Характеризуя Состав молекулярных моторов на перемещение аксонов Грузы Использование "Грузовой Mapping" Анализ
Summary
Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.
Abstract
Понимание механизмов, с помощью которых молекулярные моторы координации их деятельности для транспортировки везикулярные грузов в нейронах требуется количественный анализ двигатель / грузовых ассоциаций на одном уровне пузырьков. Цель этого протокола заключается в использовании количественных флуоресцентной микроскопии соотнести ("карта") позицию и направленность движения живого груза к составу и относительных количеств двигателей, связанных с тем же грузом. "Отображение Cargo" состоит из живых изображений флуоресцентно меченных грузов, движущихся в аксонов культивируемых на микрофлюидных устройств с последующей химической фиксации во время записи живого движения, и последующее иммунофлюоресценции (ИФ) окрашивания тех же аксонов регионах с антителами против двигателей. Колокализации между грузов и связанных с ними двигателей оценивается путем присвоения позиции субпиксельную координаты моторных и грузовых каналов, по монтажу функций Гаусса к дифракционной-лираничена функции рассеяния точки, представляющие отдельные люминесцентные точечные источники. Фиксированные грузовые и моторные образы впоследствии накладывается на участках движения грузового, чтобы "карта" их на гусеничных траекторий. Сила этого протокола является сочетание живой и IF данные для записи как транспорт везикулярного грузов в живых клетках и определять двигатели, связанные с этими же самыми пузырьков. Эта методика позволяет преодолеть прежние проблемы, которые используют биохимические методы для определения средней состав двигателя очищенных гетерогенных популяций массовых пузырьков, как эти методы не выявляют композиции на отдельных движущихся грузов. Кроме того, этот протокол может быть адаптирован для анализа других транспортных и / или оборот путей в других типах клеток коррелирует движение отдельных внутриклеточных структур с их белкового состава. Ограничения этого протокола являются относительно низкая производительность за счет низкой эффективности трансфекции культивируемыхпервичные нейроны и ограниченное поле зрения, доступного для изображений с высоким разрешением. Будущие приложения могут включать в себя методы, чтобы увеличить количество нейронов, экспрессирующих флуоресцентно меченных грузов.
Introduction
Внутриклеточный транспорт имеет решающее значение во всех типах клеток для доставки белков, мембран, органелл и сигнальных молекул в различных сотовых областях 1. Нейроны являются узкоспециализированными клетки с длинными, поляризованных проекций, что критически зависят от внутриклеточного транспорта эфирных грузов для их дальней доставки различных аксонов микродоменов. Этот транспорт опосредуется кинезинов и динеинами – два больших семейств белков молекулярных двигателей – которые связываются с грузами и отслеживать вдоль поляризованных микротрубочек в антероградная и ретроградных направлений, соответственно. В то время как ретроградная движение в основном при посредничестве динеина, движение в направлении антероградной облегчается большой, функционально разнообразной семье кинезиновых двигателей. Следовательно, антероградная транспорт аксонов грузов может быть опосредовано различными членами семьи кинезина суперсемейство 1-5. Хотя некоторые грузы двигаться настойчиво в любом направлении, мОст грузы двигаться в двух направлениях и часто вспять на пути к их конечный пункт назначения 1,5-13. Кроме того, было показано, что двигатели противоположные направленности ассоциировать одновременно грузов, поднимая вопрос о том, как регулируется движение грузов координируется разнополярных двигателей 5-7. Вместе транспорт аксонов грузов является согласованные процесс, который регулируется составе двигателей и их специфических биохимических деятельности, которые в свою очередь зависят от различных адаптеров и нормативных связывающих партнеров 14.
Чтобы точно описать механизм аксонов транспорта для конкретного груза и раскрыть основную регуляцию этого транспорта, это имеет первостепенное значение для определения состава моторных белков и их нормативных связывающих партнеров, связанных с отдельными грузов во время их живого транспорта. Другие методы, например, биохимических подходов, дают оценки средней словцоили композиции на очищенных гетерогенных популяций везикул, но эти оценки не раскрывают тип или количество двигателей, связанных с одиночными движущихся пузырьков. Кроме того, восстановление везикул транспорта вдоль микротрубочек смонтированных в пробирке включен измерения количества одного типа двигателя на одном уровне пузырьков 15. Тем не менее, эти эксперименты не непосредственно коррелируют количество двигателей с транспортных характеристик этих пузырьков, и измеряется транспорт в отсутствие клеточных регулирующих факторов.
Протокол представлен здесь, который определяет состав двигателя (тип и относительное количество двигателей) отдельных движущихся пузырьков из иммунофлюоресценции данных (IF) измерительные эндогенно выраженной моторные белки, и коррелирует эти параметры в прямом перевозки тех же пузырьков в нейронах 16. Этот метод предполагает точное отображение ПЧ к проживанию данных движения грузов. Это достигается путем быть ребёнкомг нейроны гиппокампа мыши в микрофлюидных устройств соответствии с установленными протоколами 17-19. Эти устройства позволяют выявлять и корреляции («отображение») аксонов и одиночных движущихся грузов в фиксированных и живых форм световой микроскопии (рис 1). Искусственный нейроны трансфецировали флуоресцентно меченых грузовых белков, транспорт изображается с высоким пространственным и временным разрешением, чтобы получить подробную информацию движение, что строится в kymographs. В ходе обработки изображений, нейроны фиксировали параформальдегидом, а затем окрашивали антителами против эндогенных белков двигателя. Фиксированные грузовые и моторные изображения накладываются на живые kymographs движения на "карту" (локализуются) их на живого груза траекторий движения 16. Чтобы соотнести живой движение грузов с Ассоциацией моторных белков, колокализация анализируется с помощью настраиваемого сделал MATLAB пакет программного обеспечения под названием "Мотор колокализации "16,20. Флуоресцентную метку грузы и двигатели генерируют дифракционной особенности точечные, которые могут частично перекрываться. Чтобы решить эту позицию перекрытия puncta, программное обеспечение сначала автоматически вписывается гауссовых функций для каждой функции рассеяния точки, представляющие отдельные флуоресцентный puncta, чтобы определить их точное положение XY субпиксельную координаты и интенсивности амплитуд 21-23. Позиции двигателей и грузов являются затем сравниваются друг с другом, чтобы определить, колокализацию 16,20. Таким образом, этот метод более точно назначает колокализацию между флуоресцентным puncta по сравнению с другими методами 24.
Сила этого метода является возможность оценить совместную локализацию двигателей с индивидуальной груза в фиксированных клетках, для которых живые траектории движения (например, направление, в котором они двигались в момент фиксации) были RECorded. С помощью этого метода, кинезины и динеины были найдены, чтобы связать одновременно, чтобы пузырьки, которые несут нормальный белок прион (PrP C -cellular), а обогащенный neuronally груз, который перемещается в двух направлениях или остается неподвижным в аксонов 16. Этот анализ позволил сформулировать рабочую модель для регуляции PrP C движения пузырьков, в которых антероградная (кинезин) и ретроградные (динеина) двигатели координации их деятельности в целях продвижения пузырьки в любом направлении или оставаться неподвижной, а связан с грузом , Другой Сила этого метода является его потенциал широкую применимость для характеристики колокализации / объединение многих флуоресцентно меченных грузов, которые перемещаются в практически любой тип клеток, с любым другим белком (ами), представляющие интерес. Таким образом, в прямом эфире / фиксированной корреляция может потенциально обеспечить для обнаружения переходных белок-грузовых взаимодействий, как многие отдельные флуоресцентно меченных движущихся частиц могут быть проанализированы в течение желаемого рeriod времени. Учитывая широкую применимость и тип вопросов, что этот метод может рассматриваться, этот протокол будет представлять интерес для широкой аудитории клеточных биологов, включая тех, кто учится с торговлей людьми и транспортом в нейронах или в другие типы клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, представленные здесь дает соотношение направленности движения отдельных флуоресцентных микротрубочек на основе перемещения грузов частиц с относительной типа и количества связанных моторных белков в живых нейронов. Ранее общая моторная состав аксонов везикуляр…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ge Yang, Gaudenz Danuser, Khuloud Jaqaman, and Daniel Whisler for assistance with the adaptation and development of the software to quantitate cargo mapping analyses, and Emily Niederst for help in making the microfluidic devices. This work was supported in part by NIH-NIA grant AG032180 to L.S.B.G., and the Howard Hughes Medical Institute. L.S. was supported in part by a NIH Bioinformatics Training Grant T32 GM008806, S.E.E. was supported by a Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship, NIH Neuroplasticity Training Grant AG000216, and by a grant from The Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award, G.E.C was supported by an NIH/NCATS 1 TL1 award TR001114 and by the Achievement Rewards for College Scientists foundation.
Materials
| Reagent and Equipment Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899-20mg | |
| D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1X) | Life Technologies | 11965092 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10082147 | |
| Neurobasal-A Medium (1X) | Life Technologies | 10888022 | |
| B-27 Serum Free Supplement | Life Technologies | 10888022 | |
| GlutaMAX I Supplement (100X) | Life Technologies | 35050061 | |
| HBSS (1X) (Hank’s Balanced Salt Solution) | Life Technologies | 24020117 | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1X) | Life Technologies | 14190250 | |
| Penicillin/Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140122 | |
| Corning cellgro Water for Cell Culture | Fisher Scientific | MT46000CM | |
| Papain | USB Corporation | 19925 | |
| DL-cysteine HCl | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DNAse I grade II | Roche Applied Sciences | 10104159001 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| Formaldehyde Solution 16% EM Grade | Fisher Scientific | 50980487 | Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| HEPES | Sigma | H-3375 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-0121 | |
| BSA fatty acid and IgG free | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
| Acetone | Fisher Scientific | BP2403-4 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | |
| Cover Glass 1 1/2. 24X40mm | Corning | 2980-244 | |
| Axis microfluidic device, 450 µm | Millipore | AX450 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | |
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | N/A | |
| Coolsnap HQ camera | Roper Scientific | N/A | |
| 60 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| 150 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-100 | |
| Antibodies Used: | |||
| Anti-Kinesin light chain, V-17 | Santa Cruz | sc-13362 | specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16 ), recommended dilution 1:100. |
| Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325 | Santa Cruz | sc-9115 | specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100 |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A31573 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody | Life Technologies | A11057 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A21447 | recommended dilution 1:200. |
| Plugins and Macros | |||
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/index.html. | ||
| ImageJ Kymoraph Plugin | http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html. |
Referências
- Goldstein, A. Y. N., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr. Opin. Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Hirokawa, N. Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport. Science. 279, 519-526 (1998).
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68, 610-638 (2010).
- Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 682-696 (2009).
- Welte, M. A. Bidirectional transport along microtubules. Curr. Biol. 14, 525-537 (2004).
- Bryantseva, S. A., Zhapparova, O. N. Bidirectional transport of organelles: unity and struggle of opposing motors. Cell. Biol. Int. 36, 1-6 (2011).
- Gross, S. P. Hither and yon: a review of bi-directional microtubule-based transport. Phys. Biol. 1, 1-11 (2004).
- Gross, S. P., et al. Interactions and regulation of molecular motors in Xenopus melanophores. J. Cell. Biol. 156, 855-865 (2002).
- Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. Coordination of opposite-polarity microtubule motors. J. Cell. Biol. 156, 715-724 (2002).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Shubeita, G. T., et al. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1107 (2008).
- Soppina, V., Rai, A. K., Ramaiya, A. J., Barak, P., Mallik, R. Tug-of-war between dissimilar teams of microtubule motors regulates transport and fission of endosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 19381-19386 (2009).
- Verhey, K. J., Hammond, J. W. Traffic control: regulation of kinesin motors. Nat Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 765-777 (2009).
- Hendricks, A. G., et al. Motor Coordination via a Tug-of-War Mechanism Drives Bidirectional Vesicle Transport. Current Biol. 20, 697-702 (2010).
- Encalada, S. E., Szpankowski, L., Xia, C. -. h., Goldstein, L. S. B. Stable kinesin and dynein assemblies drive the axonal transport of mammalian prion protein vesicles. Cell. 144, 551-565 (2011).
- Harris, J., et al. Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. 9 (410), (2007).
- Harris, J., et al. Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons. J Vis. Exp. 7 (261), (2007).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat. Methods. 2, 599-605 (2005).
- Szpankowski, L., Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. Subpixel colocalization reveals amyloid precursor protein-dependent kinesin-1 and dynein association with axonal vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 8582-8587 (2012).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat. Methods. 5, 695-702 (2008).
- Thomann, D., Dorn, J., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag localization II: Improvement in super-resolution by relative tracking. J. Microsc. 211, 230-248 (2003).
- Thomann, D., Rines, D. R., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag detection in 3D with super-resolution: application to the analysis of chromosome movement. J. Microsc. 208, 49-64 (2002).
- Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
- Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. J. Vis. Exp. 29 (19), (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Moore, D. S., McCabe, G. P. . Introduction to the Practice of Statistics. , (2005).
