病における網膜障壁を研究するツールとしてアデノ随伴ウイルスを使用して、
Summary
To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.
Abstract
ミュラー細胞は網膜の主要なグリア細胞である。彼らのエンド足は外側と内側の制限膜（ILM）での網膜の限界を形成し、アストロサイト、周皮細胞および内皮細胞と一緒に彼らは血液網膜関門（BRB）を確立。 ILMは、組織学的に網膜と硝子体腔の境界を定義する基底膜として機能している間BRBは、血流と網膜の間で物質輸送を制限します。ミュラー細胞にラベルを付けると、これらの細胞はBRBとILMの不可欠な部分であるように、網膜障壁の物理的状態を研究するために特に関連しています。 BRBとILMの両方が頻繁に網膜疾患に変更され、病気の症状の原因であるされている。
そのようなエバンスブルーアッセイまたはフルオレセイン血管造影などのBRBの完全性を研究するためのいくつかのよく確立された方法があります。しかしこれらの方法は、BRB透過tの程度についての情報を提供しないナノメートル範囲の大きな分子、O。さらに、それらは、ILMのような他の網膜の障害の状態に関する情報を提供していません。網膜のILMと一緒BRB透過性を研究するために、我々は、疾患状態におけるILM及び細胞外マトリックスタンパク質の状態を示しているが、より大きな分子にBRBの透過性に関する情報を提供するAAVベースの方法を使用する。 2つのAAV変異体は、そのような研究のために有用である：AAV5とShH10。 AAV5は、光受容体のための自然な指向性を持っていますが、ILM（ すなわち、野生型の網膜に）完全である硝子体内に投与した場合には、外側の網膜に渡って取得することはできません。 ShH10は、グリア細胞に対して強い親和性を有しており、選択的に、健康と病気の両方の網膜にミュラーグリアにラベルを付けます。 ShH10はILMが侵害された網膜におけるより効率的な遺伝子送達を提供しています。免疫組織化学および血液DNA分析と相まってこれらのウイルスのツールは、疾患における網膜の障害の状態に光を当てる。
Introduction
ミュラー細胞は網膜の主要なグリア要素である。形態学的には、彼らが放射状に網膜にまたがるとそのエンドフィートは、硝子体に接触して、ILMと後者の秘密のコンポーネントに直面しています。 ILMは、約10種類の細胞外マトリックスタンパク質（ラミニン、アグリン、パールカン、ニドジェン、コラーゲン、いくつかのヘパリン硫酸プロテオグリカン）からなる基底膜である。開発中、その存在は、網膜組織発生、視神経軸索のナビゲーション、および神経節細胞1-3の生存のために不可欠である。しかし、ILMは、成体網膜において本質的でないし、外科的網膜損傷4を引き起こすことなく、特定の病状を除去することができる。遺伝子治療では、この膜は、硝子体内注射5のAAVを用いて網膜の効率的な伝達のための物理的障壁となる。
彼らのプロセスの豊富な樹枝状分岐を経て、ミュラー細胞は、栄養や規制スッポを提供網膜ニューロンおよび血管細胞の両方に室温。ミュラー細胞は、BRB 6の形成および維持において、網膜の恒常性の調節に関与する。網膜毛細血管内皮細胞、ミュラー細胞、星状細胞および周皮細胞間のタイトジャンクションはBRBを形成する。 BRBは、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞、呼吸器疾患などのretina.In多くの疾患に入るの特定の物質を防ぎ、網膜の低酸素症は、BRB 7-9を通る漏れの原因となる。この破裂は血管原性浮腫、網膜剥離や網膜損傷につながる血管透過性の増大と関連している。
ミュラー細胞は緊密BRBとILMの完全性の両方において重要な役割を果たし、血管および基底膜に関連している。その結果、ミュラーグリア細胞を標識すると、これらの網膜障壁の物理的状態の研究に特に関連する。
クラシック味方、BRB透過性は血漿アルブミンに非共有結合し、エバンスブルー色素の全身注射からなるエバンスブルーアッセイを用いて測定される。このアッセイは、網膜への血管10（プロトコルセクション5を参照）からのアルブミン漏出（中間サイズのタンパク質、〜66 kDaの）を測定する。また、血管漏出は、フルオレセインの漏れを証明する蛍光眼底血管造影により可視化することができる（小分子、〜359ダ、プロトコル第6節参照）11。それにもかかわらず、両方の方法は、小分子およびタンパク質へBRB透過性の評価を可能にするが、それらは、ILMの整合性についての情報を提供していません。
したがって、BRB透過性を研究するために、我々は、より大きな分子（ 例えば、AAV粒子、25 nmの直径）へBRB透過性に関する情報を提供するAAVベースのメソッドを使用していました。確かに、私たちの方法はそれを示唆している、血液中のAAV導入遺伝子の存在を検出することができる〜25nmの直径の粒子だろう血流に浸透させることができる。この方法はまた、病理学的状態におけるILM及び細胞外マトリックスタンパク質の構造に関する情報を提供する。 2つのAAV変異体は、そのような研究のために有用である：AAV5とShH10。網膜下に注入された、AAV5は、光受容体と網膜色素上皮12のための自然な指向性を持っていますが、完全なILM 5,13と、野生型網膜における硝子体内に投与した場合には、外側の網膜に渡って取得することはできません。 ShH10は、具体的には、ニューロン14,15の上にグ リア細胞を標的とするように操作されているAAV変異体である。 ShH10は選択的に損なわれた障壁16と網膜の効率化と健康と病気の両方の網膜でミュラー細胞を標識する。 immuhistochemistry及び血液DNAの分析と結合され、これらのウイルスのツールは、網膜障壁の状態および疾患におけるそれらの関与（ 図1）に関する情報を提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
BRBは、血液および網膜の間の分子の交換を調節する。その内訳は、糖尿病性網膜症または加齢性黄斑変性症（AMD）などの種々の疾患と関連している。我々は最近、透過BRBを表示ジストロフィンノックアウトマウスにおいて、網膜は、アデノ随伴ウイルスベクター（AAV）によって媒介される遺伝子送達に対してより寛容になることを示した。しかし、BRB透過性AAV粒子にもかかわらず、眼内に、…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the imaging platform of the Institut de la Vision. We acknowledge the French Muscular Dystrophy Association (AFM) for a PhD fellowship to O.V. and Allergan INC. This work performed in the frame of the LABEX LIFESENSES [reference ANR-10-LABX-65] was supported by French state funds managed by the ANR. We thank Peggy Barbe, and Mélissa Desrosiers for technical assistance with AAV preparations. We are grateful to Stéphane Fouquet for excellent technical assistance in confocal microscopy and his expert input with the interpretation of the results.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| C57BL6J mice strain | JANVIER LABS | mice | |
| Ketamine 500 | Virbac France | anesthetic | |
| Xylazine Rompun 2% | Bayer Healthcare | anesthetic | |
| Neosynephrine 5% Faure | Europhta | dilatant | |
| Mydriaticum 0,5% | Thea | dilatant | |
| Sterdex | Novartis | anti-inflammatory | |
| Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | 10143352 | slides |
| anti-laminin | Sigma | L9393 | antibody |
| anti-rhodopsin clone 4D2 | Millipore | MABN15 | antibody |
| anti-glutamine synthetase clone GS-6 | Millipore | MAB302 | antibody |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein | Dako | 334 | antibody |
| PNA Lectin | Invitrogen | L32459 | probe |
| Alexa fluor conjugated secondary antibodies | Invitrogen | antibody | |
| Fluorsave reagent | Calbiochem | 345789 | mounting medium |
| QIAmp DNA Micro Kit | QIAGEN | 56304 | |
| GoTaq DNA polymerase | Promega | M3001 | |
| Evans Blue dye | Sigma | E2129 | dye |
| 5 µm filter | Millipore | ||
| Sodium Citrate | Sigma | S1804 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-2.5KG | |
| Formamide spectrophotometric | Sigma | 295876-2L | |
| Fluorescein | Sigma | F2456 | dye |
| Micron III | Phoenix Research Labs | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. | |
| Insulin Syringes | Terumo | SS30M3109 | |
| Syringe 10 µl Hamilton | Dutscher | 74487 | Seringue 1701 |
| Needle RN G33, 25 mm, PST 2 | Fisher Scientific | 11530332 | Intravitreal Injection |
| UltraMicroPump UMP3 | World Precision Instruments | UMP3 | Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | UMP3-1 | Digital controller | |
| Binocular magnifier SZ76 | ADVILAB | ADV-76B2 | Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection |
| Spring scissors straight – 8,5cm | Bionic France S.a.r.l | 15003-08 | Retinas dissection |
| Micro-ciseaux de Vannas courbe | 15004-08 | ||
| Pince Dumont 5 | 11254-20 | ||
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Life technologies | 4375786 | Thermocycler |
| Ultrasonic cleaner | Laboratory Supplies | G1125P1T | |
| Nanosep 30k omega tubes | VWR | ||
| Speedvac | Fisher Scientific | SC 110 A | |
| Spectrofluorometer | TECAN | infinite M1000 |
Referências
- Halfter, W. Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth. J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).
- Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E. Temporary disruption of the retinal basal lamina and its effect on retinal histogenesis. Dev Biol. 238 (1), 79-96 (2001).
- Halfter, W., Willem, M., Mayer, U. Basement membrane-dependent survival of retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 1000-1009 (2005).
- Abdelkader, E., Lois, N. Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery. Surv Ophthalmol. 53 (4), 368-396 (2008).
- Dalkara, D., et al. Inner limiting membrane barriers to AAV-mediated retinal transduction from the vitreous. Mol Ther. 17 (12), 2096-2102 (2009).
- Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
- Eichler, W., Kuhrt, H., Hoffmann, S., Wiedemann, P., Reichenbach, A. VEGF release by retinal glia depends on both oxygen and glucose supply. Neuroreport. 11 (16), 3533-3537 (2000).
- Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management. Prog Retin Eye Res. 27 (6), 622-647 (2008).
- Kaur, C., Sivakumar, V., Foulds, W. S. Early response of neurons and glial cells to hypoxia in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1126-1141 (2006).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvasc Res. 46 (2), 135-142 (1993).
- Yang, G. S., et al. Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size. J Virol. 76 (15), 7651-7660 (2002).
- Li, W., et al. Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye. Mol Vis. 15, 267-275 (2009).
- Koerber, J. T., et al. Molecular evolution of adeno-associated virus for enhanced glial gene delivery. Mol Ther. 17 (12), 2088-2095 (2009).
- Klimczak, R. R., Koerber, J. T., Dalkara, D., Flannery, J. G., Schaffer, D. V. A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells. PLoS One. 4 (10), e7467 (2009).
- Vacca, O., et al. AAV-mediated gene delivery in Dp71-null mouse model with compromised barriers. Glia. , (2013).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Hum Genet. 12 (Unit 12 19), (2007).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use. Curr Protoc Mol Biol. 16 (Unit 16 25), (2007).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348 (2011).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. J Vis Exp. (8), 313 (2007).
- Kolstad, K. D., et al. Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration. Hum Gene Ther. 21 (5), 571-578 (2010).
- Sene, A., et al. Functional implication of Dp71 in osmoregulation and vascular permeability of the retina. PLoS One. 4 (10), e7329 (2009).
- Benard, R. A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice. ARVO Annual Meeting. , (2011).
