Abstract
Centrosomes är små men viktiga organeller som fungerar som poler mitotiska spindeln för att bibehålla genomisk integritet eller montera primära cilier att underlätta sensoriska funktioner i celler. Nivån för ett protein kan regleras på olika sätt vid centrosomes än vid andra .cellular platser, och variationen i centrosomal nivån av flera proteiner vid olika punkter i cellcykeln verkar vara avgörande för en korrekt reglering av Centriol montering. Vi utvecklade en kvantitativ fluorescensmikroskopi analys som mäter relativa förändringar i nivån av ett protein vid centrosomes i anläggningstillgångar celler från olika prover, såsom vid olika faser av cellcykeln eller efter behandling med olika reagens. Principen för denna analys ligger i att mäta bakgrundskorrigerade fluorescerande intensitet motsvarande ett protein på ett litet område, och normalisera att mätning mot samma för ett annat protein som inte varierar under valda experimentella condition. Med användning av denna analys i kombination med BrdU puls och chase strategi för att studera ostörda cellcykler, har vi kvantitativt validerat vår senaste observationen att centrosomal pool av VDAC3 regleras på centrosomes under cellcykeln, sannolikt genom proteasom-förmedlad nedbrytning specifikt på centrosomes.
Introduction
Centrosomes består av ett par av centrioler omgivna av pericentriolar material (PCM). Att de stora mikrotubuli organiseringscentrum (MTOCs) i däggdjursceller, centrosomes fungera som två poler mitotiska spindlar i delande celler, och därmed bidra till att upprätthålla genomisk integritet 1. I vilande celler (t.ex. under G0 fas), en av de två centrioler av Centrosom, nämligen moder Centriol, transformeras till en basal kropps att montera den primära cilium, en sensorisk organell utskjutande ut från cellytan 2. När cellerna åter in i cellcykeln, är primära cilier isär och varje Centriol dirigerar monteringen av en procentriole vid dess proximala ände som gradvis förlängs för att bilda en mogen Centriol 3. Vid början av S-fasen, är en kärrhjulsluster liknande struktur som ger den 9-faldig symmetri till Centriol bildats på ytan av varje befintlig Centriol och kommer att bli basen av varje procentriole. Sas6 thatt är oumbärlig för Centriol aggregatet rekryteras för att bilda navet i kärrhjulsluster 4-6. Andra centriolar proteiner monteras sedan på kärrhjul i en starkt reglerad, proximalt distala sätt 7. Efter exakt avslutat Centriol duplicering, celler montera ytterligare pericentriolar material för att bygga två funktionella centrosomes i slutet av G2-fasen 8. Utöver kärn centriolar komponenterna 9-11, flera andra proteiner inklusive kinaser, fosfataser, chaperones, ställningskomponenter, membran associerade proteiner och maskiner nedbrytningen är förknippade med centrioler, basala organ och PCM vid olika tider på cellcykeln 12-16. Det är ofta noteras att centrosomal nivåerna av många proteiner tidsmässigt regleras av centrosomal inriktningsmekanismer och / eller proteasomal nedbrytning vid centrosomes. Viktigt svängningarna i centrosomal nivån av flera proteiner såsom Plk4, Mps1, Sas6 och CP110 at olika punkter av cellcykeln tycks vara avgörande för att reglera Centriol montering 5,17-22, och i fallet med Mps1 förhindra detta centrosomal nedbrytning leder till bildandet av överskott centrioler 19. Å andra sidan, de centrosomal fraktioner av flera proteiner är mindre labila än cytosoliska pooler. Exempelvis siRNA-medierad nedreglering av Centrin 2 (Cetn2) ledde endast till en måttlig minskning av proteinet nivå vid centrioler trots stor minskning av dess hela cellnivåer 23. Därför är det viktigt att mäta förändringar i nivån av centrosomal proteiner vid Centrosom snarare än att mäta hela cellproteinnivåer vid bedömningen sina Centrosom specifika funktioner.
I denna studie har vi utvecklat en analys med hjälp av indirekt immunofluorescens (IIF) för att kvantifiera den relativa nivån av ett protein vid centrosomes. Denna assay har utvecklats särskilt för att analysera celler som är från olika proveroch sålunda inte kan avbildas samtidigt. Dessa prover kan vara celler som behandlats med olika reagenser (dvs läkemedel mot kontroll), insamlade vid olika tidpunkter (dvs puls kontra chase), eller är i olika faser av cellcykeln. Principen för denna analys ligger i att mäta bakgrunden korrigerade fluorescensintensiteten som motsvarar ett protein på ett litet område och att normalisera detta värde mot densamma för ett annat protein vars nivåer inte varierar under de valda försöksbetingelserna. Flera studier i Centrosom biologin har nyligen utnyttjat olika kvantitativa mikroskopitekniker, i båda levande eller fixerade celler, för att bestämma Centrosom specifika funktion kandidatproteiner 24-27. Liknar dessa analyser, föreliggande teknik mäter också bakgrundskorrigerad fluorescensintensiteten hos testproteinet. Dock skulle införandet av normalisering med en intern standard i denna analys sannolikt erbjuda störrenoggrannhet och självförtroende i att analysera två olika prover som är på två olika täck. Dessutom, förutom att undersöka proteinnivån vid centrosomes, med mindre justeringar denna metod kan tillämpas på en mångfald av experimentella betingelser eller vid andra cellulära platser.
Här kombinerar vi vårt kvantitativa mikroskopi analys med en BrdU puls-chase strategi att jämföra celler från olika cellcykelsteg. Istället för att använda standardcellcykelstopp och frisättningstekniker för att studera olika cellcykeltidpunkter, asynkront växande celler inkuberas med BrdU att märka celler i S-fas, och de märkta cellerna jagade under olika tider (vanligtvis 4-6 h). De flesta av de märkta cellerna kommer att vara i S-fas omedelbart efter pulsen. Längden på jakten väljs så att efter jakten, kommer märkta celler att vara i slutet av S, G2, eller mitos, vilket kan verifieras genom morfologiska egenskaper som- ställning för centrosomes avseende nuclei, avståndet mellan centrosomes, kondensation av kromosomer etc. Således längd jakten beror på den genomsnittliga längden på S, G2 och M fasen av en viss celltyp. Eftersom detta tillvägagångssätt undviker cellcykelinhibitorer såsom hydroxiurea, afidikolin, nokodazol, etc., gör det en mer fysiologiskt relevant cellcykelanalys.
Således visar vi här att den kvantitativa fluorescensmikroskopi analys ensamt eller i kombination med BrdU puls-chase-analysen, är en enkel men kraftfull teknik för att noggrant mäta de relativa förändringarna i centrosomal nivån för en kandidat protein under en oberörd cellcykeln. Vi mätte centrosomal nivån VDAC3, ett protein som vi nyligen identifierat vid centrosomes förutom mitokondrier 16,28, med användning av dessa analyser. Resultat som erhållits här verifiera vår tidigare iakttagelse att centrosomal pool av VDAC3 regleras av nedbrytning, och varierar också i en cellcykel beroendent sätt 16, dessutom validera tillämpligheten av detta förfarande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellkultur
- Använd humant telomeras omvänt transkriptas (hTERT) förevigade retinala pigmentepitelceller (hTERT-RPE1; här kallad RPE1).
OBS: RPE1 celler är nära-diploida, icke-transformerade humana celler som vanligen används för att studera Centriol montering och ciliogenesis. Dessa celler följer en normal Centriol dubbelcykel samordnas med en reglerad cellcykeln. - Passage en nästan konfluent 100 mm cellodlingsskål av RPE1 celler vid 1: 5 spädning av den ursprungliga kulturen till en färsk 100 mm skål innehållande 10 ml av DME / F-12 (1: 1) medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin G och 100 | ig / ml streptomycin (det kompletta mediet benämnes såsom DME / F-12-medium). Odla cellerna vid 37 ° C i närvaro av 5% CO2.
- Inkubera 12 mm runda täckglas i 50 ml av en N HCl i en täckt glasbägare, O / N utan skakning, vid 60 ° C i ett vattenbad eller en inkubator.
- After kasta den sura lösningen, tvätta täckglasen tre gånger i 100 ml destillerat vatten genom inkubation i 15 min med tillfällig skakning. Upprepa tvättningen på liknande sätt i 70% etanol och 95% etanol.
- Torka täckglasen genom att individuellt sprida ut dem på en laboratorieläskpapper i en biosäkerhetsskåp, följt av sterilisering med UV-strålning under 60 min.
- Placera 2-4 torra täck i en 35 mm cellodlingsskål. Späd lösningen av fibronektin eller fibronektin som engineered polymeren (stamkoncentration av 1 mg / ml) till en koncentration av 25 | ig / ml i cellkultur PBS.
- Placera 80-100 pl av den utspädda lösningen på varje täckglas och inkubera i 60 min till belägga övre sidan av täckglas. Tvätta täckglasen tre gånger använder PBS innan du lägger komplett medium.
2. växande celler och behandla celler med proteasomhämmare
- Passage 2 x 10 5 asynkront växaIng RPE1 celler i varje 35 mm maträtt som innehåller täck och odla celler i 2 ml komplett medel. Byt odlingsmediet varje 24 h med färsk förvärmda komplett medium.
- För att analysera effekten av proteasomhämning på centrosomal nivån av testproteinet (här VDAC3 eller γ-tubulin), odla cellerna i två 35 mm rätter för 44 timmar. Byt odlingsmediet med komplett medium och tillsätt antingen MG115 eller DMSO som kontroll lösningsmedel vid en slutlig koncentration av 5 pM eller 0,05% respektive. Samtidigt, till BrdU till cellerna vid en slutlig koncentration av 40 | iM och inkubera cellerna under 4 h.
- Överför varje täckglas i en 24-brunnsplatta. Lägg 500 | il kyld metanol till varje brunn och inkubera plattan vid -20 ° C under 10 min för att fixera cellerna på täckglas. Tvätta omedelbart täckglasen tre gånger med 500 ul tvättbuffert (1x PBS innehållande 0,5 mM MgCl2 och 0,05% Triton-X 100).
- Skörda restceller från 35 mm skål och centrifugera cellerna vid 1000 xg under 5 min. Använd cellpelleten för att analysera det totala proteinet genom western blotting (steg 6).
3. BrdU Puls och Chase analys för att analysera proteinnivåer i olika cellcykelfaser
- För att analysera variationen av nivån av ett protein (här VDAC3, Sas6 eller Cep135) vid centrosomes vid olika faser av cellcykeln, odla celler i två 35 mm skålar innehållande täck för 44 timmar. Byt odlingsmediet med komplett medium innehållande 40 | iM BrdU och inkubera cellerna under 4 timmar i cellodlingsinkubator.
- Från en maträtt, överföra täck till en 24-brunnar för att fixera cellerna använder kyld metanol som beskrivs i steg 2.1.2.
- Efter 4 tim BrdU puls, avlägsna BrdU-innehållande medium, tvätta cellerna en gång med PBS och en gång med fullständigt medium, tillsätt färskt medium, och sedan odla cellerna i frånvaro av BrdU i olika tider (vanligtvis en annan 4 timför RPE1 celler) innan fastställande av cellerna som beskrivs i steg 2.1.2.
NOTERA: För RPE1 celler, majoriteten av BrdU-positiva celler är i sen S eller G2-fas efter en 4 h chase. Detta måste bestämmas individuellt för varje celltyp.
4. Immunfärgning
- Inkubera de fixerade cellerna på täckglas i 200 | il blockerande buffert (2% BSA och 0,1% Triton X-100 i 1 x PBS) under 30 min.
- Inkubera cellerna med en blandning av primära antikroppar (typiskt en upphöjd i kanin och en annan upp i mus) utspätt i blockeringsbuffert O / N vid 4 ° C i en fuktad kammare.
- För att göra en fuktkammare, lägga en våt pappershandduk i den nedre halvan av en tom 1000 il pipettspets rutan. Lägg en remsa av Parafilm på rackytan, och ser en droppe (15-20 l) av antikroppslösningen på Parafilm för varje täck ska inkuberas. Invertera en täckglas på en droppe av antikropplösning (så att cellerna är nedsänkta) och näralocket av spetslådan.
- Vänd täck igen och returnera dem tillbaka till 24-bra maträtt. Tvätta täck och därefter inkubera dem i 150 | il sekundär antikropp blandning (här grön-fluorescerande färgämne konjugerat anti-kanin och röd-fluorescerande färgämne konjugerat anti-mus utspädd i blockeringsbuffert) under 1 h vid RT. Tvätta täckglasen tre gånger.
OBS: fluoroforen-konjugerade sekundära antikroppar är ljuskänsliga. Skydda proverna från ljus under steg 4.1.3-5.1.2.
- Förbered för anti-BrdU-färgning genom att fastställa de färgade RPE1 cellerna igen med 500 | il kyld metanol vid -20 ° C under 10 min, såsom beskrivs i steg 2.1.2. Tvätta täckglasen tre gånger.
OBS: Denna fixering säkrar primär och sekundär märkning av protein (er) av intresse antikropp under syrahydrolysen processen i det följande steget.- Inkubera cellerna i 200 ul av 2 N HCl under 30 min vid RT. Neutralisera med 300 | il av 1 M Tris-Cl, pH 8 end tvätta cellerna tre gånger med tvättbuffert.
- Blockera cellerna igen med användning av 200 | il blockerande buffert under 30 min vid RT.
- Inkubera cellerna med rått-anti-BrdU-antikropp (utspädd i blockeringsbuffert) under 45 min vid 37 ° C i en fuktad kammare. Återgå täckglasen tillbaka till 24-väl skålen, tvätta dem och sedan inkubera med blå-fluorescerande färgämne konjugerat anti-råtta sekundär antikropp (utspädd i 150 l blockerande buffert i 24-väl skålen för 1 timme vid RT.
- Tvätta täckglasen tre gånger. Spot en droppe (ca 3-6 l) av en monteringslösning innehållande antifade reagens på ett glas objektglas. Vänd ett täck, med cellsidan nedåt, på monteringslösningen. Torka överflödig vätska genom att försiktigt trycka täck mot glid använder mjuka rengöringsvävnad. Applicera genomskinligt nagellack längs kanten av täckglas för att täta den på objektglas.
5. Immunofluorescens Bild Acquisition och analys
- Använd en 100X Plan Apo oljeimmersionsobjektiv (med en 1,4 numerisk bländare) att förvärva bilder av BrdU-positiva RPE1 celler vid rumstemperatur.
- Sätt en bild på mikroskop (se utrustning) fäst med en kamera som kan digital bildbehandling. För varje fluorofor, bestämma den lämpliga exponeringstiden (typiskt mellan 300-1,000 msek) genom att manuellt granska alla prov av ett experiment. Innan de kan få bilder av en cell, bestämma den lämpliga övre och nedre fokalplanet längs Z-axeln (typiskt 0,2 ^ m stegstorlek) manuellt. Förvärva bilder av olika prover som är på separata täck använder identiska exponeringstid för olika fluoroforer längs Z-axeln med hjälp av en digital mikroskopi bildbehandling.
- Utför deconvolution (i dessa fall använder Nej granne algoritm) för alla bildstaplar förvärvats längs Z-axeln.
- Skaffa den totala intensiteten projektion av varje bild stack tillsammansZ-axeln.
- I celler där centrosomes är nära (avståndet mellan två centrosomes är mindre än 2 ^ m), rita en liten fyrkant (typiskt 20-30 pixlar per sida) runt båda centrosomes och markera det markerade området.
- Rita en större kvadrat (typiskt 24-35 pixlar per sida) som omger den första torget och markera det markerade området i det stora torget.
- Skaffa området (A) och den totala fluorescensintensiteten (F) av varje fluoroforen i varje låda (S betecknar liten låda och L betecknar stor låda).
- Analysera bakgrundskorrigerade fluorescensintensiteten hos varje fluorofor hjälp av formeln som beskrivs av et al Howell 29:. F = F S - [(F L - F S) x A S / (A L - A S)].
- Erhåll det normaliserade fluorescensintensiteten hos proteinet av intresse (här VDAC3 eller Sas6) genom att beräkna förhållandet av bakgrunden-korrigerade fluorescensintensiteten hos dess fluorophore till det av fluoroforen används för den valda intern standard (här γ-tubulin, Sas6 eller Cep135).
- I fallet med analys av celler där centrosomes är väl separerade (avstånd mellan två centrosomes är större än 2 ^ m), analysera varje Centrosom separat genom att rita två separata uppsättningar lådor. Rita en liten fyrkant (typiskt 15-25 pixlar per sida) runt varje Centrosom och markera det markerade området. Rita en större kvadrat (20-30 pixlar per sida) som omger den första torget och markera det markerade området.
- Skaffa området (A) och den totala fluorescensintensiteten (F) av varje fluoroforen i varje låda, och beräkna bakgrundskorrigerade fluorescensintensiteter varje fluorofor, separat för varje Centrosom, som beskrivs i steg 5.3.3.
- Kombinera bakgrundskorrigerade fluorescensintensiteter av varje protein från de två centrosomes att erhålla den totala centrosomal nivån av det protein i den cellen.
- Skaffanormaliserad intensitet för proteinet av intresse genom att beräkna förhållandet mellan dess totala centrosomal intensitet till den totala centrosomal intensiteten hos den interna standarden.
- Analysera minst 15-25 celler för varje experimentell skick och rita grafen i ett kalkylblad.
6. Analysera Total Protein Använda Western blotting
- Resuspendera cellerna i analys med radioimmunoprecipitation (RIPA) buffert innehållande 50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 1% natriumdeoxikolat, 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS) och inkubera under 10 min på is för att lysera cellerna.
- Centrifugera blandningen vid 10000 x g under 10 minuter, separera lysatet från pelletfraktionen och mäta den totala proteinkoncentrationen hos varje lysat med användning av en bicinkoninsyra (BCA) analyssats.
- Blanda 40 | ig lysat med 4x SDS-PAGE-laddningsbuffert (50 mM Tris-Cl, pH 6,8, 2% SDS, 10% glycerol, 100 mM ditiotreitol, 0,1% Bromophenol blå).
- Koka proverna i 10 min och köra proverna på en 12,5% denaturerande SDS-PAGE vid en konstant spänning av 200 V.
- Överför proteinerna separerades på SDS-PAGE på ett nitrocellulosamembran med hjälp av Western blotting-teknik (vid en konstant spänning av 90 V under 1 h i kyla).
- Blockera membranet med 3% fettfri mjölk i 1 x PBS, och sedan inkubera membranet med lösningar av utspädda primära antikroppar (i detta fall kanin anti-VDAC3, kanin-anti-γ-tubulin och mus-anti-α-tubulin) för en h vid RT.
- Efter tvättning av membranet tre gånger (varje 5 min inkubation under skakning) med användning av PBS-T-buffert (1 x PBS och 0,2% Tween-20), inkubera membranet i en blandning av nära-infraröda (IR) fluorescerande färgämne konjugerat anti-kanin och IR fluorescerande färgämnes konjugerade anti-mus sekundära antikroppar (utspädda i PBS-T) under 1 timme.
- Tvätta membranet tre gånger och sedan scanna membranet att analysera banden med hjälp av en infraröd fluorescence bildsystem lämpligt för immunoblot detektering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Våra senare studier identifierat nya centrosomal lokalisering och funktion VDAC3, en av de mitokondriella poriner 16,28. Immunfärgning av flera däggdjursceller inklusive RPE1 celler med hjälp av ett VDAC3-specifik antikropp visade framträdande centrosomal färgning och jämförelsevis svaga mitokondriell färgning. Vi visade också att centrosomal VDAC3 är företrädesvis förknippas med modern Centriol och centrosomal pool av både endogena och ectopically uttryckte VDAC3 regleras genom nedbrytning 16. För att validera den kvantitativa IIF analysen sökte vi förändringarna i Centrosom associerade VDAC3 pool i celler som är i S-fas.
Här, var asynkront växande RPE1 celler behandlades med antingen proteasomhämmaren MG115 eller kontrollen lösningsmedels DMSO under 4 h. Om du vill begränsa vår analys till celler som som är i S-fas och genomgår Centrosom montering, vi bara undersökt celler som inkorporerade BrdU during samma 4 timmar och hade två tätt placerade centrosomes (fördelade inom 2 um i varandra). Vi undersökte flera slumpområden celler färgade för BrdU och kärnor från både kontroll och MG115 behandling (Figur 1A) att dra slutsatsen att den korta behandlingen av MG115 inte påverkade BrdU inkorporering (ungefär 58%) jämfört med kontrollbehandling (ungefär 56%) i RPE1 celler. Som vi jämförde endast celler som var i S-fas (att döma av närvaron av två γ-tubulin foci fördelade inom 2 um i varandra), vi ansåg γ-tubulin som en potentiell intern standard för normalisering. Således, vi först undersökt om centrosomal γ-tubulin nivåer i BrdU-positiva celler varierar efter proteasomhämning. Inte överraskande, det fanns betydande cell till cell variation i γ-tubulin fluorescensintensitet från en cell till en annan, och vi fann att denna variation var bäst fram i rutan och morrhår diagram som presenterar datamängden som helhet tillgängliga. Jagn box och morrhårs diagram, boxar representerar den nedre och övre kvartilen, markören i rutan visar medianen av varje serie, och morrhåren representerar min- och maxvärden, som ofta (men inte alltid) avvikare. Som ses i figur 1D, var den centrosomal γ-tubulin nivå inte signifikant mellan BrdU-positiva celler behandlade med antingen MG115 eller DMSO, vilket validerar γ-tubulin som en intern standard för detta experiment. I motsats till γ-tubulin, bakgrunden-korrigerad fluorescens intensitet motsvarande centrosomal VDAC3 var ungefär 2,5-faldigt högre i MG115-behandlade celler jämfört med kontrollceller (figur 1C). När vi normaliserade totala VDAC3 fluorescens mot den för γ-tubulin, tappade faldig ökning något till ungefär två gånger (figur 1E). Även vecket förändringen var större utan normalisering, vi har mer förtroende för riktigheten av de normaliserade data, som vi anser bettER kontroller för någon allmän effekt av MG115 behandling, samt variationer på grund av prov behandling. VDAC3 färgning vid icke-centrosomal platser (Figur 1B) eller totalt cellulär nivå av VDAC3 (Figur 1F) påverkades inte av proteasomhämning. Alltså, vi kvantitativt verifiera vår tidigare iakttagelse att centrosomal pool av VDAC3 regleras av proteasom-medierad nedbrytning.
För att mäta förändringen i centrosomal VDAC3 under cellcykeln har vi märkta cellerna med en 4 h BrdU puls följt av en 4 h chase av de märkta cellerna. Eftersom endast S-fas-celler kommer att införliva BrdU under pulsen (genomsnittliga avståndet mellan två centrosomes är 1,35 ± 0,16 | im), majoriteten av BrdU-positiva RPE1 celler efter 4 h chase kommer att vara vid antingen sen S-fas eller tidig G2-fasen ( genomsnittliga avståndet mellan två centrosomes är 1,55 ± 0,22 um), med en mindre befolkning på sena G2 fas där centrovissa par har betydligt separerade (medelavstånd mellan två centrosomes> 2 pm) 30. γ-tubulin, som är en viktig PCM komponent ackumuleras kraftigt vid centrosomes under Centrosom mognad som sker på G2-fasen 31,32, och denna ökning är det en dålig intern standard för att bedöma cellcykel variationer av andra centrosomal proteiner. Å andra sidan, är Sas6 rekryteras till procentrioles under tidig S-fas för att stimulera monteringen av cartwheels 4,5,7, och förblir vid basen av de nybildade centrioler tills cellerna anger mitos när den börjar brytas ned (figur 2 och referens 5). Men i HeLa eller U2OS celler, gradvis ökar centriolar nivån Sas6 som celler utvecklas från S-fas till G2 fas 5. Därför först mätte vi centrosomal Sas6 nivå med avseende på den för Cep135, en annan kärn centriolar protein som lokaliserar de proximala ändarna av centrioler helacellcykeln 33. Vi har inte observera någon signifikant skillnad i bakgrunden korrigerade totala fluorescensintensiteter av Cep135 eller Sas6 i BrdU-positiva RPE1 celler från puls eller jaga, när centrosomes är tätt placerade (Figur 3A-D, "nära" celler där medelavståndet mellan två centrosomes är mindre än 2 ^ m). Följaktligen förblev den normaliserade Sas6 nivå likartad i dessa celler (figur 3E). Men observerade vi en blygsam ökning av de totala fluorescensintensitetsvärden för Sas6 och en liten ökning av samma för Cep135 i celler där centrosomes är väl separerade (avståndet mellan två centrosomes> 2 pm; "avlägsna" celler). Följaktligen, den normaliserade totala centrosomal Sas6 nivå i celler med två väl separerade centrosomes var något, men statistiskt signifikant högre än den i celler med tätt åtskilda centrosomes. Detta beror sannolikt på den inneboende regleringen av Sas6 nivå with cellcykelprogressionen 5. Det är emellertid också möjligt att de små ökningar (som eller av lägre statistisk signifikans) beror på tillsats av fluorescensintensiteterna hos två centrosomes som analyserades separat, jämfört med analys av två centrosomes samtidigt i celler med tätt åtskilda centrosomes. Icke desto mindre, när fluorescensintensiteten hos VDAC3 normaliserades till det av Sas6 ensamt, var den VDAC3 nivån vid två tätt åtskilda centrosomes ökat ungefär 1,5-faldigt i celler som är i slutet av S- / tidig G2-fas, jämfört med den tidiga S-fasen celler (Figur 4A-C, F, "nära" celler). När dessa celler utvecklas till sen G2-fasen, var den normaliserade VDAC3 nivån vid två centrosomes minskat med 2,4-faldigt jämfört med att i slutet av S-fasen (Figur 4C, F).
Eftersom Sas6 nivåerna ökar något från sen S-fas till G2, med användning Sas6 som en inre standard leder till en lätt överskattning av decemberrease i VDAC3 nivåer i sen G2-fas-celler (centrosomes separeras med mer än 2 nm). Medan våra data tyder på att Cep135 är ett bättre val som en inre standard för att bedöma cellcykelvariationer, kan vi inte använda det för VDAC3 eftersom VDAC3 och Cep135 antikroppar tillgängliga för oss är båda från kanin. Men multiplicera medianvärdet för Sas6-normaliserad VDAC3 (F VDAC3 / F Sas6) av medianvärdet för Cep135-normaliserad Sas6 ger oss ett ungefärligt värde för Cep135-normaliserad VDAC3 [(F VDAC3 / F Sas6) x (F Sas6 / F Cep135) = F VDAC3 / F Cep135]. När vi utförde denna analys, förändringen i VDAC3 nivåer mellan slutet S / tidig G2 och sen G2 sjunker något till 2-faldigt. BrdU-positiva celler som är i något skede av mitos som bedöms av kondense kromosomer och svaga Sas6 färgning utesluts från vår analys, på grund av den dramatiska nedgången i Sas6 nivåer. Men noterade vi att centrosomal VDAC3 nivån revar fortsatt låg under mitos (data ej visade). Eftersom Cep135 nivåer inte tappar under mitos (data visas ej), vi kunde i princip upprepa åternormaliseringsförfarandet att uppskatta Cep135-normaliserade VDAC3 nivåer i mitos. Men i verkligheten centrosomal Sas6 nivåer i mitos var alltför variabel för att medge en noggrann bestämning av de Sas6-normaliserade VDAC3 nivåer i första hand. Oavsett, totalt sett, våra data verifierat att centrosomal pool av VDAC3 regleras på centrosomes under cellcykeln.
Figur 1. asynkront växande RPE1 celler inkuberades med BrdU och MG115 (MG) eller DMSO (DM) för 4 h. (A) visad är slumpmässiga områden av DMSO eller MG115 behandlade celler färgade med anti-BrdU-antikropp (röd) och Hoechst ( DNA; blå). Här och i alla andra bilder baren representerar 5 pm.(BE) DMSO eller MG115 behandlade celler färgades med antikroppar mot VDAC3, γ-tubulin och BrdU. BrdU-positiva celler avbildas under identiska avbildningsförhållanden (exponering gånger-400 msek för blå fluorofor / BrdU; 500 ms för grön fluorofor / VDAC3; 300 ms för röd fluorofor / γ-tubulin), och bakgrundskorrigerade fluorescensintensiteter av VDAC3 och γ-tubulin bestämdes. Bilderna visar VDAC3 (VD3, grön), γ-tubulin (γ-badkar, röd) och BrdU (blå) visas i (B). Här och i alla andra bilder, visar inläggningar digitalt förstorade centrosomes som indikeras av fyrkanter. Bakgrundskorrigerade fluorescensintensiteter (F, i godtyckliga enheter) som motsvarar VDAC3 och γ-tubulin mellan tjugofem celler plottas i rutan och morrhår diagram i (C) och (D) respektive. Här och i alla andra fall, boxar representerar nedre och övre kvartilen, marker i rutan (-) anger medianen av varje serie, och morrhåren representerar min- och maxvärden. Normaliserade fluorescensintensitetsvärdena för VDAC3 från dessa tjugofem celler plottas i (E). För (CE), är p-värde härleds från oparade T-test. *** Indikerar p <10 -5, och ns indikerar p> 0,05. (F) Immun visar hela-cellsnivåer VDAC3 (både VDAC3a och VDAC3b 16) och γ-tubulin (γ-tub), där α-tubulin (α-tub) laddar kontrollen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2. asynkront växande RPE1 celler som var märkta med en 4 tim BrdU puls och jagade för en annan 4 timmar i frånvaro av BrdU färgades med antikroppar mot Sas6 (grön) och γ-tubulin (γ-badkar, röd). Bilderna visar Sas6 färgning under (A) S-fas (med två nära Sas6 foci), (B) metafas (två svaga Sas6 foci vid polerna) och (C) telofas (Sas6 härdar går förlorade från polerna). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. asynkront växande RPE1 celler märktes med en 4 h BrdU puls och jagades under ytterligare 4 h i frånvaro av BrdU. BrdU-positiva celler färgade för Cep135 och Sas6 avbildades under identiska avbildningsbetingelser (exponering gånger-400 msför blå fluorofor / BrdU; 400 msek för grön fluorofor / Cep135; 500 msek för röd fluorofor / Sas6), och bakgrundskorrigerade fluorescensintensiteter av Sas6 och Cep135 bestämdes. Avståndet mellan två centrosomes mättes också i alla celler. En cell där avståndet mellan två centrosomes är mindre än 2 um ansågs som "nära" och när värdet är större än 2 um kategoriserades som "avlägsen". (AB) Bilderna visar Cep135 (C135, grön), Sas6 (röd) och BrdU (blå) visas. I (B), C1 och C2 är de två centrosomes av företrädaren "avlägsna" cell. (CD) De bakgrundskorrigerade fluorescensintensiteter (F, i godtyckliga enheter) motsvarande Sas6 (C) och Cep135 (D) från femton celler i varje kategori är avsatta i rutan och morrhår diagram. (E) Normaliserade intensiteter av Sas6 from dessa celler plottas i rutan och morrhår diagram. För (CE), är p-värde härleds från oparade T-test. * Indikerar 0,001 <p <0,05, och ns indikerar p> 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. BrdU-positiva celler från ovan BrdU puls-chase-analysen (figur 3) färgas för VDAC3 och Sas6 avbildades under identiska avbildningsförhållanden (exponering gånger-400 msek för blå fluorofor / BrdU; 500 msek för grön fluorofor / Sas6; 1.000 msek för röd fluorofor / VDAC3) och bakgrundskorrigerade fluorescensintensiteter av Sas6 och VDAC3 bestämdes. Avståndet mellan två centrosomes mättes i alla celler, och cellerna kategoriserades som "cförlorar "(avståndet mellan två centrosomes <2 ^ m) och" avlägsna "(avståndet mellan två centrosomes> 2 pm), som i figur 3. (AC) Representativa bilder av" nära "cell i BrdU puls (A), i BrdU chase (B), och "avlägsen" cell i BrdU chase (C) färgas för VDAC3 (VD3, grön), Sas6 (röd) och BrdU (blå) visas. I (C), C1 och C2 är de två centrosomes. [DE] De bakgrundskorrigerade fluorescensintensiteter (F, i godtyckliga enheter) som motsvarar VDAC3 (D) och Sas6 (E) från femton celler i varje kategori är avsatta i rutan och morrhår diagram. (F) Normaliserade intensiteter av VDAC3 från dessa celler plottas i rutan och morrhår diagram. För (DF), är p-värde härleds från oparade T-test. *** Indikerar p <10 -5, **indikerar 10 -5 <p <0,001, och ns indikerar p> 0,05. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kvantitativ mikroskopi inom cellbiologi är ofta förknippad med levande cell imaging analyser såsom Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP), etc. Det finns dock växande exempel på cellbiologer utvecklar olika kvantitativa mikroskopi analyser för fast celler i de senaste åren 27,34-36. Viktigt framsteg i att förstå Centrosom biologin kräver ofta förståelse för Centrosom-specifik funktion av proteiner vars centrosomal pooler kan regleras annorlunda än andra pooler. Således har vi utvecklat en kvantitativ IIF-analys för att särskilt analysera den relativa centrosomal nivån av ett protein i två olika behandlade prover. Eftersom detta kräver att cellerna fixeras och bearbetas på separata täckglas, därför införde vi en intern standard för att normalisering, för att bättre kontroll för eventuella artefakter på grund av nödvändigheten av att hantera två experimejömässig cellpopulationer för sig, och öka noggrannheten hos analysen. Det finns bara ett fåtal tidigare studier 37 som har använt en sådan inre standard för att mäta den relativa fluorescensintensiteten hos ett testprotein.
När du väljer en intern standard är avgörande för riktigheten i vår analys är det utan tvekan den mest utmanande aspekten. Helst de Centriol par dubbletter under S-fas, och de duplicerade centrioler ackumuleras sedan ytterligare PCM komponenter inklusive γ-tubulin under G2 så att de två mogna centrosomes kan bli poler mitotiska spolen. Därför antar vi att centrosomal nivån γ-tubulin inte skulle förändras väsentligt i celler som är strikt i S-fas. Detta verkar vara fallet i RPE1 celler där S-fas-celler är markerade med en kort BrdU-märkning. Emellertid måste giltigheten av en intern standard testas för varje celltyp och experimentell skick. Till exempel, medan bakgrunden-motsvacted VDAC3 fluorescens ökade mer än två gånger som svar på proteasomhämning i afidikolin behandlade (S-fas arreste) U2OS celler, det fanns också en liten men statistiskt signifikant (0,001 <p-värde <0,05) ökning centrosomal γ-tubulin (tilläggs Figur). Således är γ-tubulin inte alltid en lämplig intern kontroll, även för celler som greps i cellcykeln.
Liknar alla andra IIF mikroskopi analys, är en av nackdelarna med denna analys att antikroppar mot proteinet och intern standard måste höjas i olika värdarter. Medan våra data tyder på att Cep135 är en bättre intern standard än Sas6, kunde vi inte normalisera VDAC3 nivåer mot Cep135 som de tillgängliga antikroppar mot dessa proteiner både upp i kanin. Således vi istället normaliserad mot Sas6, vilket orsakade en överskattning av minskningen i VDAC3 nivåer mellan sena S-fasen och G2. I en situation där det integrernal standard varierar blyg, man kan införa en annan normaliseringsfaktor att ta hänsyn till denna variation. Till exempel, för att korrigera för variationen i Sas6, multiplicerat vi Sas6-normaliserade VDAC3 intensitet av Cep135-normaliserad Sas6 intensitet.
I de fall man väljer en lämplig intern standard är svårt, kan fluorescerande färgämne belagda mikrosfärer (0,02-0,04 um diameter) ger en alternativ strategi. Signalen av ett fluorescensmikrosfär som finns i samma fält som cellen av intresse kan användas för att normalisera den fluorescenssignal som motsvarar proteinet av intresse. Å andra sidan, om test- och kontrollcellerna avbildas tillsammans, en kanske inte behöver en sådan inre standard för normalisering. Vi har tidigare använt en version av denna analys för att jämföra den centrosomal nivån Mps1 i celler som överuttrycker antingen cyklin A 19 eller Antizyme 20, vilket antingen förebygga 19 eller främja 20 den degradation av Mps1 vid centrosomes, respektive att det i angränsande otransfekterade celler avbildas samtidigt.
För att undersöka effekten av centrosomal VDAC3 vid proteasomhämning använde vi BrdU märkning för att identifiera och jämföra celler som är i S-fas. Medan MG115 behandling kan hämma cellcykelprogression, kräver denna hämning en signifikant högre koncentration 38 än den som används i denna studie. Vid de koncentrationer som används här MG115 kan blockera cellcykelkontrollpunkter och övergångar, men inte blockerar cellcykelprogression. Dock måste det kontrolleras för varje celltyp, som vi gjorde här genom att visa att MG115 inte ändrade andelen BrdU positiva celler jämfört med DMSO. Men arrestera celler i S-fas med hjälp afidikolin eller hydroxiurea (HU) eller synkronisering celler använder mitotiska "skaka-off" och släpp eller dubbel tymidin blocket och frisättning kan användas som alternativa metoder för att generera motsvarande popultioner av celler i S-fas.
Den BrdU puls-chase strategi för att studera cellcykeltidpunkter kommer att vara mycket användbart i många funktionella analyser som kräver en oberörd cellcykeln. Detta är en biologiskt mer betydande analys som skulle kunna ersätta cellcykelstopp tekniker med användning av olika cellcykelhämmare. Användning av dessa hämmare kan ofta orsaka olika typer av fysiologisk stress i cellerna vilket resulterar i avvikande förändringar i cellcykel fenotyper. Användning av puls chase tillvägagångssätt det möjligt för oss att visa att utarmning av Cetn2 bara fördröjd Centriol enheten 39 i stället för att orsaka ett helt block som föreslagits av tidigare studier 23. Detektering BrdU-positiva celler kräver syrahydrolys av proverna. Vi och många andra forskare använder en teknik som åter fixar cellerna efter primär och sekundär färgning för testproteiner, före sur hydrolys, med obetydlig förlust av färgningsintensitet för different Centrosom proteiner 40. Emellertid skulle ett potentiellt alternativ vara att använda 5-etynyl-2'-deoxiuridin (EDU), en annan tymidinanalog som är, i likhet med BrdU, införlivas effektivt i replikerande DNA 41. Visualisering av edu använda "klicka kemi" inte kräver sur hydrolys 42, och kan därför mer lämpade för vissa antikroppar.
Dessutom kan denna analys lätt användas för att mäta förändringen i post-translationella modifieringar av ett särskilt protein i centrosomes. Till exempel kan den centrosomal nivån av fosforylering normalis mot den totala halten av proteinet i sig, under förutsättning att fosforylering platsspecifika antikroppar existerar. Denna analys skulle kunna tillämpas omedelbart att bedöma relativa nivåer av fosforylering mellan experimentella förhållanden eller cellcykelfaser, men kunde potentiellt anpassas till bedömningen totalnivåer fosforylering om kritiska parametrar för antikropps affinheterna är kända eller kan bestämmas. Denna analys bör även gälla för studier av proteiner på någon annan plats i celler, även om regionen av intresse inte bör vara för stor. Analysen kommer att vara särskilt användbar för att mäta platsspecifik modulering av ett protein som är lokaliserat vid multipla cellulära platser.
Det finns en handfull av tekniska parametrar såsom differentialfotoblekning, effekten av digital bildbehandling, linjäritet av fluorescensintensitet av fluoroforer, bakgrundsljud etc. som måste tas i beaktande för att maximera mätnoggrannheten 43. Till exempel kan man växla fluorokromen associerad med varje sekundär antikropp för att bedöma bidrag fotoblekning. Många andra parametrar kan kontrolleras väl om man använder identiska avbildningsförhållanden (exponeringstid, gain, steglängd, antal Z-stackar, etc.) och samma bildprogram i varje avbildning körning. Även om vi användeNo-grannen algoritm hela vår analys för att utföra bild deconvolution, kan denna analys kombineras med andra deconvolution algoritm som begränsad iterativ. Vi noterar också att det bör vara lätt att anpassa denna analys för ett antal olika bildmjukvarupaket, som mest allmänt tillgängliga bildanalysmjukvara har verktyg för analys av fluorescensintensitet och avstånd.
Denna analys bör vara tillämplig på alla celltyp, och vårt val av celler här är rent baserat på deras relevans i Centrosom biologisk forskning, och deras användning i våra tidigare undersökningar av centrosomal VDAC3 funktion 16,28. Men för att giltigheten av interna normer och lämpliga tidpunkter för puls chase identifiera celler i S-fas, G2, eller mitos måste bestämmas för varje celltyp. Totalt kommer vår nyutvecklade kvantitativa fluorescensteknik i kombination med BrdU puls-chase-analysen vara en mycket användbar metod för att lösa flera intrikatamekanismer i Centrosom biologi och i många bredare aspekter av cellbiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin | Sigma | F8141 | Stock of 1 mg/ml in water |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| MG115 | Sigma | SCP0005 | Stock of 10 mM in DMSO |
| BrdU | Sigma | B5002 | Stock of 10 mM in DMSO |
| Anti-γ-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88) | Sigma | T 6557 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal) | Aviva Systems Biology | ARP35180-P050 | 1:50 in IIF blocking buffer, 1:1,000 in WB blocking buffer |
| Anti-Sas6 (mouse monoclonal) | Santa cruz biotechnology | sc-81431 | 1:100 in IIF blocking buffer |
| Anti-Cep135 (rabbit polyclonal) | Abcam | ab-75005 | 1:500 in IIF blocking buffer |
| Anti-BrdU (rat monoclonal) | Abcam | ab6326 | 1:250 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life technologies | A21093 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21202 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21203 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21206 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21207 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Anti-γ-tubulin (rabbit polyclonal) | Sigma | T5192 | 1:1,000 in WB blocking buffer |
| Anti-α-tubulin (mouse monoclonal, DM1A) | Sigma | T9026 | 1:20,000 in WB blocking buffer |
| Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A10043 | 1:10,000 in WB blocking buffer |
| Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated | Rockland antibodies | 610-731-002 | 1:10,000 in WB blocking buffer |
| SlowFade Gold Antifade Reagent | Life technologies | S36936 | Mounting media |
| Round coverslips 12CIR.-1 | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | ||
| Retiga ExiFAST 1394 IR camera | QImaging | 32-0082B-238 | |
| 100X Plan Apo oil immersion objective | Olympus | 1.4 numerical aperture | |
| Slidebook software package | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Odyssey IR Imaging System | Li-cor Biosciences | ||
| Bicinchoninic acid (BCA) assay | Thermo Scientific | 23227 | |
| U-MNU2 Narrow UV cube | Olympus | U-M622 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Blue cube | Olympus | U-M643 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Green cube | Olympus | U-M663 | Filter |
References
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
- Kobayashi, T., Dynlacht, B. D. Regulating the transition from centriole to basal body. J. Cell Biol. 193, 435-444 (2011).
- Azimzadeh, J., Marshall, W. F.
- Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole. Curr. Biol. 17, 2169-2174 (2007).
- Strnad, P., et al. Regulated HsSAS-6 levels ensure formation of a single procentriole per centriole during the centrosome duplication cycle. Dev. Cell. 13, 203-213 (2007).
- Hilbert, M., et al. Caenorhabditis elegans centriolar protein SAS-6 forms a spiral that is consistent with imparting a ninefold symmetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 11373-11378 (2013).
- Pike, A. N., Fisk, H. A. Centriole assembly and the role of Mps1: defensible or dispensable. Cell Div. 6, 9 (2011).
- Haren, L., Stearns, T., Luders, J. Plk1-dependent recruitment of gamma-tubulin complexes to mitotic centrosomes involves multiple PCM components. PLoS One. 4, e5976 (2009).
- Andersen, J. S., et al. Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling. Nature. 426, 570-574 (2003).
- Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R. 3rd, Marshall, W. F. Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes. Curr. Biol. 15, 1090-1098 (2005).
- Kumar, A., Rajendran, V., Sethumadhavan, R., Purohit, R. CEP proteins: the knights of centrosome dynasty. Protoplasma. 250, 965-983 (2013).
- Kanai, M., et al. Physical and functional interaction between mortalin and Mps1 kinase. Genes Cells. 12, 797-810 (2007).
- Jakobsen, L., et al. Novel asymmetrically localizing components of human centrosomes identified by complementary proteomics methods. Embo. J. 30, 1520-1535 (2011).
- Sang, L., et al. Mapping the NPHP-JBTS-MKS protein network reveals ciliopathy disease genes and pathways. Cell. 145, 513-528 (2011).
- Dowdle, W. E., et al. Disruption of a ciliary B9 protein complex causes Meckel syndrome. Am. J. Hum. Genet. 89, 94-110 (2011).
- Majumder, S., Slabodnick, M., Pike, A., Marquardt, J., Fisk, H. A. VDAC3 regulates centriole assembly by targeting Mps1 to centrosomes. Cell Cycle. 11, 3666-3678 (2012).
- Guderian, G., Westendorf, J., Uldschmid, A., Nigg, E. A. Plk4 trans-autophosphorylation regulates centriole number by controlling betaTrCP-mediated degradation. J. Cell Sci. 123, 2163-2169 (2010).
- Holland, A. J., et al. The autoregulated instability of Polo-like kinase 4 limits centrosome duplication to once per cell cycle. Genes Dev. 26, 2684-2689 (2012).
- Kasbek, C., et al. Preventing the degradation of mps1 at centrosomes is sufficient to cause centrosome reduplication in human cells. Mol. Biol. Cell. 18, 4457-4469 (2007).
- Kasbek, C., Yang, C. H., Fisk, H. A. Antizyme restrains centrosome amplification by regulating the accumulation of Mps1 at centrosomes. Mol. Biol. Cell. 21, 3878-3889 (2010).
- Puklowski, A., et al. The SCF-FBXW5 E3-ubiquitin ligase is regulated by PLK4 and targets HsSAS-6 to control centrosome duplication. Nat. Cell Biol. 13, 1004-1009 (2011).
- Spektor, A., Tsang, W. Y., Khoo, D., Dynlacht, B. D. Cep97 and CP110 suppress a cilia assembly program. Cell. 130, 678-690 (2007).
- Salisbury, J., Suino, K., Busby, R., Springett, M. Centrin-2 is required for centriole duplication in Mammalian cells. Curr. Biol. 12, 1287 (2002).
- Lukasiewicz, K. B., et al. Control of centrin stability by Aurora A. PLoS One. 6, e21291 (2011).
- Zhao, J., Ren, Y., Jiang, Q., Feng, J. Parkin is recruited to the centrosome in response to inhibition of proteasomes. J. Cell Sci. 116, 4011-4019 (2003).
- Korzeniewski, N., et al. Cullin 1 functions as a centrosomal suppressor of centriole multiplication by regulating polo-like kinase 4 protein levels. Cancer Res. 69, 6668-6675 (2009).
- Rohatgi, R., Milenkovic, L., Corcoran, R. B., Scott, M. P. Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3196-3201 (2009).
- Majumder, S., Fisk, H. A. VDAC3 and Mps1 negatively regulate ciliogenesis. Cell Cycle. 12, 849-858 (2013).
- Howell, B. J., Hoffman, D. B., Fang, G., Murray, A. W., Salmon, E. D. Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells. J. Cell Biol. 150, 1233-1250 (2000).
- Meraldi, P., Nigg, E. A. Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities. J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).
- Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).
- Lee, K., Rhee, K. PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis. J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).
- Lin, Y. C., et al. Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly. Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).
- Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy. Cytometry A. 54, 8-18 (2003).
- Keller, L. C., et al. Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control. Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).
- Venoux, M., et al. Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity. J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).
- Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement. Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).
- Machiels, B. M., et al. Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition. Cytometry. 28, 243-252 (1997).
- Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly. Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).
- Tsou, M. F., et al. Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells. Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
- Buck, S. B., et al. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44, 927-929 (2008).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).
