Utilizzando virus adeno-associati come strumento per studiare le barriere della retina nella malattia
Summary
To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.
Abstract
Müller cellule sono le principali cellule gliali della retina. I loro finali piedi formano i limiti della retina alle membrane limitanti esterna ed interna (ILM), e in collegamento con astrociti, periciti e cellule endoteliali stabiliscono la barriera emato-retinica (BRB). BRB limita trasporto di materiale tra il flusso sanguigno e la retina mentre la ILM agisce come una membrana basale che definisce istologicamente il confine tra la retina e la cavità vitreo. Etichettatura cellule Müller è particolarmente rilevante per studiare lo stato fisico delle barriere della retina, in quanto queste cellule sono parte integrante della BRB e ILM. Sia BRB e ILM sono spesso alterati nelle malattie della retina e sono responsabili per i sintomi della malattia.
Esistono diversi metodi ben stabiliti per studiare l'integrità del BRB, quali il test blu Evans o fluorangiografia. Tuttavia questi metodi non forniscono informazioni sul grado di permeabilità BRB to molecole più grandi, in nanometri. Inoltre, essi non forniscono informazioni sullo stato di altri ostacoli retina, come la ILM. Per studiare BRB permeabilità al fianco della retina ILM, abbiamo usato un metodo basato AAV che fornisce informazioni sulla permeabilità della BRB di molecole più grandi, pur indicando lo stato dei ILM e della matrice extracellulare proteine in stati di malattia. Due varianti di AAV sono utili per tale studio: AAV5 e ShH10. AAV5 ha un tropismo naturale fotorecettori, ma non si può ottenere attraverso la retina esterna quando somministrato nel vitreo quando l'ILM è intatto (cioè, in wild-type retine). ShH10 ha un forte tropismo verso le cellule gliali e selettivamente etichettare glia Müller sia retine sani e malati. ShH10 fornisce consegna del gene più efficiente in retine dove ILM è compromessa. Questi strumenti virali accoppiato con immunoistochimica e sangue-DNA analisi hanno fatto luce sulla condizione delle barriere retina nella malattia.
Introduction
Müller cellule sono il principale componente gliale della retina. Morfologicamente, che abbracciano la retina radiale e la loro endfeet, in contatto con il vitreo, affrontano la ILM e componenti segreti di quest'ultima. La ILM è una membrana basale composta da una decina di diverse proteine della matrice extracellulare (laminina, agrin, perlecan, nidogen, collagene e proteoglicani diversi solfato eparina). Durante lo sviluppo, la sua presenza è indispensabile per istogenesi retinica, la navigazione di assoni ottica, e la sopravvivenza delle cellule gangliari 1-3. Tuttavia, ILM è inessenziale in retina adulta e può essere rimosso chirurgicamente in alcune patologie, senza causare danni alla retina 4. Nella terapia genica, questa membrana diventa una barriera fisica per la trasduzione efficiente della retina mediante AAV per iniezione intravitreale 5.
Attraverso l'ampia arborizzazione dei loro processi, le cellule Müller forniscono Suppo nutrizionale e regolamentarert per entrambi i neuroni della retina e cellule vascolari. Cellule Müller sono anche coinvolti nella regolazione dell'omeostasi retinica, nella formazione e mantenimento del BRB 6. Giunzioni strette tra le cellule endoteliali dei capillari della retina, Müller cellule, astrociti e periciti formano la BRB. BRB previene alcuni sostanze di entrare i retina.In molte malattie come la retinopatia diabetica, occlusione venosa retinica e malattie respiratorie, ipossia della retina provoca perdita attraverso la BRB 7-9. Questa rottura è associato ad un aumento della permeabilità vascolare che porta a edema vasogenico, distacco della retina e danni alla retina.
Cellule Müller sono strettamente associati con i vasi sanguigni e la membrana basale, svolgendo un ruolo importante sia l'integrità BRB e ILM. Di conseguenza, l'etichettatura cellule gliali Müller è particolarmente rilevante per lo studio dello stato fisico di queste barriere retiniche.
Classicoalleato, BRB permeabilità viene misurata usando il saggio blu Evans costituito da iniezione sistemica di Evans colorante blu, che lega non covalente all'albumina plasmatica. Questo test misura la perdita di albumina (proteine di dimensioni intermedie, ~ 66 kDa) dai vasi sanguigni nella retina (vedi Protocolli sezione 5) 10. In alternativa, la perdita vascolare può essere visualizzato con la fluorescenza angiografia retinica attestante l'assenza di perdite di fluoresceina (piccola molecola, ~ 359 Da, vedere Protocolli sezione 6) 11. Tuttavia, entrambi i metodi consentono la valutazione della permeabilità BRB di piccole molecole e proteine, ma non forniscono informazioni circa l'integrità ILM.
Quindi, a studiare BRB permeabilità, abbiamo usato un metodo basato AAV che fornisce informazioni sulla permeabilità BRB di molecole più grandi (ad esempio, le particelle di AAV, 25 di diametro nm). In effetti, il nostro metodo in grado di rilevare la presenza di AAV transgene nel sangue, il che suggerisce che le particelle ~ 25 nm di diametro farebberoessere in grado di infiltrarsi nel flusso sanguigno. Questo metodo fornisce anche informazioni sulla struttura del ILM e proteine della matrice extracellulare in condizioni patologiche. Due varianti di AAV sono utili per tale studio: AAV5 e ShH10. Subretinally iniettato, AAV5 ha un tropismo naturale per fotorecettori della retina e dell'epitelio pigmentato 12, ma non si può ottenere attraverso la retina esterna quando somministrato nel vitreo in wild-type retine con ILM intatto 5,13. ShH10 è una variante AAV che è stato progettato per indirizzare specificamente cellule gliali oltre neuroni 14,15. ShH10 etichette selettivamente le cellule Müller sia retine sani e malati con maggiore efficienza in retine con barriere compromesse 16. Questi strumenti virali accoppiato con immuhistochemistry e analisi del sangue-DNA forniscono informazioni sullo stato degli ostacoli retiniche e il loro coinvolgimento nella malattia (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
La BRB regola lo scambio di molecole tra sangue e retina. La sua composizione è associata a diverse malattie come la retinopatia diabetica o la degenerazione maculare legata all'età (AMD). Abbiamo recentemente dimostrato che in un topo distrofina knock-out, che visualizza permeabile BRB, la retina diventa più permissiva di consegna del gene mediato da vettori virali adeno-associati (AAV). Tuttavia, nonostante BRB particelle permeabilità AAV iniettato intraoculare rimanere confinata al compartimento oculare in qu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the imaging platform of the Institut de la Vision. We acknowledge the French Muscular Dystrophy Association (AFM) for a PhD fellowship to O.V. and Allergan INC. This work performed in the frame of the LABEX LIFESENSES [reference ANR-10-LABX-65] was supported by French state funds managed by the ANR. We thank Peggy Barbe, and Mélissa Desrosiers for technical assistance with AAV preparations. We are grateful to Stéphane Fouquet for excellent technical assistance in confocal microscopy and his expert input with the interpretation of the results.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| C57BL6J mice strain | JANVIER LABS | mice | |
| Ketamine 500 | Virbac France | anesthetic | |
| Xylazine Rompun 2% | Bayer Healthcare | anesthetic | |
| Neosynephrine 5% Faure | Europhta | dilatant | |
| Mydriaticum 0,5% | Thea | dilatant | |
| Sterdex | Novartis | anti-inflammatory | |
| Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | 10143352 | slides |
| anti-laminin | Sigma | L9393 | antibody |
| anti-rhodopsin clone 4D2 | Millipore | MABN15 | antibody |
| anti-glutamine synthetase clone GS-6 | Millipore | MAB302 | antibody |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein | Dako | 334 | antibody |
| PNA Lectin | Invitrogen | L32459 | probe |
| Alexa fluor conjugated secondary antibodies | Invitrogen | antibody | |
| Fluorsave reagent | Calbiochem | 345789 | mounting medium |
| QIAmp DNA Micro Kit | QIAGEN | 56304 | |
| GoTaq DNA polymerase | Promega | M3001 | |
| Evans Blue dye | Sigma | E2129 | dye |
| 5 µm filter | Millipore | ||
| Sodium Citrate | Sigma | S1804 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-2.5KG | |
| Formamide spectrophotometric | Sigma | 295876-2L | |
| Fluorescein | Sigma | F2456 | dye |
| Micron III | Phoenix Research Labs | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. | |
| Insulin Syringes | Terumo | SS30M3109 | |
| Syringe 10 µl Hamilton | Dutscher | 74487 | Seringue 1701 |
| Needle RN G33, 25 mm, PST 2 | Fisher Scientific | 11530332 | Intravitreal Injection |
| UltraMicroPump UMP3 | World Precision Instruments | UMP3 | Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | UMP3-1 | Digital controller | |
| Binocular magnifier SZ76 | ADVILAB | ADV-76B2 | Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection |
| Spring scissors straight – 8,5cm | Bionic France S.a.r.l | 15003-08 | Retinas dissection |
| Micro-ciseaux de Vannas courbe | 15004-08 | ||
| Pince Dumont 5 | 11254-20 | ||
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Life technologies | 4375786 | Thermocycler |
| Ultrasonic cleaner | Laboratory Supplies | G1125P1T | |
| Nanosep 30k omega tubes | VWR | ||
| Speedvac | Fisher Scientific | SC 110 A | |
| Spectrofluorometer | TECAN | infinite M1000 |
Referências
- Halfter, W. Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth. J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).
- Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E. Temporary disruption of the retinal basal lamina and its effect on retinal histogenesis. Dev Biol. 238 (1), 79-96 (2001).
- Halfter, W., Willem, M., Mayer, U. Basement membrane-dependent survival of retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 1000-1009 (2005).
- Abdelkader, E., Lois, N. Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery. Surv Ophthalmol. 53 (4), 368-396 (2008).
- Dalkara, D., et al. Inner limiting membrane barriers to AAV-mediated retinal transduction from the vitreous. Mol Ther. 17 (12), 2096-2102 (2009).
- Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
- Eichler, W., Kuhrt, H., Hoffmann, S., Wiedemann, P., Reichenbach, A. VEGF release by retinal glia depends on both oxygen and glucose supply. Neuroreport. 11 (16), 3533-3537 (2000).
- Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management. Prog Retin Eye Res. 27 (6), 622-647 (2008).
- Kaur, C., Sivakumar, V., Foulds, W. S. Early response of neurons and glial cells to hypoxia in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1126-1141 (2006).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvasc Res. 46 (2), 135-142 (1993).
- Yang, G. S., et al. Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size. J Virol. 76 (15), 7651-7660 (2002).
- Li, W., et al. Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye. Mol Vis. 15, 267-275 (2009).
- Koerber, J. T., et al. Molecular evolution of adeno-associated virus for enhanced glial gene delivery. Mol Ther. 17 (12), 2088-2095 (2009).
- Klimczak, R. R., Koerber, J. T., Dalkara, D., Flannery, J. G., Schaffer, D. V. A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells. PLoS One. 4 (10), e7467 (2009).
- Vacca, O., et al. AAV-mediated gene delivery in Dp71-null mouse model with compromised barriers. Glia. , (2013).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Hum Genet. 12 (Unit 12 19), (2007).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use. Curr Protoc Mol Biol. 16 (Unit 16 25), (2007).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348 (2011).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. J Vis Exp. (8), 313 (2007).
- Kolstad, K. D., et al. Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration. Hum Gene Ther. 21 (5), 571-578 (2010).
- Sene, A., et al. Functional implication of Dp71 in osmoregulation and vascular permeability of the retina. PLoS One. 4 (10), e7329 (2009).
- Benard, R. A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice. ARVO Annual Meeting. , (2011).
