Elektroforetische mobiliteit Shift Assay (EMSA) voor de studie van RNA-eiwit interacties: Het IRE / IRP Voorbeeld
Summary
Hier presenteren we een protocol om RNA / eiwit interacties te analyseren. De elektroforetische mobiliteit shift assay (EMSA) is gebaseerd op de differentiële migratie van RNA / eiwit-complexen en vrij RNA in natieve gelelektroforese. Door een radioactief gemerkte RNA-probe, kan RNA / eiwit-complexen worden gevisualiseerd door autoradiografie.
Abstract
RNA / eiwit-interacties cruciaal zijn voor post-transcriptionele regulerende pathways. Onder de best gekarakteriseerde cytosole RNA-bindende eiwitten zijn ijzer regulerende eiwitten, IRP1 en IRP2. Ze binden aan reagerende elementen (IRES) in het niet-getranslateerde gebieden (UTR) van verschillende doelwit mRNA strijken, waardoor de mRNA translatie of stabiliteit beheersen. IRE / IRP interacties zijn uitgebreid bestudeerd door EMSA. We beschrijven hier de EMSA protocol voor de analyse van de IRE-bindende activiteit van IRP1 en IRP2, die kan worden gegeneraliseerd tot de activiteit van andere RNA-bindende eiwitten bepalen ook. Een ruw eiwit lysaat bevattende een RNA bindend eiwit, of een gezuiverd preparaat van dit eiwit wordt geïncubeerd met een overmaat van 32P-gemerkte RNA-probe, waardoor complexvorming. Heparine wordt toegevoegd om niet-specifieke eiwit uitsluit sonderen binding. Vervolgens wordt het mengsel geanalyseerd door niet-denaturerende elektroforese op een polyacrylamidegel. De gratis sondemigreert snel, terwijl de RNA / eiwitcomplex exposities achterlijk mobiliteit; vandaar, wordt de procedure ook wel "gelretardatie" of "bandverschuiving" test. Na voltooiing van elektroforese wordt de gel gedroogd en RNA / eiwit-complexen, alsmede vrij probe worden gedetecteerd door autoradiografie. Het algemene doel van het protocol is op te sporen en te kwantificeren IRE / ITC en andere RNA / eiwit interacties. Bovendien kan EMSA ook worden gebruikt om de specificiteit, bindingsaffiniteit en stoichiometrie van de interactie RNA / eiwit onderzochte bepalen.
Introduction
Het EMSA werd oorspronkelijk ontwikkeld om de vereniging van DNA-bindende eiwitten met doel DNA-sequenties 1,2 bestuderen. Het principe is vergelijkbaar voor RNA / eiwit-interacties 3, dat de focus van dit artikel. In het kort wordt RNA negatief geladen en migreren naar de anode tijdens niet-denaturerende elektroforese in polyacrylamide (of agarose) gels. Migratie in de gel hangt af van de grootte van het RNA, die evenredig is met de lading. Specifieke binding van een eiwit RNA verandert de mobiliteit en het complex migreert langzamer dan de vrije RNA. Dit is voornamelijk te wijten aan een toename van het molecuulgewicht, maar ook veranderingen in de lading en eventueel conformatie. Gebruik makend van een gelabelde RNA als probe maakt een eenvoudige controle van de "gelretardatie" of "bandverschuiving". Het gebruik van 32P-gemerkte RNA-probes is heel gebruikelijk en biedt een hoge gevoeligheid. De migratie van RNA / eiwit-complexen en vrij RNA gedetecteerddoor autoradiografie. Nadelen zijn de korte halfwaardetijd van 32 P (14.29 dagen), de geleidelijke achteruitgang van de kwaliteit van de probe door radiolyse, het vereiste van een vergunning radioactiviteit en infrastructuur voor radioactiviteit werken en potentiële biologische veiligheid betreft. Daarom zijn alternatieve, niet-isotopische werkwijzen voor het labelen van de RNA probe ontwikkeld, bijvoorbeeld met fluoroforen of biotine, die detectie van fluorescerende of chemiluminescerende beeldvorming 4,5 inschakelen. Beperkingen van deze werkwijzen zijn de hogere kosten en vaak lagere gevoeligheid dan isotopische labeling en het potentieel van niet-isotopische labels om de interactie RNA / eiwit. Niet-denaturerende polyacrylamide gels zijn geschikt voor de meeste toepassingen EMSA en worden vaak gebruikt. Soms kan agarosegels alternatief voor de analyse van grote complexen vormen.
Het grote voordeel van EMSA is dat combineert eenvoud, gevoeligheid en robuustheid 4 </ Sup>. De test kan worden voltooid binnen een paar uur en niet verfijnd instrumentarium nodig. RNA / eiwit interacties kunnen worden gedetecteerd door EMSA bij concentraties van 0,1 nM of minder, en in een groot aantal bindende voorwaarden (pH 4,0-9,5, monovalente zoutconcentratie 1-300 mM, en 0 – 60 ° C).
RNA / eiwit complexvorming kan ook worden bestudeerd door het filter-bindingstest. Dit is een eenvoudige, snelle en goedkope procedure gebaseerd op het behoud van RNA / eiwit-complexen in een nitrocellulose filter, terwijl een vrije RNA sonde passeert 6. Vergeleken met EMSA wordt beperkt wanneer het RNA probe bevat meerdere bindingsplaatsen of het ruwe extract bevat meerdere RNA-bindende eiwitten die binden aan de probe op dezelfde locatie. Terwijl meerdere RNA / eiwit-interacties worden gedetecteerd door de filter binding assay, kunnen ze gemakkelijk worden gevisualiseerd door EMSA. In sommige gevallen, visualisatie is vooravondn mogelijk wanneer twee RNA / eiwit-complexen co-migreren (bijvoorbeeld menselijke IRP1 / IRE en IRP2 / IRE complexen), door toevoeging van een antilichaam tegen één van de RNA-bindende eiwitten aan de EMSA reactie, waardoor verdere vertraging op de gel ( "supershift") 7.
De EMSA is op grote schaal gebruikt om IRP1 en IRP2, die post-transcriptionele regulatoren van ijzer metabolisme 8-10 zijn te bestuderen. Ze werken door te binden aan IRES, fylogenetisch geconserveerd haarspeldstructuren binnen de UTR's van verschillende mRNA's 11. IRES werden voor het eerst ontdekt in de mRNAs coderend ferritine 12 pt transferrine receptor 1 (TfR1) 13 eiwitten ijzer opslag en toepassing, respectievelijk. Later, IRES werden gevonden in erythroid-specifieke aminolevulinaat synthase (ALAS2) 14, mitochondriale aconitase 15, ferroportin 16, tweewaardige metalen transporter 1 (DMT1) 17, hypoxie induceerbare factor 2 <em> α (HIF2α) 18 en andere mRNA's 19-21. Het prototype H- en L-ferritine mRNAs bevatten één IRE in het 5 'UTR, terwijl TfR1 mRNA meerdere IRES in de 3' UTR. IRE / IRP interacties specifiek remmen ferritine mRNA vertaling door sterisch blokkeren van de associatie van de 43S ribosomale subunit; Bovendien, ze stabiliseren TfR1 mRNA tegen endonucleolytische splitsing. IRP1 en IRP2 aandeel uitgebreide sequentie-overeenkomst en vertonen een hoge-IRE bindende activiteit in-ijzer uitgehongerd cellen. In ijzergehalte cellen IRP1 assembleert een cubaan Fe-S cluster dat converteert naar cytosolische aconitase ten koste van de IRE-bindingsactiviteit, terwijl IRP2 ondergaat proteasomale degradatie. Dus de IRE / IRP interacties afhangen van de cellulaire ijzerstatus, maar ook gereguleerd door andere signalen, zoals H 2 O 2, stikstofoxide (NO) of hypoxie. We beschrijven hier het protocol voor de beoordeling IRE-bindingsactiviteit van ruwe cel- en weefselextracten van EMSA. We gebruikten een 32P gelabelde H-ferritine IRE probe die werd gegenereerd door in vitro transcriptie van een plasmide DNA matrijs (I-12.CAT), waarbij het IRE sequentie oorspronkelijk geïntroduceerd in sense oriëntatie stroomafwaarts van de T7 RNA polymerase plaats van klonen versmolten synthetische oligonucleotiden 22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hierin beschrijven we een protocol dat is ontwikkeld om het IRE-bindende activiteiten van IRP1 en IRP2 bestuderen, en laten we representatieve gegevens. Met verschillende probes, kan dit protocol worden aangepast voor de studie van andere RNA-bindende eiwitten. Een kritische stap is de grootte van de probe. Het gebruik van lange probes, die gemeenschappelijk wanneer de precieze bindingsplaats bekend, kan resulteren in RNA / eiwit-complexen die niet verschillend migreren dan de vrije RNA. In dit geval is het raadzaam om …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Canadian Institutes for Health Research (MOP-86514).
Materials
| Name of the Materials | Company | Catalog Number |
| leupeptin | SIGMA | L2884 |
| PMSF | SIGMA | 78830 |
| BioRad Protein Assay | BIORAD | 500-0006 |
| T7 RNA polymerase | Thermoscientific | EPO111 |
| Rnase Inhibitor | Invitrogen | 15518-012 |
| UTP [alpha-32P] | Perkin-Elmer | NEG507H |
| Scintillation liquid | Beckman Coulter | 141349 |
| heparin | SIGMA | H0777 |
| Rnase T1 | Thermoscientific | EN0541 |
| Name of the Equipments | Company | Catalog Number |
| Tissue Ruptor | Qiagen | 9001271 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 |
| Protean II xi Cell | BIORAD | 165-1834 |
| 20 wells combs 1.5mm thick | BIORAD | 165-1868 |
| 1.5 mm spacers | BIORAD | 165-1849 |
| PowerPac | BIORAD | 164-5070 |
Referências
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9, 3047-3060 (1981).
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Luscieti, S., et al. Novel mutations in the ferritin-L iron-responsive element that only mildly impair IRP binding cause hereditary hyperferritinaemia cataract syndrome. Orphanet J Rare Dis. 8, 30 (2013).
- Rio, D. C. . Filter-binding assay for analysis of RNA-protein interactions. 2012, 1078-1081 (2012).
- Wang, J., et al. Iron-mediated degradation of IRP2: an unexpected pathway involving a 2-oxoglutarate-dependent oxygenase activity. Mol. Cell. Biol. 24, 954-965 (2004).
- Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5′ untranslated regions of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2171-2175 (1988).
- Haile, D. J., Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Regulation of interaction of the iron-responsive element binding protein with iron-responsive RNA elements. Mol. Cell. Biol. 9, 5055-5061 (1989).
- Mueller, S., Pantopoulos, K. Activation of iron regulatory protein-1 (IRP1) by oxidative stress. Methods Enzymol. 348, 324-337 (2002).
- Wang, J., Pantopoulos, K. Regulation of cellular iron metabolism. Biochem J. 434, 365-381 (2011).
- Hentze, M. W., et al. Identification of the iron-responsive element for the translational regulation of human ferritin mRNA. Science. 238, 1570-1573 (1987).
- Casey, J. L., et al. Iron-responsive elements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation. Science. 240, 924-928 (1988).
- Dandekar, T., et al. Identification of a novel iron-responsive element in murine and human erythroid d-aminolevulinic acid synthase mRNA. EMBO J. 10, 1903-1909 (1991).
- Gray, N. K., Pantopoulos, K., Dandekar, T., Ackrell, B. A. C., Hentze, M. W. Translational regulation of mammalian and drosophila citric acid cycle enzymes via iron-responsive elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 4925-4930 (1996).
- McKie, A. T., et al. A novel duodenal iron-regulated transporter IREG1, implicated in the basolateral transfer of iron to the circulation. Mol. Cell. 5, 299-309 (2000).
- Gunshin, H., et al. Cloning and characterization of a mammalian protein-coupled metal-ion transporter. Nature. 388, 482-488 (1997).
- Sanchez, M., Galy, B., Muckenthaler, M. U., Hentze, M. W. Iron-regulatory proteins limit hypoxia-inducible factor-2alpha expression in iron deficiency. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 420-426 (2007).
- Sanchez, M., et al. Iron regulation and the cell cycle: Identification of an iron-responsive element in the 3′-untranslated region of human cell division cycle 14A mRNA by a refined microarray-based screening strategy. J. Biol. Chem. 281, 22865-22874 (2006).
- Santos, C. O., et al. An iron responsive element-like stem-loop regulates alpha-hemoglobin-stabilizing protein mRNA. J Biol Chem. 283, 26956-26964 (2008).
- Liu, Z., et al. Siderophore-mediated iron trafficking in humans is regulated by iron. J Mol Med (Berl. 90, 1209-1221 (2012).
- Gray, N. K., et al. Recombinant iron regulatory factor functions as an iron-responsive element-binding protein, a translational repressor and an aconitase. A functional assay for translational repression and direct demonstration of the iron switch. Eur. J. Biochem. 218, 657-667 (1993).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Testa, U., et al. Differential regulation of iron regulatory element-binding protein(s) in cell extracts of activated lymphocytes versus monocytes-macrophages. J. Biol. Chem. 266, 13925-13930 (1991).
- Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Oxidation-reduction and the molecular mechanism of a regulated RNA-protein interaction. Science. 244, 357-359 (1989).
- Meyron-Holtz, E. G., et al. Genetic ablations of iron regulatory proteins 1 and 2 reveal why iron regulatory protein 2 dominates iron homeostasis. EMBO J. 23, 386-395 (2004).
- Huang, F. W., Pinkus, J. L., Pinkus, G. S., Fleming, M. D., Andrews, N. C. A mouse model of juvenile hemochromatosis. J. Clin. Invest. 115, 2187-2191 (2005).
- Sebastiani, G., Pantopoulos, K. Disorders associated with systemic or local iron overload: from pathophysiology to clinical practice. Metallomics. 3, 971-986 (2011).
- Galy, B., Ferring, D., Hentze, M. W. Generation of conditional alleles of the murine iron regulatory protein (IRP)-1 and -2 genes. Genesis. 43, 181-188 (2005).
- Gkouvatsos, K., et al. Iron-dependent regulation of hepcidin in Hjv-/- mice: Evidence that hemojuvelin is dispensable for sensing body iron levels. PLoS ONE. 9, 85530 (2014).
- Goforth, J. B., Anderson, S. A., Nizzi, C. P., Eisenstein, R. S. Multiple determinants within iron-responsive elements dictate iron regulatory protein binding and regulatory hierarchy. RNA. 16, 154-169 (2010).
- Gopinath, S. C. Mapping of RNA-protein interactions. Anal Chim Acta. 636, 117-128 (2009).
