Shift electrophoretic הניידות Assay (Emsa) לחקר RNA אינטראקציות חלבון: IRE / IRP דוגמא
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול לנתח אינטראקציות RNA / חלבון. Assay ניידות electrophoretic המשמרת (Emsa) מבוסס על הגירת ההפרש של מתחמי RNA / חלבון ו- RNA ללא תשלום במהלך ג'ל אלקטרופורזה ילידים. באמצעות בדיקה RNA רדיואקטיבי, יכולים להיות דמיינו מתחמים / חלבון RNA על ידי autoradiography.
Abstract
אינטראקציות RNA / חלבון הן קריטיות למסלולים רגולטוריים שלאחר תעתיק. בין מחייב חלבוני RNA cytosolic המאופיין ביותר חלבונים רגולטוריים ברזל, IRP1 וIRP2 הם. הם נקשרים לגהץ אלמנטי תגובה (IRES) בתוך האזורים מתורגמים (UTRs) של כמה mRNAs היעד, ובכך לשלוט בתרגום mRNAs או יציבות. אינטראקציות IRE / IRP נחקרו בהרחבה על ידי Emsa. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול Emsa לניתוח פעילות IRE מחייב של IRP1 וIRP2, שניתן להכליל על מנת להעריך את פעילותם של חלבוני קושרי RNA אחרים גם כן. Lysate חלבון גולמי המכיל חלבון קושר RNA, או הכנה מטוהרת של חלבון זה, הוא מודגרות עם עודף של 32 בדיקה RNA שכותרתו P, המאפשר להיווצרות מורכבת. הפרין מתווסף מונע חלבון שאינו ספציפי לבדיקה מחייבת. בהמשך לכך, התערובת מנותחת על ידי אלקטרופורזה שאינו denaturing על ג'ל polyacrylamide. הבדיקה בחינםנודד במהירות, תוך תצוגות מורכבות RNA / חלבון ניידות מפגרת; לכן, ההליך המכונה גם "פיגור ג'ל" או assay "bandshift". לאחר השלמת אלקטרופורזה, ג'ל הוא מיובש ומתחמי RNA / חלבון, כמו גם בדיקה בחינם, מזוהים על ידי autoradiography. המטרה הכללית של הפרוטוקול היא לזהות ולכמת IRE / IRP ואינטראקציות RNA / חלבון אחרות. יתר על כן, Emsa יכול לשמש גם כדי לקבוע סגוליות, זיקה מחייבת, והרכב של האינטראקציה RNA / חלבון נחקרים.
Introduction
Emsa פותח במקור כדי ללמוד את הקשר בין חלבוני קושרי DNA עם רצפי DNA היעד 1,2. העיקרון דומה לאינטראקציות RNA / חלבון 3, המהווה את המוקד של מאמר זה. בקצרה, RNA טעון שלילי ויהגר להאנודה שבאינה denaturing אלקטרופורזה בpolyacrylamide (או agarose) ג'לי. הגירה בתוך ג'ל תלוי בגודל של RNA, באופן פרופורציונלי למטען שלה. ספציפי מחייב של חלבון לRNA משנה הניידות שלה, והפליטים המורכבים איטי יותר בהשוואה לRNA החופשי. זאת בעיקר כתוצאה מגידול במסה המולקולרית, אלא גם לשינויים בקונפורמציה תשלום ואולי. ניצול RNA שכותרתו בדיקה מאפשר ניטור קל של "פיגור ג'ל" או "bandshift". שימוש של 32 בדיקות RNA שכותרתו P הוא נפוץ מאוד ומציע רגישות גבוהה. ההגירה של RNA / קומפלקסי חלבונים ו- RNA החופשי מזוהותעל ידי autoradiography. חסרונות הם זמן מחצית החיים קצרים של 32 P (14.29 ימים), ההידרדרות ההדרגתית באיכות של החללית בשל radiolysis, דרישת רישיון רדיואקטיביות ותשתית לעבודת רדיואקטיביות, וחששות בטיחות ביולוגיים הפוטנציאליים של. לכן, שיטות לא-איזוטופי חלופיים לתיוג הבדיקה RNA פותחו, למשל עם fluorophores או ביוטין, המאפשר זיהוי על ידי ההדמיה ניאון או chemiluminescent 4,5. מגבלות של שיטות אלה הן העלות גבוהה יותר ולעתים קרובות רגישות מופחתת בהשוואה לתיוג איזוטופי, ואת הפוטנציאל של תוויות שאינן איזוטופים להתערב באינטראקצית RNA / החלבון. ג'לים polyacrylamide-denaturing ללא מתאים למרבית יישומי Emsa ומשמש בדרך כלל. בהזדמנות, ג'לים agarose עלול להוות חלופה לניתוח מתחמים גדולים.
היתרון העיקרי של Emsa הוא שהוא משלב פשטות, רגישות, וחוסן 4 </ Sup>. Assay יכול להסתיים בתוך כמה שעות ואינו דורש מכשור מתוחכם. ניתן לאתר אינטראקציות RNA / חלבון על ידי Emsa בריכוזים נמוכים כמו 0.1 ננומטר או פחות, ובתוך מגוון רחב של תנאים המחייבים (pH 4.0-9.5, ריכוז מלח חד ערכי 1-300 מ"מ, וטמפרטורה 0-60 מעלות צלזיוס).
היווצרות מורכבת RNA / חלבון גם ניתן ללמוד על ידי assay מחייב הסינון. זהו הליך פשוט, מהיר, וזול המבוסס על השימור של מתחמי RNA / חלבון במסנן nitrocellulose, תוך בדיקה RNA חופשית עוברת דרך 6. בהשוואה לEmsa, הוא מוגבל במקרים שבהם הבדיקה RNA מכילה אתרי קישור מרובים, או התמצית גולמי מכילה יותר מאחד מחייב חלבוני RNA אשר נקלטים על ידי הבדיקה באותו האתר. בעוד אינטראקציות RNA / חלבון מרובות להתחמק מזיהוי על ידי assay מחייב המסנן, הם יכולים להיות דמיינו בקלות על ידי Emsa. במקרים מסוימים, להדמיה היא ערבn אפשרי כאשר שני מתחמי RNA / חלבון שיתוף להגר (למשל, IRP1 / IRE אדם וIRP2 / מתחמי IRE), על ידי הוספת נוגדנים נגד אחד מחייב חלבוני RNA לתגובת Emsa, מניב פיגור נוסף על ג'ל ( "Supershift") 7.
Emsa כבר בשימוש נרחב ללמוד IRP1 וIRP2, שהם רגולטורים לאחר תעתיק של חילוף חומרים ברזל 8-10. הם פועלים על ידי קישור לIRES, מבני סיכה נשמרים פילוגנטית בתוך UTRs של כמה mRNAs 11. IRES התגלה לראשונה בmRNAs קידוד פריטין 12 וtransferrin קולט 1 (TfR1) 13, חלבונים של אחסון ברזל וספיגה, בהתאמה. בהמשך, IRES נמצא בsynthase aminolevulinate erythroid הספציפי (ALAS2) 14, aconitase המיטוכונדריה 15, ferroportin 16, טרנספורטר דו הערכי מתכת 1 (DMT1) 17, גורם עין מתנהל היפוקסיה 2 <eמ '> α (HIF2α) 18, וmRNAs 19-21 אחר. H- אב הטיפוס וmRNAs L-פריטין להכיל IRE אחד ב 5 'UTR, בעוד TfR1 mRNA מכיל IRES מרובה בה 3' UTR. אינטראקציות IRE / IRP במיוחד מעכבות תרגום mRNA פריטין ידי sterically חסימת הקשר שלה של 43s מקטע ריבוזומלי; יתר על כן, הם לייצב TfR1 mRNA נגד מחשוף endonucleolytic. IRP1 ודמיון רצף נרחב נתח IRP2 ולהציג פעילות מחייב IRE גבוהה בתאים רעבי ברזל. בתאי ברזל גדוש, IRP1 מרכיב אשכול Fe-S cubane שממיר אותו לaconitase cytosolic על חשבון פעילות IRE מחייב שלה, בזמן שIRP2 עובר השפלה proteasomal. כך, אינטראקציות IRE / IRP תלוי במעמד הברזל הסלולרי, אלא גם מוסדרות על ידי אותות אחרים, כגון H 2 O 2, תחמוצת חנקן (NO) או היפוקסיה. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול להערכת פעילות IRE-מחייבת מתמציות תא ורקמה גסים על ידי EMSA. אנחנו השתמשנו בדיקה 32 שכותרתו P H-פריטין IRE שנוצר על ידי שעתוק במבחנה מתבנית ה- DNA פלסמיד (I-12.CAT), שבו רצף IRE הוצג במקור באוריינטצית תחושה במורד הזרם של אתר פולימראז T7 RNA על ידי שיבוט של oligonucleotides הסינתטי המרותק 22.
Protocol
Representative Results
Discussion
בזאת, אנו מתארים פרוטוקול שפותחה כדי לחקור את פעילות IRE מחייבת של IRP1 וIRP2, ואנו מראים נתונים נציג. באמצעות בדיקות שונות, פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם ללימוד מחייב חלבוני RNA אחרים. שלב קריטי הוא בגודל של החללית. שימוש בבדיקות ארוכות, שהוא נפוץ כאשר אתר הקישור המדויק אי?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Canadian Institutes for Health Research (MOP-86514).
Materials
| Name of the Materials | Company | Catalog Number |
| leupeptin | SIGMA | L2884 |
| PMSF | SIGMA | 78830 |
| BioRad Protein Assay | BIORAD | 500-0006 |
| T7 RNA polymerase | Thermoscientific | EPO111 |
| Rnase Inhibitor | Invitrogen | 15518-012 |
| UTP [alpha-32P] | Perkin-Elmer | NEG507H |
| Scintillation liquid | Beckman Coulter | 141349 |
| heparin | SIGMA | H0777 |
| Rnase T1 | Thermoscientific | EN0541 |
| Name of the Equipments | Company | Catalog Number |
| Tissue Ruptor | Qiagen | 9001271 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 |
| Protean II xi Cell | BIORAD | 165-1834 |
| 20 wells combs 1.5mm thick | BIORAD | 165-1868 |
| 1.5 mm spacers | BIORAD | 165-1849 |
| PowerPac | BIORAD | 164-5070 |
Referências
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9, 3047-3060 (1981).
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Luscieti, S., et al. Novel mutations in the ferritin-L iron-responsive element that only mildly impair IRP binding cause hereditary hyperferritinaemia cataract syndrome. Orphanet J Rare Dis. 8, 30 (2013).
- Rio, D. C. . Filter-binding assay for analysis of RNA-protein interactions. 2012, 1078-1081 (2012).
- Wang, J., et al. Iron-mediated degradation of IRP2: an unexpected pathway involving a 2-oxoglutarate-dependent oxygenase activity. Mol. Cell. Biol. 24, 954-965 (2004).
- Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5′ untranslated regions of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2171-2175 (1988).
- Haile, D. J., Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Regulation of interaction of the iron-responsive element binding protein with iron-responsive RNA elements. Mol. Cell. Biol. 9, 5055-5061 (1989).
- Mueller, S., Pantopoulos, K. Activation of iron regulatory protein-1 (IRP1) by oxidative stress. Methods Enzymol. 348, 324-337 (2002).
- Wang, J., Pantopoulos, K. Regulation of cellular iron metabolism. Biochem J. 434, 365-381 (2011).
- Hentze, M. W., et al. Identification of the iron-responsive element for the translational regulation of human ferritin mRNA. Science. 238, 1570-1573 (1987).
- Casey, J. L., et al. Iron-responsive elements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation. Science. 240, 924-928 (1988).
- Dandekar, T., et al. Identification of a novel iron-responsive element in murine and human erythroid d-aminolevulinic acid synthase mRNA. EMBO J. 10, 1903-1909 (1991).
- Gray, N. K., Pantopoulos, K., Dandekar, T., Ackrell, B. A. C., Hentze, M. W. Translational regulation of mammalian and drosophila citric acid cycle enzymes via iron-responsive elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 4925-4930 (1996).
- McKie, A. T., et al. A novel duodenal iron-regulated transporter IREG1, implicated in the basolateral transfer of iron to the circulation. Mol. Cell. 5, 299-309 (2000).
- Gunshin, H., et al. Cloning and characterization of a mammalian protein-coupled metal-ion transporter. Nature. 388, 482-488 (1997).
- Sanchez, M., Galy, B., Muckenthaler, M. U., Hentze, M. W. Iron-regulatory proteins limit hypoxia-inducible factor-2alpha expression in iron deficiency. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 420-426 (2007).
- Sanchez, M., et al. Iron regulation and the cell cycle: Identification of an iron-responsive element in the 3′-untranslated region of human cell division cycle 14A mRNA by a refined microarray-based screening strategy. J. Biol. Chem. 281, 22865-22874 (2006).
- Santos, C. O., et al. An iron responsive element-like stem-loop regulates alpha-hemoglobin-stabilizing protein mRNA. J Biol Chem. 283, 26956-26964 (2008).
- Liu, Z., et al. Siderophore-mediated iron trafficking in humans is regulated by iron. J Mol Med (Berl. 90, 1209-1221 (2012).
- Gray, N. K., et al. Recombinant iron regulatory factor functions as an iron-responsive element-binding protein, a translational repressor and an aconitase. A functional assay for translational repression and direct demonstration of the iron switch. Eur. J. Biochem. 218, 657-667 (1993).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Testa, U., et al. Differential regulation of iron regulatory element-binding protein(s) in cell extracts of activated lymphocytes versus monocytes-macrophages. J. Biol. Chem. 266, 13925-13930 (1991).
- Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Oxidation-reduction and the molecular mechanism of a regulated RNA-protein interaction. Science. 244, 357-359 (1989).
- Meyron-Holtz, E. G., et al. Genetic ablations of iron regulatory proteins 1 and 2 reveal why iron regulatory protein 2 dominates iron homeostasis. EMBO J. 23, 386-395 (2004).
- Huang, F. W., Pinkus, J. L., Pinkus, G. S., Fleming, M. D., Andrews, N. C. A mouse model of juvenile hemochromatosis. J. Clin. Invest. 115, 2187-2191 (2005).
- Sebastiani, G., Pantopoulos, K. Disorders associated with systemic or local iron overload: from pathophysiology to clinical practice. Metallomics. 3, 971-986 (2011).
- Galy, B., Ferring, D., Hentze, M. W. Generation of conditional alleles of the murine iron regulatory protein (IRP)-1 and -2 genes. Genesis. 43, 181-188 (2005).
- Gkouvatsos, K., et al. Iron-dependent regulation of hepcidin in Hjv-/- mice: Evidence that hemojuvelin is dispensable for sensing body iron levels. PLoS ONE. 9, 85530 (2014).
- Goforth, J. B., Anderson, S. A., Nizzi, C. P., Eisenstein, R. S. Multiple determinants within iron-responsive elements dictate iron regulatory protein binding and regulatory hierarchy. RNA. 16, 154-169 (2010).
- Gopinath, S. C. Mapping of RNA-protein interactions. Anal Chim Acta. 636, 117-128 (2009).
