JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Strategieën voor Tracking Anastasis, A Cell Survival verschijnsel dat apoptose Keert

Published: February 16, 2015
doi:
10.3791/51964
, , ,
1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology,Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2School of Life Sciences,Chinese University of Hong Kong, 3Center for Cell Dynamics, Department of Biological Chemistry,Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

Abstract

Anastasis (Grieks voor "oplopend tot leven") verwijst naar het herstel van stervende cellen. Voordat deze cellen terug te krijgen, hebben ze gepasseerd belangrijke checkpoints van apoptose, waaronder mitochondriale fragmentatie, release van mitochondriale cytochroom c in het cytosol, de activering van caspases, chromatinecondensatie, DNA-schade, kernfragmentatie, plasmamembraan blebbing, celinkrimping, blootstelling celoppervlak fosfatidylserine en vorming van apoptotische lichamen. Anastasis kan optreden wanneer apoptotische stimuli voor het overlijden worden verwijderd, waardoor stervende cellen apoptose en mogelijk andere dood mechanismen te keren. Daarom lijkt Anastasis om fysiologische genezingsprocessen dat ook zou kunnen ondersteunen beschadigde cellen op ongepaste wijze te betrekken. De functies en mechanismen van Anastasis zijn nog onduidelijk, gehinderd gedeeltelijk door de beperkte hulpmiddelen voor het opsporen van gebeurtenissen uit het verleden na het herstel van de ogenschijnlijk gezonde cellen. Strategieën om Anasta detecterensis zal onderzoeken van de fysiologische mechanismen, de gevaren van ondoden cellen bij de ziekte van pathologie, en mogelijke therapieën mogelijk te Anastasis moduleren. We beschrijven hier effectieve strategieën met levende cel microscopie en zoogdieren caspase biosensor voor het identificeren en volgen anastasis in zoogdiercellen.

Introduction

Apoptose (Grieks voor "vallen tot de dood") wordt over het algemeen aangenomen dat het een one-way proces eindigt in cel zelfmoord 1-7 zijn. Genetische verstoring van pro-dood-genen resulteert in de overleving van extra cellen die anders zouden sterven in gehele dieren, waaronder cellen die reeds de apoptose pathway 8,9 hebben geopend. Ook genetische manipulaties laat gezonde cellen van zoogdieren die op kunstmatige wijze weer te geven "eet me" signalen of die hechting verliezen hun extracellulaire matrix tot de dood door hele cellen fagocytose of entosis respectievelijk 10,11 ontsnappen. Echter, wij en anderen hebben aangetoond dat zonder genetische manipulatie normale gezonde zoogdiercellen en cellijnen kunnen herstellen van de vroege stadia van apoptose 12-15. Gebruik van tools om individuele cellen te volgen, hebben we verder aangetoond herstel van late stadia van apoptose 12,13, na cellen belangrijke checkpoints die typisch zijn verstrekenly markeren de "point of no return" 2-6. Deze checkpoints van laat stadium apoptose omvatten mitochondriale release van cytochroom c, activering van caspases, nucleaire fragmentatie, en de vorming van apoptotische lichamen. Wij keurden een Grieks samengesteld woord "Anastasis", wat betekent "oplopend tot leven", om deze omkering van apoptose beschrijven aan de rand van celdood 2-6.

Tenzij de gehele stervenden-herstelproces wordt waargenomen door live cell imaging, is het een uitdaging om cellen die Anastasis uit cellen die nooit meegemaakt apoptotische gebeurtenissen hebben ondergaan onderscheiden. Decennia van werk is gebleken dat de morfologische kenmerken van de cel zelfmoord door apoptose worden gedreven door evolutionair geconserveerde biochemische en moleculaire gebeurtenissen 16-19. Deze gebeurtenissen bevorderen zelfvernietiging van cellen om ontwikkelings- en homoeostatic processen in eencellige en meercellige organismen te reguleren door het elimineren van beschadigde of dangerous cellen 16-19. Terwijl apoptotische cellen gemakkelijk kunnen worden onderscheiden door standaard morfologische, biochemische en moleculaire manifestaties van apoptose 1,5,6,16,20, momenteel is er geen bekende marker specifiek Anastasis 12,13. Belangrijk cellen die anastasis hebben ondergaan lijken normale gezonde cellen, en cellen die net beginnen omkeren apoptose verschijnen apoptotische stervende cellen 12,13 zijn. Zo worden nieuwe instrumenten nodig zijn om met zekerheid dat een bepaalde overlevende cel eerder had meegemaakt actieve apoptotische processen.

Apoptose wordt algemeen aangenomen als een onomkeerbare cascade omdat het een snelle en massale vernietigingsproces. Hoewel het enkele minuten zou kunnen nemen om voor sommige cellen om apoptose te starten, zodra mitochondriën apoptotische factoren zoals cytochroom c in het cytosol 21,22 hebben vrijgegeven, kan caspasen worden geactiveerd binnen 5 minuten 23,24, gevolgd door cytoplasmatische ennucleaire condensatie binnen 10 min 25-27, en celdood kort daarna 25-27. Geactiveerde caspasen orkestreren apoptose door splitsing en inactiveren belangrijke structurele en functionele componenten ten behoeve van cellulaire afbraak 2,28, zoals endonuclease inhibitor DFF45 / ICAD 29,30. Caspasen activeert ook pro-apoptotische factoren, zoals Bcl-2 familielid BID, die translokeert mitochondriën mitochondriale afgifte van cytochroom c 31,32 bevorderen. Caspaseactiviteit resulteert ook in celoppervlak blootstelling van fosfatidylserine als een "eet me" signaal voor het bevorderen van afblazen van stervende cellen door macrofagen of buur cellen via fagocytose 33. Bovendien apoptotische gebeurtenissen maken mitochondriën disfunctioneel, verstoren cellulaire bio-energetica en metabolisme 34,35,36. Zo, het herstel van de vernietiging lijkt intuïtief onwaarschijnlijk.

Anders originele verwachtenties, kunnen cellen de apoptotische celdood proces om te keren, zelfs in een laat stadium. Door het continu bewaken van het lot van de stervende cellen in cultuur, zagen we de omkeerbaarheid van laat stadium apoptose in een reeks van primaire cellen en cellijnen 12,13. Verwijdering van de dood stimulans toegestaan ​​herstel van de openlijke kenmerken van apoptose, zoals mitochondriale fragmentatie, chromatinecondensatie, DNA-schade, plasmamembraan blebbing, celoppervlak blootstelling van fosfatidylserine, vrijkomen van mitochondriale cytochroom c, caspaseactivering, kernfragmentatie, cel krimp, en de vorming van apoptotische lichamen. Deze waarnemingen verhogen onbeantwoorde vragen over de functies, gevolgen en mechanismen van Anastasis. Om deze vragen te beantwoorden, een voorwaarde is om betrouwbaar cellen die Anastasis hebben ondergaan identificeren. Hier beschrijven we live microscopie methoden en een caspase biosensor voor de detectie van cellen die eerder omgekeerd laat stadium apoptose en then overleefde.

Protocol

1. Voorbereiding van de Cellen voor live cell imaging Om het opsporen van morfologische veranderingen te vergemakkelijken, kies hechtende cellen zoals HeLa (humaan cervixcarcinoom) cellen die plat op het substraat wijziging van het plasmamembraan en intracellulaire organellen beter visualiseren. Opmerking: Omkering van apoptose waargenomen in verschillende zoogdiercellen 12,13, primaire muizenlever elementen, muis macrofagen, primaire cardiomyocyten van de rat, en ook lijnen zoals humane emb…

Representative Results

Om de omkering van apoptose bestuderen, worden weefselcultuurcellen eerst blootgesteld aan een dood stimulans voor apoptose in gang. Wanneer de cellen vertonen kenmerken van apoptose, wordt vers kweekmedium vervolgens op wegspoelen van de stimulus en incubeer de stervende cellen te herstellen (figuur 1A) mogelijk. Hier, de hamvraag wordt aangepakt, is hoe ver de individuele stervende gekweekte cellen kan evolueren in de richting van apoptose ondergaan Anastasis nog steeds. Deze vraag kan definitief word…

Discussion

Anastasis verwijst naar het verschijnsel waarbij cellen die celdood route geactiveerd vervolgens omgekeerde stervensproces en overleven. Hier hebben we aangetoond dat live cell imaging kan worden gebruikt om te bevestigen dat het dezelfde individuele cellen in feite apoptotische celdood proces om te keren in een laat stadium, en dan verder overleven en reproduceren. De protocollen worden enkele geoptimaliseerde celtypespecifieke behandelingsomstandigheden apoptose induceren en maken een groot deel van de cellen aan de o…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Rev. Dr. Ralph Bohlmann en Rev. Dr. James Voelz voor het suggereren van het woord "Anastasis" om omkering van apoptose te beschrijven; Douglas R. Groen voor HeLa-cellen die op stabiele wijze cytochroom c-GFP; Charles M. Rudin en Eric E. Gardner voor H446 cellen; Heather Lam voor hulp in cartoon tekening op de video; Yee Hui Yeo voor waardevolle bespreking van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door een Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), de Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (HLT), Fulbright beurs 007-2009 (HLT), Life Science Research Foundation fellowship (HLT), NIH verleent NS037402 (JMH) en NS083373 (JMH), en Universitaire Commissie Subsidies van de Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF). Ho Lam Tang is een Shurl en Kay Curci Foundation Fellow van de Life Sciences Research Foundation.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
LSM780 confocal microscopy Carl Zeiss /
Glass bottom culture dish MatTek Corporation P35G-0-14-C
Transparent CultFoi Carl Zeiss 000000-1116-084
CO2 independent medium Life Technologies 18045-088
CellTracker Life Technologies C34552
Mitotracker Red CMXRos Life Technologies M-7512
Hoechst 33342 Life Technologies H1399
Fluorescently labeled annexin V Biovision K201
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239-257 (1972).
  2. Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 897-907 (2004).
  3. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  4. Chipuk, J. E., Bouchier-Hayes, L., Green, D. R. Mitochondrial outer membrane permeabilization during apoptosis: the innocent bystander scenario. Cell Death and Differentiation. 13, 1396-1402 (2006).
  5. Kroemer, G., et al. Classification of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death and Differentiation. 16, 3-11 (2009).
  6. Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death and Differentiation. 19, 107-120 (2012).
  7. Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nature Medicine. 18, 1630-1638 (2012).
  8. Reddien, P. W., Cameron, S., Horvitz, H. R. Phagocytosis promotes programmed cell death in C. elegans. Nature. 412, (2001).
  9. Hoeppner, D. J., Hengartner, M. O., Schnabel, R. Engulfment genes cooperate with ced-3 to promote cell death in Caenorhabditis elegans. Nature. 412, 202-206 (2001).
  10. Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
  11. Overholtzer, M., et al. A nonapoptotic cell death process, entosis, that occurs by cell-in-cell invasion. Cell. 131, 966-979 (2007).
  12. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100, (2009).
  13. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  14. Hammill, A. K., Uhr, J. W., Scheuermann, R. H. Annexin V staining due to loss of membrane asymmetry can be reversible and precede commitment to apoptotic death. Experimental Cell Research. 251, (1999).
  15. Geske, F. J., Lieberman, R., Strange, R., Gerschenson, L. E. Early stages of p53-induced apoptosis are reversible. Cell Death and Differentiation. 8, 182-191 (2001).
  16. Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
  17. Hardwick, J. M., Cheng, W. C. Mitochondrial programmed cell death pathways in yeast. Developmental Cell. 7, 630-632 (2004).
  18. Frohlich, K. U., Fussi, H., Ruckenstuhl, C. Yeast apoptosis-from genes to pathways. Seminars in Cancer Biology. 17, 112-121 (2007).
  19. Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
  20. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 231-241 (2008).
  21. Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes & Development. 15, 2922-2933 (2001).
  22. Galluzzi, L., Kepp, O., Kroemer, G. Mitochondria: master regulators of danger signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 13, 780-788 (2012).
  23. Goldstein, J. C., Waterhouse, N. J., Juin, P., Evan, G. I., Green, D. R. The coordinate release of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kinetically invariant. Nature Cell Biology. 2, 156-162 (2000).
  24. Goldstein, J. C., et al. Cytochrome c is released in a single step during apoptosis. Cell Death and Differentiation. 12, 453-462 (2005).
  25. Tyas, L., Brophy, V. A., Pope, A., Rivett, A. J., Tavare, J. M. Rapid caspase-3 activation during apoptosis revealed using fluorescence-resonance energy transfer. EMBO Reports. 1, 266-270 (2000).
  26. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. The Journal of Cell Biology. 160, 235-243 (2003).
  27. Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Molecular Cell. 30, 11-25 (2008).
  28. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14, 641-650 (2007).
  29. Liu, X., Zou, H., Slaughter, C., Wang, X. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis. Cell. 89, 175-184 (1997).
  30. Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391, 43-50 (1998).
  31. Li, H., Zhu, H., Xu, C. J., Yuan, J. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell. 94, 491-501 (1998).
  32. Slee, E. A., Keogh, S. A., Martin, S. J. Cleavage of BID during cytotoxic drug and UV radiation-induced apoptosis occurs downstream of the point of Bcl-2 action and is catalysed by caspase-3: a potential feedback loop for amplification of apoptosis-associated mitochondrial cytochrome c release. Cell Death and Differentiation. 7, 556-565 (2000).
  33. Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341, 403-406 (2013).
  34. Kroemer, G., Martin, S. J. Caspase-independent cell death. Nature Medicine. 11, 725-730 (2005).
  35. Chipuk, J. E., Green, D. R. Do inducers of apoptosis trigger caspase-independent cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 6, 268-275 (2005).
  36. Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 621-632 (2010).
  37. Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 2979-2984 (1998).
  38. Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. BioTechniques. 23, 525-531 (1997).
  39. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).
  40. Fenech, M., et al. Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells. Mutagenesis. 26, 125-132 (2011).
  41. Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. Causes and consequences of aneuploidy in cancer. Nature Reviews Genetics. 13, (2012).
  42. Poreba, M., Strozyk, A., Salvesen, G. S., Drag, M. Caspase substrates and inhibitors. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a008680 (2013).
  43. Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. The Journal of Biological Chemistry. 272, 9677-9682 (1997).
  44. Logue, S. E., Elgendy, M., Martin, S. J. Expression, purification and use of recombinant annexin V for the detection of apoptotic cells. Nature Protocols. 4, 1383-1395 (2009).
  45. Kenis, H., et al. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. Journal of Nuclear Medicine. 51, 259-267 (2010).
  46. Ruegg, U. T., Staurosporine Burgess, G. M. K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10, 218-220 (1989).
  47. Bertrand, R., Solary, E., O’Connor, P., Kohn, K. W., Pommier, Y. Induction of a common pathway of apoptosis by staurosporine. Experimental Cell Research. 211, 314-321 (1994).
  48. Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42, 373-381 (2000).
  49. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13367-13372 (2007).
  50. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13901-13905 (2008).
  51. Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. The Journal of Cell Biology. 196, 513-527 (2012).
  52. Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genetics. 10, e1004437 (2014).

Tags

AnastasisCell SurvivalApoptosisCell DeathMitochondrial FragmentationCaspase ActivationChromatin CondensationDNA DamageCell Surface PhosphatidylserineApoptotic BodiesLive Cell MicroscopyCaspase Biosensor
check_url/pt/51964?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis. J. Vis. Exp. (96), e51964, doi:10.3791/51964 (2015).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image