باستخدام فيروس الغدة اسوشيتد كأداة لدراسة الحواجز الشبكية في مرض
Summary
To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.
Abstract
خلايا مولر هي الخلايا الدبقية الرئيسية للشبكية العين. من نهاية أقدام تشكل حدود شبكية العين في الأغشية الحد الخارجي والداخلي (ILM)، وبالتزامن مع الخلايا النجمية، pericytes والخلايا البطانية التي وضع حاجز الدم في شبكية العين (BRB). BRB يحد من نقل المواد بين الدم وشبكية العين في حين يتصرف ILM باعتباره الغشاء القاعدي الذي يحدد تشريحيا الحدود بين شبكية العين وتجويف الجسم الزجاجي. وصفها خلايا مولر غير ذات أهمية خاصة لدراسة الحالة المادية للحواجز شبكية العين، وهذه الخلايا هي جزء لا يتجزأ من BRB وILM. وكثيرا ما غيرت كل من BRB وILM في مرض شبكية العين، وهي المسؤولة عن أعراض المرض.
هناك عدة طرق راسخة لدراسة سلامة BRB، مثل فحص الأزرق ايفانز أو تصوير الأوعية فلوريسئين. لكن هذه الأساليب لا تقدم معلومات على مدى BRB نفاذية رس جزيئات أكبر، في نطاق نانومتر. وعلاوة على ذلك، فإنها لا تقدم معلومات عن حالة الحواجز الشبكية الأخرى مثل ILM. لدراسة BRB نفاذية جنبا إلى جنب مع شبكية العين ILM، استخدمنا طريقة مقرها AAV أن يقدم معلومات عن نفاذية BRB إلى الجزيئات الكبيرة في حين تشير إلى حالة ILM والمصفوفة خارج الخلية البروتينات في الحالات المرضية. الخيارين AAV مفيدة لهذه الدراسة: AAV5 وShH10. AAV5 لديه انتحاء الطبيعي لخلايا مستقبلة للضوء ولكن لا يمكن أن يحصل عبر لشبكية العين الخارجية عندما تدار في الجسم الزجاجي عندما ILM غير سليمة (أي في البرية من نوع شبكية العين). ShH10 لديه انتحاء قوي نحو الخلايا الدبقية، وسوف تسمية انتقائي الدبقية مولر في كل من شبكية العين السليمة والمريضة. ShH10 يوفر توصيل الجينات أكثر كفاءة في شبكية العين حيث تم اختراق ILM. تسلط هذه الأدوات الفيروسية إلى جانب المناعية و-DNA الدم تحليل الضوء على حالة الحواجز الشبكية في المرض.
Introduction
خلايا مولر هي العنصر الدبقية الرئيسي للشبكية العين. شكليا، فإنها تمتد شبكية العين شعاعيا وendfeet بهم، في اتصال مع الجسم الزجاجي، مواجهة ILM والمكونات السرية لهذه الأخيرة. وILM هو الغشاء القاعدي تتكون من حوالي عشرة مختلفة البروتينات المصفوفة خارج الخلية (laminin، أجرين AGRIN، perlecan، nidogen، والكولاجين والعديد من البروتيوغليكان كبريتات الهيبارين). خلال التنمية، وجودها لا غنى عنه لتكون الأنسجة الشبكية، والملاحة من المحاور البصرية، وبقاء خلايا العقدة 1-3. ومع ذلك، ILM هو غير اساسي في شبكية العين الكبار، ويمكن إزالتها جراحيا في بعض الأمراض دون التسبب في اضرار في شبكية العين 4. في العلاج الجيني، ويصبح هذا الغشاء حاجز مادي لالتنبيغ كفاءة شبكية العين باستخدام AAVs عن طريق الحقن intravitreal 5.
من خلال تشجر واسعة من العمليات، وخلايا مولر توفر سوبو الغذائية والتنظيميRT إلى كل من الخلايا العصبية للشبكية وخلايا الأوعية الدموية. وتشارك خلايا مولر أيضا في تنظيم التوازن في شبكية العين، في تشكيل وصيانة BRB 6. منعطفات ضيقة بين الخلايا البطانية الشعرية الشبكية، مولر الخلايا، الخلايا النجمية وpericytes تشكل BRB. BRB يمنع بعض المواد من دخول retina.In أمراض كثيرة مثل اعتلال الشبكية السكري، وانسداد الوريد الشبكي وأمراض الجهاز التنفسي، ونقص الأكسجين لشبكية العين يسبب تسرب من خلال BRB 7-9. ويرتبط هذا التمزق مع زيادة في نفاذية الأوعية الدموية مما يؤدي إلى وذمة وعائية المنشأ، انفصال الشبكية وتلف شبكية العين.
وترتبط خلايا مولر بإحكام مع الأوعية الدموية والغشاء القاعدي، ولعب دورا هاما في كل من BRB وILM النزاهة. ونتيجة لذلك، واصفة الخلايا الدبقية مولر غير ذات أهمية خاصة لدراسة الحالة المادية لهذه الحواجز الشبكية.
كلاسيكيحليف، ويقاس BRB النفاذية باستخدام الفحص الأزرق ايفانز تتكون من حقن النظامية ايفانز صبغة زرقاء، الذي يربط غير تساهميا لألبومين البلازما. ويقيس هذا الاختبار تسرب الزلال (البروتين من حجم متوسط، ~ 66 كيلو دالتون) من الأوعية الدموية في شبكية العين (انظر بروتوكولات القسم 5) 10. بدلا من ذلك، تسرب الأوعية الدموية يمكن تصور من قبل تصوير الأوعية مضان شبكية العين مما يدل على تسرب فلوريسئين (جزيء صغير، ~ 359 دا؛ انظر بروتوكولات القسم 6) 11. ومع ذلك، على حد سواء أساليب تسمح تقييم نفاذية BRB إلى جزيئات صغيرة والبروتينات لكنها لا توفر المعلومات حول سلامة ILM.
وبالتالي، لدراسة BRB النفاذية، واستخدمنا طريقة مقرها AAV أن يعطي معلومات عن نفاذية BRB لجزيئات أكبر (على سبيل المثال، والجسيمات AAV، 25 قطرها نانومتر). في الواقع، يمكن أن أسلوبنا كشف عن وجود AAV التحوير في الدم، الأمر الذي من شأنه أن يوحي بأن ~ الجسيمات 25 نانومتر قطر من شأنهتكون قادرة على التسلل إلى مجرى الدم. يوفر هذا الأسلوب أيضا معلومات عن هيكل ILM والبروتينات المصفوفة خارج الخلية في الحالات المرضية. الخيارين AAV مفيدة لهذه الدراسة: AAV5 وShH10. حقن Subretinally، AAV5 لديه انتحاء الطبيعي لخلايا مستقبلة للضوء في شبكية العين والظهارة الصبغية 12 ولكن لا يمكن أن يحصل عبر لشبكية العين الخارجية عندما تدار في الجسم الزجاجي في البرية من نوع شبكية العين مع ILM سليمة 5،13. ShH10 هو البديل AAV التي تم تصميمها خصيصا لاستهداف الخلايا الدبقية على الخلايا العصبية 14،15. ShH10 التسميات بشكل انتقائي خلايا مولر في كل من شبكية العين السليمة والمريضة مع زيادة الكفاءة في شبكية العين مع الحواجز المعرضة للخطر (16). هذه الأدوات الفيروسية إلى جانب immuhistochemistry وتحليل DNA الدم توفر معلومات عن حالة الحواجز الشبكية ومشاركتها في مرض (الشكل 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
وBRB ينظم تبادل الجزيئات بين الدم وشبكية العين. ويرتبط انهيارها يعانون من أمراض مختلفة مثل اعتلال الشبكية السكري أو الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD). أظهرنا مؤخرا أنه في الدستروفين خروج المغلوب الماوس، والذي يعرض نفاذية BRB، تصبح الشبكية أكثر تساهلا لتوصيل الجينات بوس…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the imaging platform of the Institut de la Vision. We acknowledge the French Muscular Dystrophy Association (AFM) for a PhD fellowship to O.V. and Allergan INC. This work performed in the frame of the LABEX LIFESENSES [reference ANR-10-LABX-65] was supported by French state funds managed by the ANR. We thank Peggy Barbe, and Mélissa Desrosiers for technical assistance with AAV preparations. We are grateful to Stéphane Fouquet for excellent technical assistance in confocal microscopy and his expert input with the interpretation of the results.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| C57BL6J mice strain | JANVIER LABS | mice | |
| Ketamine 500 | Virbac France | anesthetic | |
| Xylazine Rompun 2% | Bayer Healthcare | anesthetic | |
| Neosynephrine 5% Faure | Europhta | dilatant | |
| Mydriaticum 0,5% | Thea | dilatant | |
| Sterdex | Novartis | anti-inflammatory | |
| Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | 10143352 | slides |
| anti-laminin | Sigma | L9393 | antibody |
| anti-rhodopsin clone 4D2 | Millipore | MABN15 | antibody |
| anti-glutamine synthetase clone GS-6 | Millipore | MAB302 | antibody |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein | Dako | 334 | antibody |
| PNA Lectin | Invitrogen | L32459 | probe |
| Alexa fluor conjugated secondary antibodies | Invitrogen | antibody | |
| Fluorsave reagent | Calbiochem | 345789 | mounting medium |
| QIAmp DNA Micro Kit | QIAGEN | 56304 | |
| GoTaq DNA polymerase | Promega | M3001 | |
| Evans Blue dye | Sigma | E2129 | dye |
| 5 µm filter | Millipore | ||
| Sodium Citrate | Sigma | S1804 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-2.5KG | |
| Formamide spectrophotometric | Sigma | 295876-2L | |
| Fluorescein | Sigma | F2456 | dye |
| Micron III | Phoenix Research Labs | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. | |
| Insulin Syringes | Terumo | SS30M3109 | |
| Syringe 10 µl Hamilton | Dutscher | 74487 | Seringue 1701 |
| Needle RN G33, 25 mm, PST 2 | Fisher Scientific | 11530332 | Intravitreal Injection |
| UltraMicroPump UMP3 | World Precision Instruments | UMP3 | Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | UMP3-1 | Digital controller | |
| Binocular magnifier SZ76 | ADVILAB | ADV-76B2 | Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection |
| Spring scissors straight – 8,5cm | Bionic France S.a.r.l | 15003-08 | Retinas dissection |
| Micro-ciseaux de Vannas courbe | 15004-08 | ||
| Pince Dumont 5 | 11254-20 | ||
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Life technologies | 4375786 | Thermocycler |
| Ultrasonic cleaner | Laboratory Supplies | G1125P1T | |
| Nanosep 30k omega tubes | VWR | ||
| Speedvac | Fisher Scientific | SC 110 A | |
| Spectrofluorometer | TECAN | infinite M1000 |
Referências
- Halfter, W. Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth. J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).
- Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E. Temporary disruption of the retinal basal lamina and its effect on retinal histogenesis. Dev Biol. 238 (1), 79-96 (2001).
- Halfter, W., Willem, M., Mayer, U. Basement membrane-dependent survival of retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 1000-1009 (2005).
- Abdelkader, E., Lois, N. Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery. Surv Ophthalmol. 53 (4), 368-396 (2008).
- Dalkara, D., et al. Inner limiting membrane barriers to AAV-mediated retinal transduction from the vitreous. Mol Ther. 17 (12), 2096-2102 (2009).
- Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
- Eichler, W., Kuhrt, H., Hoffmann, S., Wiedemann, P., Reichenbach, A. VEGF release by retinal glia depends on both oxygen and glucose supply. Neuroreport. 11 (16), 3533-3537 (2000).
- Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management. Prog Retin Eye Res. 27 (6), 622-647 (2008).
- Kaur, C., Sivakumar, V., Foulds, W. S. Early response of neurons and glial cells to hypoxia in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1126-1141 (2006).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvasc Res. 46 (2), 135-142 (1993).
- Yang, G. S., et al. Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size. J Virol. 76 (15), 7651-7660 (2002).
- Li, W., et al. Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye. Mol Vis. 15, 267-275 (2009).
- Koerber, J. T., et al. Molecular evolution of adeno-associated virus for enhanced glial gene delivery. Mol Ther. 17 (12), 2088-2095 (2009).
- Klimczak, R. R., Koerber, J. T., Dalkara, D., Flannery, J. G., Schaffer, D. V. A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells. PLoS One. 4 (10), e7467 (2009).
- Vacca, O., et al. AAV-mediated gene delivery in Dp71-null mouse model with compromised barriers. Glia. , (2013).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Hum Genet. 12 (Unit 12 19), (2007).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use. Curr Protoc Mol Biol. 16 (Unit 16 25), (2007).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348 (2011).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. J Vis Exp. (8), 313 (2007).
- Kolstad, K. D., et al. Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration. Hum Gene Ther. 21 (5), 571-578 (2010).
- Sene, A., et al. Functional implication of Dp71 in osmoregulation and vascular permeability of the retina. PLoS One. 4 (10), e7329 (2009).
- Benard, R. A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice. ARVO Annual Meeting. , (2011).
