La movilidad electroforética cambio de ensayo (EMSA) para el estudio de las interacciones RNA-proteína: El IRE / IRP Ejemplo
Summary
Aquí se presenta un protocolo para analizar las interacciones RNA / proteína. El ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) se basa en la migración diferencial de los complejos de ARN / proteína y ARN libre durante la electroforesis en gel nativo. Mediante el uso de una sonda de RNA radiomarcada, complejos / proteína de ARN pueden ser visualizados por autorradiografía.
Abstract
Interacciones RNA / proteína son críticos para las vías de regulación post-transcripcional. Entre las proteínas de unión al ARN citosólicos mejor caracterizados son proteínas reguladoras del hierro, IRP1 y IRP2. Se unen al hierro elementos de respuesta (IRES) dentro de las regiones no traducidas (UTRs) de varios mRNAs objetivo, controlando así la traducción o la estabilidad ARNm. Interacciones IRE / IRP han sido ampliamente estudiados por la EMSA. Aquí se describe el protocolo de EMSA para analizar la actividad de unión a IRE de IRP1 y IRP2, que se puede generalizar para evaluar la actividad de otras proteínas de unión al ARN también. Un lisado de proteína cruda que contiene una proteína de unión al ARN, o una preparación purificada de esta proteína, se incuba con un exceso de 32 sonda de ARN marcado con P, lo que permite la formación de complejos. La heparina se añade para impedir la proteína no específica a la unión de la sonda. Posteriormente, la mezcla se analizó por electroforesis no desnaturalizante en gel de poliacrilamida. La sonda libremigra rápido, mientras que el ARN / proteína exposiciones complejas movilidad retrasados; por lo tanto, el procedimiento se denomina también "retardo en gel" o ensayo "bandshift". Después de la finalización de la electroforesis, el gel se seca y complejos de ARN / proteína, así como sonda libre, se detectan por autorradiografía. El objetivo general del protocolo es detectar y cuantificar IRE / IRP y otras interacciones RNA / proteína. Por otra parte, EMSA también se puede utilizar para determinar la especificidad, afinidad de unión, y la estequiometría de la interacción de ARN / proteína bajo investigación.
Introduction
La EMSA se desarrolló originalmente para estudiar la asociación de las proteínas de unión al ADN con secuencias de ADN diana 1,2. El principio es similar para las interacciones RNA / proteína 3, que es el foco de este artículo. Brevemente, el ARN está cargado negativamente y migrará hacia el ánodo durante la electroforesis no desnaturalizante de poliacrilamida en (o agarosa) geles. La migración dentro del gel depende del tamaño de la ARN, que es proporcional a su carga. La unión específica de una proteína de ARN altera su movilidad, y los complejos migra más lento en comparación con el RNA libre. Esto se debe principalmente a un aumento en la masa molecular, pero también a alteraciones en la carga y posiblemente conformación. Utilizando un ARN marcado como sonda permite un fácil monitoreo del "retardo en gel" o "bandshift". El uso de 32 sondas de ARN P-etiquetados es muy común y ofrece una alta sensibilidad. La migración de ARN / complejos de proteínas y ARN libre se detectanpor autorradiografía. Los inconvenientes son la corta vida media de 32 P (14,29 días), el deterioro progresivo de la calidad de la sonda debido a radiólisis, la exigencia de una licencia de radiactividad y la infraestructura para el trabajo de la radiactividad, y posibles problemas de seguridad de la biotecnología. Por lo tanto, los métodos no isotópicos alternativos para marcar la sonda de ARN se han desarrollado, por ejemplo, con fluoróforos o biotina, que permiten la detección mediante formación de imágenes fluorescente o quimioluminiscente 4,5. Las limitaciones de estos métodos son el mayor costo y, a menudo sensibilidad reducida en comparación con marcaje isotópico, y el potencial de marcadores no isotópicos para interferir con la interacción de ARN / proteína. Geles de poliacrilamida no desnaturalizantes son adecuados para la mayoría de aplicaciones EMSA y se usan comúnmente. En ocasiones, geles de agarosa pueden representar una alternativa para el análisis de grandes complejos.
La principal ventaja de EMSA es que combina la simplicidad, sensibilidad y robustez 4 </ Sup>. El ensayo puede completarse en unas pocas horas y no requiere instrumentación sofisticada. Interacciones ARN / proteína pueden ser detectados por la EMSA, en concentraciones tan bajas como 0,1 nM o menos, y dentro de una amplia gama de condiciones de unión (pH 4,0 a 9,5, la concentración de sal monovalente 1 – 300 mM, y la temperatura de 0 – 60 ° C).
La formación de complejos de ARN / proteína también puede ser estudiada por el filtro obligatorio de ensayo. Este es un procedimiento simple, rápido y barato basado en la retención de los complejos de ARN / proteína en un filtro de nitrocelulosa, mientras que una sonda de ARN libre pasa a través de 6. En comparación con EMSA, se limita en los casos en que la sonda de ARN contiene múltiples sitios de unión, o el extracto crudo contiene más de una proteínas de unión al ARN que se unen a la sonda en el mismo sitio. Mientras múltiples interacciones RNA / proteína no se detectarán por el filtro obligatorio de ensayo, que se pueden visualizar fácilmente por EMSA. En algunos casos, la visualización es vísperan posible cuando dos complejos de ARN / proteína co-migran (por ejemplo, humano IRP1 / IRE y complejos IRP2 / IRE), mediante la adición de un anticuerpo contra una de las proteínas de unión al ARN a la reacción de EMSA, produciendo más retraso en el gel ( "supershift") 7.
El EMSA se ha utilizado ampliamente para estudiar IRP1 y IRP2, que son reguladores post-transcripcional del metabolismo del hierro 8-10. Operan mediante la unión a IRE, estructuras de horquilla conservadas filogenéticamente dentro de los UTRs de varios mRNAs 11. IREs fueron descubiertos por primera vez en los ARNm que codifican la ferritina y transferrina 12 receptor 1 (TfR1) 13, las proteínas de almacenamiento de hierro y la absorción, respectivamente. Más tarde, IREs se encontraron en erythroid específicos aminolevulinato sintasa (ALAS2) 14, aconitasa mitocondrial 15, ferroportina 16, transportador de metales divalentes 1 (DMT1) 17, factor inducible por hipoxia 2 <em> α (HIF2α) 18, y otra ARNm 19-21. El H- prototipo y ARNm de L-ferritina contienen uno IRE en sus 5 'UTR, mientras TfR1 ARNm contiene múltiples IREs en su extremo 3' UTR. Interacciones IRE / IRP inhiben específicamente ferritina traducción de ARNm bloqueando estéricamente su asociación de los 43S subunidad ribosomal; además, se estabilizan mRNA TfR1 contra la escisión endonucleolítica. IRP1 y compartir IRP2 extensa similitud de secuencia y exhiben alta actividad de unión IRE-en las células hierro de hambre. En las células de hierro repleta, IRP1 reúne un cubane Fe-S clúster que convierte a la aconitasa citosólica a expensas de su actividad de unión a IRE, mientras IRP2 sufre degradación proteasomal. Por lo tanto, las interacciones IRE / IRP dependen del estado del hierro celular, sino que también están regulados por otras señales, tales como H 2 O 2, el óxido nítrico (NO) o hipoxia. Aquí se describe el protocolo para evaluar la actividad de unión a IRE a partir de extractos crudos de células y tejidos por EMSA. Se utilizó una sonda de IRE marcado con 32P H-ferritina que se ha generado mediante transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN plásmido (I-12.CAT), donde la secuencia IRE se introdujo originalmente en orientación sentido aguas abajo del sitio de la polimerasa T7 RNA por clonación de los oligonucleótidos sintéticos hibridados 22.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este documento, se describe un protocolo que se ha desarrollado para estudiar las actividades IRE-unión de IRP1 y IRP2, y mostramos datos representativos. Mediante el uso de diferentes sondas, este protocolo también se puede ajustar para el estudio de otras proteínas de unión al ARN. Un paso crítico es el tamaño de la sonda. El uso de sondas largas, que es común cuando el sitio de unión exacto es desconocido, puede dar lugar a complejos de ARN / proteína que no migran de manera diferente que el ARN libre. En…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Canadian Institutes for Health Research (MOP-86514).
Materials
| Name of the Materials | Company | Catalog Number |
| leupeptin | SIGMA | L2884 |
| PMSF | SIGMA | 78830 |
| BioRad Protein Assay | BIORAD | 500-0006 |
| T7 RNA polymerase | Thermoscientific | EPO111 |
| Rnase Inhibitor | Invitrogen | 15518-012 |
| UTP [alpha-32P] | Perkin-Elmer | NEG507H |
| Scintillation liquid | Beckman Coulter | 141349 |
| heparin | SIGMA | H0777 |
| Rnase T1 | Thermoscientific | EN0541 |
| Name of the Equipments | Company | Catalog Number |
| Tissue Ruptor | Qiagen | 9001271 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 |
| Protean II xi Cell | BIORAD | 165-1834 |
| 20 wells combs 1.5mm thick | BIORAD | 165-1868 |
| 1.5 mm spacers | BIORAD | 165-1849 |
| PowerPac | BIORAD | 164-5070 |
Referências
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