토콘드리아 시토크롬 C의 릴리스, 카스파의 활성화, 핵 분열 및 세포 사멸 기관의 형성을 포함한다. 우리는 세포 사멸 2-6의 위기에서 세포 사멸이 반전을 설명하기 위해, "생활에 상승"을 의미 그리스어 합성어 "아나스타시스"을 채택했다.
전체 죽어 복구 프로세스가 라이브 세포 이미징에 의해 관찰되지 않는 한,이 세포 사멸 이벤트를 경험하지 못한 세포에서 아나스타시스를받은 세포를 구별하기 위해 도전하고있다. 작품의 수십 년 세포 사멸에 의한 세포 자살의 형태 적 특징은 진화 적으로 보존 된 생화학 및 분자 이벤트 16-19에 의해 구동되는 것을 밝혀졌다. 이러한 이벤트는 손상 또는 d 제거하여 단세포와 다세포 생물의 발달과 homoeostatic 과정을 조절하는 세포의 자기 파괴를 촉진angerous 세포 16-19. 사멸 세포에 쉽게 사멸 1,5,6,16,20의 표준화, 형태 학적, 생화학 및 분자 발현에 의해 구별 될 수 있지만, 현재 아나스타시스 12, 13에 해당 알려진 마커가 없습니다. 중요한 것은, 아나스타시스를받은 세포는 정상적인 건강한 세포, 단지 세포 사멸을 반대로 시작 세포 표시와 같은 세포 사멸 죽어가는 세포 (12, 13)로 나타납니다. 따라서, 새로운 도구는 주어진 생존 세포가 이전의 활성 세포 사멸 과정을 경험했다 확실하게 결론을 내릴 필요가있다.
이 신속하고 대규모 파괴 과정이기 때문에 세포 사멸은 일반적으로 돌이킬 수없는 계단식으로 가정한다. 미토콘드리아는 세포질 (21, 22)에 시토크롬 C와 같은 apoptogenic 요인을 발표 한 후에는 일부 세포가 세포 사멸을 시작하는 것이 일 분 정도 걸릴 수 있지만, 카스파는 5 분 23, 24 내에서 활성화 세포질 다음에 할 수 있고,핵 10 분 25 ~ 27 내에서 응결 및 세포 사멸 잠시 후 25-27. 활성화 된 카스파은 절단과 같은 엔도 뉴 클레아 제 억제제 DFF45 / ICAD 29,30로서 셀룰러 철거 2,28의 주요 목적 구조적 및 기능적 구성 요소를 비활성화하여 아폽토시스를 조율. 카스파는 또한 31, 32 크롬 c의 미토콘드리아 방출을 촉진하는 미토콘드리아에 옭 BCL-2 가족의 BID, 같은 프로 세포 사멸 인자를 활성화합니다. 카스파 활동은 또한 탐식 33 대 식세포 또는 인접 세포에 의한 세포 죽음의 말림을 촉진하기위한 "날 먹고"신호로 포스파티딜 세린의 세포 표면에 노출되는 결과를 초래한다. 또한, 세포 사멸 이벤트는 세포 생체 에너지 대사의 34,35,36를 방해하는 역기능 미토콘드리아는, 렌더링합니다. 따라서, 이러한 파괴를 복구 직관적 아닌 것 같습니다.
원래는 달리 기대관리 포인트, 세포도 늦은 단계에서 사멸 세포 사멸 과정을 취소 할 수 있습니다. 지속적으로 배양 세포를 죽음의 운명을 모니터링함으로써, 우리는 일차 전지 및 세포주 12, 13의 범위에서 후기의 세포 사멸의 가역성을 관찰했다. 죽음의 자극의 제거는, 이러한 미토콘드리아의 분열, 염색질 응축, DNA 손상, 세포막에 blebbing, 포스파티딜 세린의 세포 표면에 노출, 미토콘드리아 시토크롬 C의 릴리스, 카스파 제 활성화, 핵 분열, 세포의 수축으로 세포 사멸의 명백한 기능에서 복구를 허용 세포 사멸 몸과 형성. 이러한 관찰은 아나스타시스의 기능, 결과, 및 메커니즘에 관한 대답없는 질문을 올립니다. 이러한 질문을 해결하기 위해, 전제 조건은 안정적 아나스타시스를받은 세포를 식별하는 것입니다. 여기서는 라이브 현미경 방법 및 이전 말기 아폽토시스 번째 반전 한 세포를 검출하기위한 바이오 센서를 카스파 서술욕실은 살아 남았다.
Protocol
Representative Results
Discussion
아나스타시스는 세포 사멸 경로를 활성화 한 세포가 계속해서 죽어가는 과정을 역 생존 현상을 의미한다. 여기서는 생균 촬상 사실 동일인 셀 늦은 단계에서 아폽토시스 세포 사멸의 과정을 역으로 한 후 생존 및 재생을 계속할 수 있음을 확인하기 위해 사용될 수 있다는 것을 증명하고있다. 우리 프로토콜은 아폽토시스를 유도 및 확인을위한 여러 가지 바이오 마커와 세포 사멸의 모니터링 반전…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 단어 "아나스타시스"세포 사멸의 반전을 설명하는 제안에 대해 목사 랄프 Bohlmann와 목사 제임스 Voelz 감사합니다; 안정적으로 시토크롬 C -GFP을 표현 헬라 세포에 대한 더글라스 R. 녹색; H446 세포 찰스 M. 루딘 에릭 E. 가드너; 비디오에서 만화 그리기에 도움을 헤더 어린 양; 이 원고의 가치있는 토론을위한 유 후이 여진. 이 작품은 선생님 에드워드 Youde 기념 원정대 (HLT), 박사 월터 제토 기념 장학금 (HLT), 풀 브라이트 부여 007-2009 (HLT), 생명 과학 연구 재단의 교제 (HLT)에 의해 지원되었다, NIH는 NS037402 (JMH) 부여 및 NS083373 (JMH), 그리고 홍콩의 대학 보조금위원회 광역 / B-07 / 99 (MCF). 호 램 당나라는 생명 과학 연구 재단의 Shurl와 케이 쿠 르치 재단 연구원이다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| LSM780 confocal microscopy | Carl Zeiss | / | |
| Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Transparent CultFoi | Carl Zeiss | 000000-1116-084 | |
| CO2 independent medium | Life Technologies | 18045-088 | |
| CellTracker | Life Technologies | C34552 | |
| Mitotracker Red CMXRos | Life Technologies | M-7512 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | |
| Fluorescently labeled annexin V | Biovision | K201 |
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