La caracterización de la composición de los motores moleculares sobre el logro axonal Cargo Uso del análisis "Mapeo de carga"
Summary
Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.
Abstract
La comprensión de los mecanismos por los cuales los motores moleculares coordinan sus actividades para el transporte de cargas vesiculares dentro de las neuronas requiere el análisis cuantitativo de las asociaciones de motor / carga a nivel de la vesícula sola. El objetivo de este protocolo es el uso de microscopía de fluorescencia cuantitativa para correlacionar ("mapa") la posición y la direccionalidad del movimiento de la carga en vivo a las cantidades relativas de composición y motores asociados con la misma carga. "Mapeo de carga" se compone de imágenes en vivo de las cargas marcados con fluorescencia que se mueven en los axones cultivadas en dispositivos de microfluidos, seguido por fijación química durante la grabación de movimiento en vivo, y la posterior inmunofluorescencia (IF) tinción de las mismas regiones axonal exactas con anticuerpos contra los motores. Colocalización entre las cargas y los correspondientes motores se evalúa mediante la asignación de la posición de sub-píxel coordina a los canales de motor y de carga, por las funciones de ajuste de Gauss a la difracción de lifunciones de dispersión de punto mited representan fuentes puntuales fluorescentes individuales. De carga y de motor imágenes fijas se superponen posteriormente a parcelas de movimiento de carga, al "mapa" a sus trayectorias seguidas. La fuerza de este protocolo es la combinación de datos en vivo y SI para grabar tanto en el transporte de cargas vesiculares en células vivas y para determinar los motores asociados a estas mismas vesículas exactas. Esta técnica supera los desafíos anteriores que utilizan métodos bioquímicos para determinar la composición media del motor de las poblaciones de vesículas purificadas a granel heterogéneos, ya que estos métodos no revelan composiciones sobre cargas móviles individuales. Además, este protocolo se puede adaptar para el análisis de otras vías de transporte y / o trata de personas en otros tipos de células para correlacionar el movimiento de las estructuras intracelulares individuales con su composición de proteínas. Las limitaciones de este protocolo son el relativamente bajo rendimiento debido a las bajas eficiencias de transfección de cultaneuronas primarias y un campo de visión limitado disponible para imágenes de alta resolución. Las aplicaciones futuras podrían incluir métodos para aumentar el número de neuronas que expresan cargas marcados con fluorescencia.
Introduction
Transporte intracelular es crítico en todos los tipos de células para el suministro de proteínas, membranas, orgánulos, y moléculas de señalización a varios dominios celulares 1. Las neuronas son células altamente especializadas con proyecciones largas y polarizadas que dependen críticamente de transporte intracelular de las cargas esenciales para su entrega a larga distancia a diferentes microdominios axonal. Este transporte está mediado por kinesins y dyneins – dos grandes familias de proteínas motoras moleculares – que se unen a las cargas y realizar un seguimiento a lo largo de los microtúbulos polarizados en direcciones anterógrada y retrógrada, respectivamente. Mientras movimiento retrógrado está mediada principalmente por la dineína, el movimiento en la dirección anterógrada se ve facilitada por una gran familia, diversidad funcional de los motores de quinesina. En consecuencia, el transporte axonal anterógrado de cargas podría estar mediado por diversos miembros de la familia de la superfamilia kinesin 1-5. Aunque algunas cargas se mueven persistentemente en cualquier dirección, ma mayoría de las cargas se mueven de forma bidireccional y revertir con frecuencia en su camino a su destino final 1,5-13. Además, se ha demostrado que los motores de oponerse a la direccionalidad asociado simultáneamente a las cargas, planteando la cuestión de cómo el movimiento regulado de cargas está coordinado por motores de polaridad opuesta 5-7. En conjunto, el transporte de cargas axonal es un proceso concertado que está regulada por la composición de los motores y sus actividades bioquímicas específicas, las cuales a su vez dependen de diversos adaptadores y parejas de unión de regulación 14.
Para describir fielmente el mecanismo de transporte axonal para una carga específica y para descubrir la regulación subyacente de que el transporte, es de suma importancia para determinar la composición de las proteínas de motor y de sus compañeros de unión regulatorios asociados con cargas individuales durante su transporte en vivo. Otros métodos, como por ejemplo los enfoques bioquímicos, proporcionan estimaciones de mot promedioo composiciones en las poblaciones heterogéneas de vesículas purificadas, pero estas estimaciones no revelan el tipo o la cantidad de motores asociados a vesículas móviles individuales. Además, la reconstitución de transporte de vesículas a lo largo de los microtúbulos premontados in vitro permitió medir la cantidad de un tipo de motor en un solo nivel de la vesícula 15. Sin embargo, estos experimentos no se correlacionaron directamente la cantidad de motores con las características de transporte de estas vesículas, y se midió el transporte en ausencia de factores reguladores celulares.
Un protocolo es presentado aquí, que determina la composición de motor (tipo y cantidad relativa de motores) de las vesículas móviles individuales de inmunofluorescencia (IF) de datos de medición de forma endógena expresaron proteínas motoras, y correlaciona estos parámetros para el transporte directo de las mismas vesículas exactas en las neuronas 16. Este método implica el mapeo preciso de los datos de movimiento de carga SI-a-live. Esto se logra mediante growing neuronas del hipocampo de ratones en los dispositivos de microfluidos siguientes establecieron protocolos 17-19. Estos dispositivos permiten la identificación y correlación ("mapeo") de los axones y las cargas móviles individuales en las modalidades de microscopía de luz fijas y en directo (Figura 1). Neuronas cultivadas se transfectaron con proteínas marcadas con fluorescencia de carga cuyo transporte está fotografiado en la alta resolución espacial y temporal para obtener información detallada movimiento que se traza en kymographs. Durante el curso de formación de imágenes, las neuronas se fijaron con paraformaldehído, y posteriormente se tiñeron con anticuerpos contra las proteínas motoras endógenos. De carga y de motor imágenes fijas se superponen en kymographs movimiento vivo de "mapa" (colocalize) a la carga viva movimiento trayectorias 16. Para correlacionar el movimiento vivo de las cargas con la asociación de proteínas motoras, colocalización se analiza el uso de un paquete de software MATLAB encargo llamado "Motor Colocalización "16,20. Cargas y motores marcados con fluorescencia generan características puntiformes de difracción limitada que pueden superponerse parcialmente. Para resolver la situación de los puntos lagrimales se superponen, el software se adapta automáticamente primero las funciones de Gauss para cada función de dispersión, lo que representa puncta fluorescente individuo, para determinar su posición exacta XY sub-píxel coordina e intensidad amplitudes 21-23. Las posiciones de los motores y las cargas son posteriormente se comparan entre sí para determinar colocalización 16,20. Por lo tanto, este método asigna más precisamente colocalización entre puncta fluorescente en comparación con otros métodos 24.
La fuerza de este método es la capacidad de evaluar la colocalización de los motores con carga individual en células fijadas, para el que las trayectorias de movimiento en vivo (por ejemplo, la dirección en la que se movían en el momento de la fijación) han sido recorded. Con este método, se encontraron kinesins y dyneins para asociar simultáneamente a vesículas que llevan la proteína priónica normal (PrP C -Celular), una carga neuronalmente enriquecido que se mueve bidireccionalmente o permanece estacionario en los axones 16. Este análisis permitió la formulación de un modelo de trabajo para la regulación de la PrP C en la que el movimiento de vesículas anterógrada (kinesina) y (dineína) motores retrógradas coordinan sus actividades con el fin de mover las vesículas en cualquier dirección o permanecer estacionario mientras asociada a la carga . Otro punto fuerte de este método es su aplicabilidad potencial amplio para la caracterización de colocalización / asociación de muchas cargas marcados con fluorescencia que se mueven en virtualmente cualquier tipo de célula, con cualquier otra proteína (s) de interés. Por lo tanto, la correlación en vivo / fijo potencialmente podría permitir la detección de transitorios interacciones proteína-carga, como muchos fluorescentemente marcado individuo partículas en movimiento puede ser analizada sobre un p deseadaeriodo de tiempo. Dada la amplia aplicabilidad y el tipo de preguntas que este método puede abordar, este protocolo será de interés para una amplia audiencia de los biólogos celulares, incluyendo los que estudian el tráfico y el transporte en las neuronas o en otros tipos de células.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo que aquí se presenta permite la correlación de direccionalidad del movimiento de las partículas de carga en movimiento basado en microtúbulos fluorescentes individuales con el tipo de relación y la cantidad de proteínas motoras asociadas en las neuronas vivas. Anteriormente, la composición total de cargas del motor axonal vesiculares fue ensayada en poblaciones heterogéneas de vesículas y orgánulos 9,15 bioquímicamente purificados. Sin embargo, la caracterización de …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ge Yang, Gaudenz Danuser, Khuloud Jaqaman, and Daniel Whisler for assistance with the adaptation and development of the software to quantitate cargo mapping analyses, and Emily Niederst for help in making the microfluidic devices. This work was supported in part by NIH-NIA grant AG032180 to L.S.B.G., and the Howard Hughes Medical Institute. L.S. was supported in part by a NIH Bioinformatics Training Grant T32 GM008806, S.E.E. was supported by a Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship, NIH Neuroplasticity Training Grant AG000216, and by a grant from The Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award, G.E.C was supported by an NIH/NCATS 1 TL1 award TR001114 and by the Achievement Rewards for College Scientists foundation.
Materials
| Reagent and Equipment Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899-20mg | |
| D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1X) | Life Technologies | 11965092 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10082147 | |
| Neurobasal-A Medium (1X) | Life Technologies | 10888022 | |
| B-27 Serum Free Supplement | Life Technologies | 10888022 | |
| GlutaMAX I Supplement (100X) | Life Technologies | 35050061 | |
| HBSS (1X) (Hank’s Balanced Salt Solution) | Life Technologies | 24020117 | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1X) | Life Technologies | 14190250 | |
| Penicillin/Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140122 | |
| Corning cellgro Water for Cell Culture | Fisher Scientific | MT46000CM | |
| Papain | USB Corporation | 19925 | |
| DL-cysteine HCl | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DNAse I grade II | Roche Applied Sciences | 10104159001 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| Formaldehyde Solution 16% EM Grade | Fisher Scientific | 50980487 | Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| HEPES | Sigma | H-3375 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-0121 | |
| BSA fatty acid and IgG free | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
| Acetone | Fisher Scientific | BP2403-4 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | |
| Cover Glass 1 1/2. 24X40mm | Corning | 2980-244 | |
| Axis microfluidic device, 450 µm | Millipore | AX450 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | |
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | N/A | |
| Coolsnap HQ camera | Roper Scientific | N/A | |
| 60 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| 150 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-100 | |
| Antibodies Used: | |||
| Anti-Kinesin light chain, V-17 | Santa Cruz | sc-13362 | specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16 ), recommended dilution 1:100. |
| Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325 | Santa Cruz | sc-9115 | specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100 |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A31573 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody | Life Technologies | A11057 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A21447 | recommended dilution 1:200. |
| Plugins and Macros | |||
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/index.html. | ||
| ImageJ Kymoraph Plugin | http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html. |
Referências
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