Electrophoretic Maiusc Mobility Assay (EMSA) per lo studio delle interazioni RNA-proteina: La IRE / IRP Esempio
Summary
Qui vi presentiamo un protocollo per analizzare le interazioni RNA / proteine. Il saggio spostamento mobilità elettroforetica (EMSA) si basa sulla migrazione differenziale di complessi RNA / proteine e RNA libero durante elettroforesi su gel nativo. Utilizzando una sonda RNA radioattivo, RNA complessi / proteici possono essere visualizzati mediante autoradiografia.
Abstract
Interazioni RNA / proteine sono fondamentali per vie di regolazione post-trascrizionale. Tra le RNA-binding proteins citosoliche più caratterizzati sono proteine regolatrici del ferro, IRP1 e IRP2. Si legano al ferro elementi responsivi (IRES) all'interno delle regioni non tradotte (UTR) dei diversi mRNA bersaglio, controllando così la traduzione mRNA o la stabilità. Interazioni IRE / IRP sono stati ampiamente studiati da EMSA. Qui, descriviamo il protocollo EMSA per analizzare l'attività IRE vincolante di IRP1 e IRP2, che può essere generalizzato per valutare l'attività di altri RNA-binding proteins pure. Un lisato proteina grezza contenente una proteina legante l'RNA, o una preparazione purificata di questa proteina, viene incubato con un eccesso di 32 sonda RNA P-marcato, consentendo la formazione del complesso. L'eparina è aggiunto precludere proteina non specifica per sondare vincolante. Successivamente, la miscela viene analizzata mediante elettroforesi non denaturante su un gel di poliacrilammide. La sonda gratuitomigra veloce, mentre l'RNA / proteine mostre complesse mobilità ritardato; di conseguenza, la procedura è chiamata anche "il ritardo gel" e il dosaggio "bandshift". Dopo il completamento della elettroforesi, il gel viene essiccato e complessi RNA / proteine, così come sonda free, vengono rilevati mediante autoradiografia. L'obiettivo generale del protocollo è quello di individuare e quantificare IRE / IRP e altre interazioni RNA / proteine. Inoltre, EMSA può anche essere usato per determinare la specificità, l'affinità di legame, e stechiometria dell'interazione RNA / proteina in esame.
Introduction
L'EMSA è stato originariamente sviluppato per studiare l'associazione di proteine che legano il DNA con sequenze di DNA bersaglio 1,2. Il principio è simile per le interazioni RNA / proteine 3, che è il focus di questo articolo. Brevemente, l'RNA è caricato negativamente e migrerà verso l'anodo durante non denaturante elettroforesi in poliacrilammide (o agarosio gel). Migrazione nel gel dipende dalla dimensione del RNA, che è proporzionale alla sua carica. Legame specifico di una proteina di RNA altera la sua mobilità, e le migra complessi più lento rispetto alla RNA libera. Ciò è dovuto principalmente ad un aumento della massa molecolare, ma anche ad alterazioni nella carica e possibilmente conformazione. Utilizzando un RNA marcato come sonda permette un facile monitoraggio del "ritardo gel" o "bandshift". L'utilizzo di 32 sonde RNA P-marcato è molto comune e offre alta sensibilità. La migrazione di RNA / complessi proteici e RNA libero vengono rilevatimediante autoradiografia. Inconvenienti sono breve emivita di 32 P (14,29 giorni), il progressivo deterioramento della qualità della sonda a causa radiolisi, il requisito di una licenza radioattività e infrastruttura per lavoro radioattività, e potenziali problemi di biosicurezza. Pertanto, sono stati sviluppati metodi non isotopici alternativi per etichettare la sonda RNA, per esempio con fluorofori o biotina, che consentono il rilevamento da parte di imaging fluorescente o chemiluminescente 4,5. Limitazioni di questi metodi sono il costo elevato e spesso ridotta sensibilità rispetto all'etichettatura isotopica, e il potenziale di etichette non isotopici di interferire con l'interazione RNA / proteine. Gel non denaturante di poliacrilammide sono adatti per la maggior parte delle applicazioni di EMSA e sono comunemente usati. Occasionalmente, gel di agarosio possono rappresentare un'alternativa per l'analisi di grandi complessi.
Il principale vantaggio di EMSA è che combina semplicità, sensibilità, robustezza e 4 </ Sup>. Il test può essere completato nel giro di poche ore e non richiede una strumentazione sofisticata. Interazioni RNA / proteine possono essere rilevati da EMSA a concentrazioni basse come 0,1 nm o inferiori, e all'interno di una vasta gamma di condizioni vincolanti (pH 4,0-9,5, la concentrazione di sale monovalente 1-300 mM, e la temperatura 0 – 60 ° C).
RNA / proteine formazione del complesso può essere studiato mediante il saggio filtro vincolante. Questa è una procedura semplice, veloce ed economico basato sulla conservazione dei complessi RNA / proteine in un filtro di nitrocellulosa, mentre una sonda di RNA libera attraversa 6. Rispetto al EMSA, è limitato nei casi in cui la sonda RNA contiene più siti di legame, o l'estratto grezzo contiene più di un RNA-binding proteins che si legano alla sonda nello stesso sito. Mentre molteplici interazioni RNA / proteine sfuggiranno rilevamento da parte del saggio di filtro di legame, possono essere facilmente visualizzati tramite EMSA. In alcuni casi, la visualizzazione è vigilian possibile quando due complessi RNA / proteine co-migrazione (per esempio, IRP1 umana / IRE e IRP2 / complessi IRE), con l'aggiunta di un anticorpo contro una delle RNA-binding proteins alla reazione EMSA, ottenendo un'ulteriore ritardo sul gel ( "supershift") 7.
L'EMSA è stato ampiamente utilizzato per studiare IRP1 e IRP2, che sono regolatori post-trascrizionali del metabolismo del ferro 8-10. Operano legandosi a IRE, strutture tornante filogeneticamente conservate nelle UTR di diversi mRNA 11. IRE sono stati scoperti nel mRNA codificanti ferritina 12 e transferrina recettore 1 (TfR1) 13, proteine di stoccaggio ferro e l'assorbimento, rispettivamente. Più tardi, IRE sono stati trovati in specifici eritroide aminolevulinato sintasi (ALAS2) 14, aconitasi mitocondriale 15, ferroportina 16, divalente metallo transporter 1 (DMT1) 17, ipossia fattore inducibile 2 <em> α (HIF2α) 18, e altri mRNA 19-21. Il H- prototipi e mRNA L-ferritina contengono una IRE nella loro 5 'UTR, mentre TfR1 mRNA contiene più IRE nel suo 3' UTR. Interazioni IRE / GIV specificamente inibiscono ferritina traduzione mRNA da stericamente bloccando la sua associazione delle subunità ribosomiale 43S; inoltre, si stabilizzano TfR1 mRNA contro taglio endonucleolitico. IRP1 e quota IRP2 ampia similarità di sequenza e presentano un'elevata attività-IRE legame in cellule di ferro-fame. Nelle cellule ferro-piena, IRP1 assembla un cubano Fe-S cluster che converte in aconitasi citosolica a scapito della sua attività IRE vincolante, mentre IRP2 subisce la degradazione del proteasoma. Pertanto, le interazioni IRE / IRP dipendono dal livello di ferro cellulare, ma sono anche regolati da altri segnali, quali H 2 O 2, ossido nitrico (NO) o ipossia. Qui, descriviamo il protocollo per valutare l'attività IRE vincolante da estratti di cellule e tessuti greggi da EMSA. Abbiamo utilizzato un 32 P-marcato H-ferritina sonda IRE che è stato generato mediante trascrizione in vitro da un modello DNA plasmidico (I-12.CAT), dove la sequenza IRE è stato inizialmente introdotto in orientamento senso valle del sito polimerasi T7 RNA da clonazione di ricotto oligonucleotidi sintetici 22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, descriviamo un protocollo che è stato sviluppato per studiare le attività IRE vincolanti di IRP1 e IRP2, e mostriamo dati rappresentativi. Utilizzando diverse sonde, questo protocollo può essere regolato anche per lo studio di altre proteine-RNA vincolante. Un punto critico è la dimensione della sonda. L'utilizzo di sonde lunghe, che è comune quando l'esatto sito di legame è sconosciuto, può portare a complessi RNA / proteine che non migrano in modo diverso rispetto alla RNA gratuito. In questo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Canadian Institutes for Health Research (MOP-86514).
Materials
| Name of the Materials | Company | Catalog Number |
| leupeptin | SIGMA | L2884 |
| PMSF | SIGMA | 78830 |
| BioRad Protein Assay | BIORAD | 500-0006 |
| T7 RNA polymerase | Thermoscientific | EPO111 |
| Rnase Inhibitor | Invitrogen | 15518-012 |
| UTP [alpha-32P] | Perkin-Elmer | NEG507H |
| Scintillation liquid | Beckman Coulter | 141349 |
| heparin | SIGMA | H0777 |
| Rnase T1 | Thermoscientific | EN0541 |
| Name of the Equipments | Company | Catalog Number |
| Tissue Ruptor | Qiagen | 9001271 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 |
| Protean II xi Cell | BIORAD | 165-1834 |
| 20 wells combs 1.5mm thick | BIORAD | 165-1868 |
| 1.5 mm spacers | BIORAD | 165-1849 |
| PowerPac | BIORAD | 164-5070 |
Referências
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