Che caratterizza la composizione molecolare di motori su Moving assonale Cargo Utilizzo dell'analisi "Cargo Mapping"
Summary
Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.
Abstract
La comprensione dei meccanismi attraverso i quali motori molecolari coordinano le loro attività per il trasporto di carichi vescicolari all'interno dei neuroni richiede l'analisi quantitativa delle associazioni motore / carico a livello delle vescicole singolo. Lo scopo di questo protocollo è quello di utilizzare la microscopia a fluorescenza quantitativa correlare ("mappa") la posizione e la direzionalità del movimento di carico vivo per la composizione e la quantità relative di motori associati allo stesso carico. "Mappatura Cargo" è costituito da immagini in diretta di carichi fluorescente che si muovono in assoni coltivate su dispositivi microfluidici, seguita da una sintesi chimica durante la registrazione di movimento dal vivo, e la successiva immunofluorescenza (IF) colorazione delle esatte regioni assoni stessi con anticorpi contro i motori. Colocalizzazione tra i carichi e relativi motori è valutata assegnando posizione sub-pixel coordinate ai canali del motore e del carico, da funzioni gaussiane di montaggio per la diffrazione-lile funzioni di punto di spread tata che rappresentano le singole fonti puntuali fluorescenti. Del carico e del motore le immagini fisse vengono successivamente sovrapposte a trame di movimento merci, di "mappare" ai loro traiettorie tracciate. Il punto di forza di questo protocollo è la combinazione di live e se i dati di registrare sia il trasporto di carichi vescicolari in cellule vive e per determinare i motori associati a queste stesse vescicole esatte. Questa tecnica supera sfide precedenti che utilizzano metodi biochimici per determinare la composizione media del motore di eterogenee popolazioni di vescicole rinfusa purificati, come questi metodi non rivelano composizioni su singoli carichi in movimento. Inoltre, questo protocollo può essere adattato per l'analisi di altre vie di trasporto e / o di traffico in altri tipi di cellule di correlare il movimento delle singole strutture intracellulari con la loro composizione proteica. Le limitazioni di questo protocollo sono la relativamente bassa velocità a causa delle basse efficienze di trasfezione di colturaneuroni primari e un campo di vista limitato disponibile per imaging ad alta risoluzione. Le applicazioni future potrebbero includere metodi per aumentare il numero di neuroni che esprimono carichi fluorescente.
Introduction
Trasporto intracellulare è fondamentale in tutti i tipi di cellule per la consegna di proteine, membrane, organelli e molecole di segnalazione a diversi domini cellulari 1. I neuroni sono altamente specializzati cellule con lunghi, proiezioni polarizzate che critica dipendono da trasporto intracellulare dei carichi essenziali per la loro consegna a lunga distanza per vari microdomini assonale. Questo trasporto è mediata da kinesins e dineine – due grandi famiglie di proteine motore molecolare – che si legano ai carichi e tenere traccia lungo i microtubuli polarizzati in anterograda e retrograda direzioni, rispettivamente. Mentre il movimento retrogrado è mediata principalmente da dineina, il movimento in direzione anterograda è facilitato da una famiglia numerosa e funzionale gamma di motori kinesin. Di conseguenza, il trasporto anterogrado di carichi assonale potrebbe essere mediata da vari membri della famiglia della superfamiglia kinesin 1-5. Sebbene alcuni carichi muovono costantemente in entrambe le direzioni, mcarichi ost si muovono in modo bidirezionale e invertono spesso nel loro cammino verso la loro destinazione finale 1,5-13. Inoltre, è stato dimostrato che i motori di opporsi direzionalità collegata simultaneamente a carichi, sollevando la questione di come il movimento regolato di carichi è coordinata da motori opposto polarità 5-7. Insieme, il trasporto di carichi assonale è un processo concertato che è regolato dalla composizione dei motori e delle loro attività biochimiche specifiche, che a loro volta dipendono da vari adattatori e partner di legame normativi 14.
Per descrivere fedelmente il meccanismo di trasporto assonale per un carico specifico e per scoprire la regolazione di fondo di tale trasporto è fondamentale per determinare la composizione di proteine motore e dei loro partner di legame regolamentazione associati con i singoli carichi durante il trasporto di animali vivi. Altri metodi, ad esempio approcci biochimici, forniscono stime di mot mediao composizioni su popolazioni purificate vescicole eterogenee, ma queste stime non rivelano il tipo o la quantità di motori associati a vescicole si muovono singoli. Inoltre, la ricostituzione del trasporto delle vescicole lungo i microtubuli preassemblati in vitro abilitata la misurazione della quantità di un tipo di motore su un unico livello vescicole 15. Tuttavia, questi esperimenti non correlavano direttamente la quantità di motori con caratteristiche di trasporto di questi vescicole, e misurato il trasporto in assenza di fattori regolatori cellulari.
Un protocollo è presentato qui, che determina la composizione del motore (tipo e la quantità relativa di motori) delle vescicole spostano singoli da immunofluorescenza (IF) dati di misura endogenamente espressi proteine motrici, e correla questi parametri al trasporto vivo degli stessi esatti vescicole in neuroni 16. Questo metodo comporta precisa mappatura dei dati IF-to-live il movimento del carico. Questo si ottiene growing neuroni dell'ippocampo di topo in dispositivi microfluidici seguenti protocolli 17-19 stabiliti. Questi dispositivi consentono l'identificazione e la correlazione ("mappatura") degli assoni e dei singoli carichi in movimento in modalità microscopia luce fissa e dal vivo (Figura 1). Neuroni in coltura sono trasfettate con modo fluorescente proteine cargo con etichetta il cui trasporto è ripreso ad alta risoluzione spaziale e temporale per ottenere le informazioni dettagliate movimento che viene tracciata in kymographs. Nel corso delle immagini, i neuroni sono fissate con paraformaldeide, e successivamente colorate con anticorpi contro proteine motrici endogene. Del carico e del motore le immagini fisse sono sovrapposte su kymographs dal vivo movimento di "mappare" (colocalizza) li al carico dal vivo movimento traiettorie 16. Per correlare il movimento in tempo reale dei carichi con l'associazione di proteine motrici, co-localizzazione viene analizzato utilizzando un pacchetto software MATLAB su misura chiamato "Motor Colocalizzazione "16,20. Carichi e motori fluorescente generano caratteristiche puntiformi diffrazione limitata che può parzialmente sovrapporsi. Per risolvere la posizione di sovrapposizione puncta, il software prima adatta automaticamente funzioni gaussiane a ciascuna funzione del punto di diffusione, che rappresenta puncta fluorescente individuale, per determinare la loro esatta posizione XY sub-pixel di coordinate e l'intensità ampiezze 21-23. Le posizioni dei motori e dei carichi sono successivamente confrontate tra loro per determinare colocalizzazione 16,20. Pertanto, questo metodo assegna più precisamente colocalizzazione tra puncta fluorescenza rispetto ad altri metodi 24.
La forza di questo metodo è la capacità di valutare la colocalizzazione dei motori con carico individuale cellule fissate, per cui traiettorie di movimento vivo (ad esempio, la direzione in cui sono stati in movimento al momento della fissazione) sono stati recorded. Con questo metodo, kinesins e dineine trovato associare simultaneamente vescicole che portano il normale proteina prionica (PrP C -cellular), un carico neuronally arricchito che si sposta bidirezionalmente o rimane stazionario negli assoni 16. Questa analisi ha permesso la formulazione di un modello di lavoro per la regolazione della PrP C movimento delle vescicole in cui anterograda (cinesina) e (dineina) Motori retrogradi coordinano le loro attività al fine di spostare le vescicole in entrambe le direzioni o di rimanere fermo mentre associato al carico . Un'altra forza di questo metodo è la sua applicabilità potenziale massima per caratterizzare colocalizzazione / associazione di molti carichi fluorescente che si muovono in qualsiasi tipo di cellula, con qualsiasi altra proteina (s) di interesse. Così, in diretta correlazione / fisso potrebbe potenzialmente consentire la rilevazione di interazioni transienti proteina-carico, come molti fluorescente individuo etichettato particelle in movimento può essere analizzato su un p desideratoeriodo di tempo. Data l'ampia applicabilità e il tipo di domande che questo metodo può affrontare, questo protocollo sarà di interesse per un vasto pubblico di biologi cellulari, tra cui quelli che studiano il traffico e il trasporto nei neuroni o in altri tipi di cellule.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui presentata consente la correlazione di direzionalità del movimento delle singole particelle in movimento del carico basato microtubuli-fluorescenti con il tipo e la quantità relativa di proteine motrici collegate a neuroni vivi. In precedenza, la composizione totale del motore di carichi vescicolari assonale è stato analizzato su popolazioni eterogenee di vescicole e organelli 9,15 biochimicamente purificati. Tuttavia, caratterizzando composizione motore per un <em…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ge Yang, Gaudenz Danuser, Khuloud Jaqaman, and Daniel Whisler for assistance with the adaptation and development of the software to quantitate cargo mapping analyses, and Emily Niederst for help in making the microfluidic devices. This work was supported in part by NIH-NIA grant AG032180 to L.S.B.G., and the Howard Hughes Medical Institute. L.S. was supported in part by a NIH Bioinformatics Training Grant T32 GM008806, S.E.E. was supported by a Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship, NIH Neuroplasticity Training Grant AG000216, and by a grant from The Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award, G.E.C was supported by an NIH/NCATS 1 TL1 award TR001114 and by the Achievement Rewards for College Scientists foundation.
Materials
| Reagent and Equipment Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899-20mg | |
| D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1X) | Life Technologies | 11965092 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10082147 | |
| Neurobasal-A Medium (1X) | Life Technologies | 10888022 | |
| B-27 Serum Free Supplement | Life Technologies | 10888022 | |
| GlutaMAX I Supplement (100X) | Life Technologies | 35050061 | |
| HBSS (1X) (Hank’s Balanced Salt Solution) | Life Technologies | 24020117 | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1X) | Life Technologies | 14190250 | |
| Penicillin/Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140122 | |
| Corning cellgro Water for Cell Culture | Fisher Scientific | MT46000CM | |
| Papain | USB Corporation | 19925 | |
| DL-cysteine HCl | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DNAse I grade II | Roche Applied Sciences | 10104159001 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| Formaldehyde Solution 16% EM Grade | Fisher Scientific | 50980487 | Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| HEPES | Sigma | H-3375 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-0121 | |
| BSA fatty acid and IgG free | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
| Acetone | Fisher Scientific | BP2403-4 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | |
| Cover Glass 1 1/2. 24X40mm | Corning | 2980-244 | |
| Axis microfluidic device, 450 µm | Millipore | AX450 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | |
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | N/A | |
| Coolsnap HQ camera | Roper Scientific | N/A | |
| 60 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| 150 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-100 | |
| Antibodies Used: | |||
| Anti-Kinesin light chain, V-17 | Santa Cruz | sc-13362 | specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16 ), recommended dilution 1:100. |
| Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325 | Santa Cruz | sc-9115 | specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100 |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A31573 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody | Life Technologies | A11057 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A21447 | recommended dilution 1:200. |
| Plugins and Macros | |||
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/index.html. | ||
| ImageJ Kymoraph Plugin | http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html. |
Referências
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