「カーゴマッピング」解析を用いた軸索貨物を移動するに分子モーターの構成を特徴づける
Summary
Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.
Abstract
分子モーターは、ニューロン内の小胞の貨物を輸送するために彼らの活動を調整するメカニズムを理解することは、単一の小胞レベルでのモータ/貨物協会の定量分析を必要とします。このプロトコルの目的は、組成物及び貨物に関連付けられているモータの相対量は、ライブ貨物の移動（「マップ」）の位置と方向を相関させるために、定量的蛍光顕微鏡を使用することである。 「カーゴマッピングは「ライブのライブ運動の記録中に化学固定に続いてマイクロ流体デバイス上で培養した軸索に移動、蛍光標識された貨物のイメージング、およびモータに対する抗体を用いた、まったく同じ軸索の領域のその後の免疫蛍光（IF）染色で構成されています。貨物およびそれらに関連するモータ間の共局在は、サブピクセル位置を割り当てることによって評価される回折李にガウス関数をフィッティングすることにより、モータ及び荷役チャンネル座標個々の蛍光点光源を表すmited点広がり関数。固定された貨物とモータの画像は、その後、彼らの追跡軌跡にそれらを「マップ」するために、荷動きのプロットに重畳される。データは、生細胞内の小胞貨物の輸送の両方を記録するために、これらのまったく同じ小胞に関連したモータを決定する場合は、このプロトコルの強さは、ライブの組み合わせですと。この技術は、これらの方法は、単一の移動貨物上の組成物を明らかにしないように、精製された不均質バルクベシクル集団の平均運動の組成を決定するために、生化学的方法を使用して、前の課題を克服する。さらに、このプロトコルは、それらのタンパク質組成を有する個々の細胞内構造の動きを相関させるために他の細胞型で他の輸送及び/又はトラフィッキング経路の分析に適合させることができる。このプロトコルの制限事項は、培養の低いトランスフェクション効率に起因する比較的低いスループットである一次ニューロンおよび高分解能イメージングのために使用可能な制限された視野。将来のアプリケーションには、蛍光標識された貨物を発現するニューロンの数を増加させる方法を含むことができる。
Introduction
細胞内輸送は、種々の細胞ドメイン1へのタンパク質、膜、細胞小器官、およびシグナル伝達分子を送達するための全ての細胞型において非常に重要です。ニューロンは、批判的にさまざまな軸索マイクロドメインへの長距離配信のために不可欠な貨物の細胞内輸送に依存して長く、偏予測と高度に特殊化した細胞である。二つの大きな分子モータータンパク質のファミリ – – この輸送はキネシンとダイニンによって媒介される貨物に結合すると、それぞれ、順行と逆行方向に偏光した微小管に沿って追跡する。逆行移動は主にダイニンによって媒介されるが、順行方向の移動は、キネシンモーターの大きい、機能的に多様なファミリーによって促進される。その結果、軸索貨物の順行性輸送は、キネシンスーパーファミリー1-5の様々な家族によって媒介される可能性があります。一部の貨物は、どちらの方向にも持続的にメートルを移動しますがOST貨物は双方向に移動し、その最終的な目的地1,5-13に向かう途中で頻繁に逆転。さらに、示されている、貨物同時に指向性会合に対向する貨物の移動が規制反対の極性モータ5-7によって調整されるかという疑問を上げるモーター。一緒に、軸索貨物の輸送はモーターと順番に様々なアダプタおよび規制上の結合パートナー14に依存している彼らの特異的な生化学的な活動、の組成によって調節されている協調プロセスです。
忠実に特定の貨物軸索輸送のメカニズムを説明するために、その輸送の基礎となる規則を発見するためには、ライブの輸送中に、個々の貨物に関連付けられたモータータンパク質とその調節結合パートナーの組成を決定するために最も重要である。他の方法は、例えば生化学的アプローチのために、平均のmotの推定値を提供するまたは精製された異種のベシクル集団上の組成が、これらの推定値は、単一の移動小胞に関連するモータの種類や金額を明らかにしない。また、in vitroで 、予め組み立てられた微小管に沿った小胞輸送の再構成は、単一の小胞のレベル15で、モータの一種の量を測定可能にした。しかし、これらの実験は、直接これらの小胞の輸送特性のモータの量を相関し、細胞調節因子の非存在下での輸送を測定しなかった。
内因的に測定する（IF）データはモータータンパク質を発現した免疫蛍光からの個別の移動小胞の運動組成物（タイプとモーターの相対的な量）を決定し、ニューロンにおける正確に同じ小胞のライブトランスポートにこれらのパラメータを関連付けるここに提示されているプロトコル16。この方法は、IF存続荷物移動データの正確なマッピングを必要とする。これはgrowinことによって達成される確立されたプロトコルの17-19を以下のマイクロ流体デバイスにおけるG海馬マウスのニューロン。これらのデバイスは、固定とライブ光学顕微鏡モダリティにおける軸索および単一可動貨物の識別と相関関係 （「マッピング」）（ 図1）を可能にします。培養されたニューロンは、その輸送kymographsにプロットされている詳細な移動情報を取得するために、高い空間分解能及び時間分解能で画像化された蛍光標識された貨物のタンパク質をトランスフェクトする。画像化の過程で、神経細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、その後、内因性のモータータンパク質に対する抗体で染色した。固定された貨物とモータの画像は動きが16軌道ライブ貨物にそれらを「地図」（共局在）するライブ移動kymographsに重畳されている。モータータンパク質との会合を持つ貨物のライブの動きを相関させるために、共局在は、「Moを呼ばれるカスタムメイドのMATLABソフトウェアパッケージを用いて分析されているTOR共局在」16,20。蛍光標識された貨物とモーターが部分的に重複することができ、回折限界点状の特徴を生成する。涙点の重複の位置を解決するために、ソフトウェアが最初に自動的にそれらの正確なXYサブピクセル位置座標を決定するために、個々の蛍光涙点を表し、それぞれの点広がり関数をガウス関数に適合し、強度が21-23振幅。モータや貨物の位置である続いて共局在16,20を決定するために、互いに比較した。したがって、この方法は、より正確に、他の方法24に比べて、蛍光涙点間の共局在を割り当てる。
この方法の強みは、ライブの移動軌跡（例えば、それらは定着時に移動された方向）のrecされているために、固定された細胞内の個々の貨物とモータの共局在化を評価する能力であるorded。この方法では、キネシンおよびダイニンは、（のPrP Cの -cellular）双方向に移動させ、あるいは軸索16で静止したままでneuronally富化貨物を正常なプリオンタンパク質を運ぶ小胞に同時に関連付けることが見出された。この分析は、貨物に関連しながら、順行（キネシン）と逆行（ダイニン）モータがどちらの方向に小胞を移動するか、静止したままにするために彼らの活動を調整するPrP Cから小胞の動きの調節をワーキングモデルの定式化を可能にした。この方法の別の強さは、目的の任意の他のタンパク質（単数または複数）と、実質的に任意の細胞型の中で移動する多数の蛍光標識された貨物の共局在化/会合を特徴付けるためのその潜在広い適用である。多くの個々の蛍光を移動する粒子が所望のページを介して分析することができる標識したがって、生/固定された相関関係は、潜在的に、一過性のタンパク質 – カーゴ相互作用の検出を可能にすることができ時間のeriod。幅広い適用性と、このメソッドが対処できる質問の種類を考えると、このプロトコルは、ニューロンまたは他の細胞型のもの勉強人身売買および輸送を含む細胞生物学者の幅広い視聴者を対象としています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで紹介するプロトコルは、ライブニューロンにおける相対的なタイプと関連したモータータンパク質の量と個々の蛍光微小管ベースの移動貨物粒子の運動の方向性との相関を可能にします。以前は、軸索水疱貨物の総運動組成物は、生化学的に精製された小胞およびオルガネラ9,15の不均一な集団で検定した。しかし、細胞内での貨物のシングルタイプの特徴?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ge Yang, Gaudenz Danuser, Khuloud Jaqaman, and Daniel Whisler for assistance with the adaptation and development of the software to quantitate cargo mapping analyses, and Emily Niederst for help in making the microfluidic devices. This work was supported in part by NIH-NIA grant AG032180 to L.S.B.G., and the Howard Hughes Medical Institute. L.S. was supported in part by a NIH Bioinformatics Training Grant T32 GM008806, S.E.E. was supported by a Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship, NIH Neuroplasticity Training Grant AG000216, and by a grant from The Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award, G.E.C was supported by an NIH/NCATS 1 TL1 award TR001114 and by the Achievement Rewards for College Scientists foundation.
Materials
| Reagent and Equipment Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899-20mg | |
| D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1X) | Life Technologies | 11965092 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10082147 | |
| Neurobasal-A Medium (1X) | Life Technologies | 10888022 | |
| B-27 Serum Free Supplement | Life Technologies | 10888022 | |
| GlutaMAX I Supplement (100X) | Life Technologies | 35050061 | |
| HBSS (1X) (Hank’s Balanced Salt Solution) | Life Technologies | 24020117 | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1X) | Life Technologies | 14190250 | |
| Penicillin/Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140122 | |
| Corning cellgro Water for Cell Culture | Fisher Scientific | MT46000CM | |
| Papain | USB Corporation | 19925 | |
| DL-cysteine HCl | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DNAse I grade II | Roche Applied Sciences | 10104159001 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| Formaldehyde Solution 16% EM Grade | Fisher Scientific | 50980487 | Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| HEPES | Sigma | H-3375 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-0121 | |
| BSA fatty acid and IgG free | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
| Acetone | Fisher Scientific | BP2403-4 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | |
| Cover Glass 1 1/2. 24X40mm | Corning | 2980-244 | |
| Axis microfluidic device, 450 µm | Millipore | AX450 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | |
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | N/A | |
| Coolsnap HQ camera | Roper Scientific | N/A | |
| 60 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| 150 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-100 | |
| Antibodies Used: | |||
| Anti-Kinesin light chain, V-17 | Santa Cruz | sc-13362 | specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16 ), recommended dilution 1:100. |
| Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325 | Santa Cruz | sc-9115 | specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100 |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A31573 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody | Life Technologies | A11057 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A21447 | recommended dilution 1:200. |
| Plugins and Macros | |||
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/index.html. | ||
| ImageJ Kymoraph Plugin | http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html. |
Referências
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