Aracı Olarak Adeno-ilişkili virüs kullanarak Hastalığında Retina Engelleri Eğitim için
Summary
To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.
Abstract
Müller hücrelerinin retina ana glial hücreler bulunmaktadır. Bunların son ayak, dış ve iç sınır membran (ILM) retinanın sınırlarını oluştururlar ve astrositler, perisitlere ve endotelyal hücreler ile bağlantılı olarak, kan-retina bariyerini (BRB) oluşturmaktadır. ILM retina ve vitreus boşluğuna arasında histolojik sınırı tanımlayan bir bazal membran gibi davranır ise BRB kan ve retina arasındaki malzeme taşıma sınırlar. Müller hücrelerinin etiketlenmesi bu hücreler BRB ve ILM ayrılmaz bir parçası olarak, retina bariyerinin fiziksel durumunu incelemek için özellikle önemlidir. BRB ve ILM Hem sık retina hastalığında değişmiş ve hastalık belirtileri sorumludur vardır.
Böyle Evans mavisi deney veya floresein anjiyografi gibi brb bütünlüğünü incelemek için birkaç köklü yöntemler vardır. Ancak bu yöntemler BRB geçirgenlik t ölçüde bilgi vermemektedirnanometre aralığı içinde daha büyük moleküller, o. Ayrıca, böyle ILM gibi diğer retina engellerin durumuna ilişkin bilgi vermemektedir. Retina ILM ile birlikte BRB geçirgenliğini incelemek için, hastalık durumlarında ILM ve hücre dışı matris proteinlerinin durumunu gösteren ancak daha büyük moleküllere BRB geçirgenliği ile ilgili bilgi sağlayan bir AAV esaslı yöntemi kullanılır. İki AAV varyantlar, çalışma için faydalıdır: AAV5 ve ShH10. AAV5 Fotoreseptörlerin için doğal bir tropizm vardır ama ILM sağlam olduğunda (vahşi tip retina yani) vitreus içine verildiğinde, dış retina genelinde alınamıyor. ShH10 glial hücrelerine karşı güçlü bir tropizm vardır ve seçici sağlıklı ve hastalıklı retina hem de Müller glia etiketleyecektir. ShH10 ILM tehlikeye retina daha verimli gen teslim sağlar. Immunohistokimyası ve kan-DNA analizi ile birleştiğinde bu viral hastalığın araçlar retina engellerin durumuna da ışık tutacaktır.
Introduction
Müller hücreleri retinanın büyük glial bileşenidir. Morfolojik, onlar, vitreus ile temas radyal retina ve endfeet, yayılan ILM ve ikinci gizli bileşenleri karşı karşıya. ILM on farklı hücre dışı matris proteinleri (laminin Agrin, perlekan, nidojen, kollajen ve çeşitli heparin sülfat proteoglikanlar) oluşan bir taban zarıdır. Gelişimi sırasında, kendi varlığı ganglion hücrelerinin 1-3 retina histogenezisleri, optik akson navigasyon, ve hayatta kalmak için vazgeçilmezdir. Ancak, ILM yetişkin retinada önemsiz olduğunu ve cerrahi retina hasarı 4 neden olmadan belirli patolojilerin kaldırılabilir. Gen terapisi, bu membran intravitreal enjeksiyonu 5 ile AAVS kullanarak retinanın verimli iletimi için fiziksel bir bariyer haline gelir.
Süreçlerini geniş arborization sayesinde, Müller hücreleri beslenme ve düzenleyici Suppo sağlamakoda sıcaklığı, retina nöronlarının ve vasküler hücrelerin hem de. Müller hücrelerinin de BRB 6 oluşumu ve bakım, retina homeostazının düzenlenmesinde rol oynamaktadır. Sıkı bağlantılar retina kapilar endotelial hücreler arasında, Müller hücrelerin, astrositlerin ve perisitler BRB oluştururlar. BRB diyabetik retinopati, retina ven tıkanıklığı ve solunum yolu hastalıkları gibi birçok hastalığın retina.In girmesini bazı maddeler önler, retinanın hipoksi BRB 7-9 ile sızıntı neden olur. Bu yırtılma vazojenik ödem, retina dekolmanı ve retina hasarına yol açan damar geçirgenliği bir artış ile ilişkilidir.
Müller hücrelerinin sıkı hem BRB ve ILM bütünlük içinde önemli bir rol oynayan, kan damarları ve bazal membran ile ilişkilidir. Sonuç olarak, Müller glial hücreler etiketleme bu retina engellerin fiziksel durumunun çalışmaya özellikle önemlidir.
Klasikortağı BRB geçirgenliği plazma albümini ile kovalent olmayan bir şekilde bağlanan Evans mavi boya, sistemik enjeksiyonundan oluşan Evans mavisi analizi kullanılarak ölçülür. Bu tahlil retina içine kan damarlarının 10 (Protokoller Bölüm 5'e bakınız) albumin kaçağı (orta büyüklükte protein, ~ 66 kDa) ölçer. Alternatif olarak, vasküler sızıntı floresan sızıntı doğrulayan floresan retina anjiyografi ile görüntülendi olabilir (küçük molekülü, ~ 359 Da; Protokoller Bölüm 6) 11. Bununla birlikte, her iki yöntem küçük moleküller ve proteinlere BRB geçirgenlik değerlendirilmesini sağlar ancak ILM bütünlüğü hakkında bilgi vermemektedir.
Bu nedenle, BRB geçirgenliğini incelemek için, biz, daha büyük moleküller (örneğin, AAV parçacıklar 25 nm çapında) için BRB geçirgenliği ile ilgili bilgi veren bir AAV esaslı yöntemi kullanılır. Nitekim, bizim yöntem öneririz, hangi kan AAV transgen varlığını tespit edebilir ~ 25 nm çapında parçacıkları olurkana sızmak mümkün. Bu yöntem, aynı zamanda patolojik durumlarda ILM ve hücre dışı matris proteinlerinin yapısı hakkında bilgi içerir. İki AAV varyantlar, çalışma için faydalıdır: AAV5 ve ShH10. Subretinally enjekte AAV5 fotoreseptör ve retina pigment epiteli 12 için doğal bir tropizm var ama sağlam ILM 5,13 ile yabani tip retina vitreus içine verildiğinde, dış retina genelinde alınamıyor. ShH10 özellikle nöron 14,15 fazla glial hücreler hedef için işlenmiş olan bir AAV varyantıdır. ShH10 seçici tehlikeye engelleri 16 retina artan verimlilik ile sağlıklı ve hastalıklı retina hem de Müller hücreleri etiketler. Immuhistochemistry ve kan-DNA analizi ile birleştiğinde bu viral araçlar retina engellerin devlet ve hastalık onların katılımı (Şekil 1) hakkında bilgi verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
BRB kan ve retina arasındaki moleküller değişimini kontrol eder. Bu dökümü diyabetik retinopati veya yaşa ilişkin makula dejenerasyon (AMD) gibi çeşitli hastalıklarla ilişkilidir. Son zamanlarda geçirgen BRB görüntüleyen bir distrofin nakavt fare üzere retina adeno-ilişkili viral vektörler (AAV) tarafından aracılık edilen gen aktarımı için daha geçirgen hale göstermiştir. Ancak, BRB geçirgenlik AAV parçacıklar rağmen göz içine bu modelde göz bölmeye sınırlı kalmak enjekte. Sonuçl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the imaging platform of the Institut de la Vision. We acknowledge the French Muscular Dystrophy Association (AFM) for a PhD fellowship to O.V. and Allergan INC. This work performed in the frame of the LABEX LIFESENSES [reference ANR-10-LABX-65] was supported by French state funds managed by the ANR. We thank Peggy Barbe, and Mélissa Desrosiers for technical assistance with AAV preparations. We are grateful to Stéphane Fouquet for excellent technical assistance in confocal microscopy and his expert input with the interpretation of the results.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| C57BL6J mice strain | JANVIER LABS | mice | |
| Ketamine 500 | Virbac France | anesthetic | |
| Xylazine Rompun 2% | Bayer Healthcare | anesthetic | |
| Neosynephrine 5% Faure | Europhta | dilatant | |
| Mydriaticum 0,5% | Thea | dilatant | |
| Sterdex | Novartis | anti-inflammatory | |
| Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | 10143352 | slides |
| anti-laminin | Sigma | L9393 | antibody |
| anti-rhodopsin clone 4D2 | Millipore | MABN15 | antibody |
| anti-glutamine synthetase clone GS-6 | Millipore | MAB302 | antibody |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein | Dako | 334 | antibody |
| PNA Lectin | Invitrogen | L32459 | probe |
| Alexa fluor conjugated secondary antibodies | Invitrogen | antibody | |
| Fluorsave reagent | Calbiochem | 345789 | mounting medium |
| QIAmp DNA Micro Kit | QIAGEN | 56304 | |
| GoTaq DNA polymerase | Promega | M3001 | |
| Evans Blue dye | Sigma | E2129 | dye |
| 5 µm filter | Millipore | ||
| Sodium Citrate | Sigma | S1804 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-2.5KG | |
| Formamide spectrophotometric | Sigma | 295876-2L | |
| Fluorescein | Sigma | F2456 | dye |
| Micron III | Phoenix Research Labs | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. | |
| Insulin Syringes | Terumo | SS30M3109 | |
| Syringe 10 µl Hamilton | Dutscher | 74487 | Seringue 1701 |
| Needle RN G33, 25 mm, PST 2 | Fisher Scientific | 11530332 | Intravitreal Injection |
| UltraMicroPump UMP3 | World Precision Instruments | UMP3 | Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | UMP3-1 | Digital controller | |
| Binocular magnifier SZ76 | ADVILAB | ADV-76B2 | Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection |
| Spring scissors straight – 8,5cm | Bionic France S.a.r.l | 15003-08 | Retinas dissection |
| Micro-ciseaux de Vannas courbe | 15004-08 | ||
| Pince Dumont 5 | 11254-20 | ||
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Life technologies | 4375786 | Thermocycler |
| Ultrasonic cleaner | Laboratory Supplies | G1125P1T | |
| Nanosep 30k omega tubes | VWR | ||
| Speedvac | Fisher Scientific | SC 110 A | |
| Spectrofluorometer | TECAN | infinite M1000 |
Referências
- Halfter, W. Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth. J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).
- Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E. Temporary disruption of the retinal basal lamina and its effect on retinal histogenesis. Dev Biol. 238 (1), 79-96 (2001).
- Halfter, W., Willem, M., Mayer, U. Basement membrane-dependent survival of retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 1000-1009 (2005).
- Abdelkader, E., Lois, N. Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery. Surv Ophthalmol. 53 (4), 368-396 (2008).
- Dalkara, D., et al. Inner limiting membrane barriers to AAV-mediated retinal transduction from the vitreous. Mol Ther. 17 (12), 2096-2102 (2009).
- Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
- Eichler, W., Kuhrt, H., Hoffmann, S., Wiedemann, P., Reichenbach, A. VEGF release by retinal glia depends on both oxygen and glucose supply. Neuroreport. 11 (16), 3533-3537 (2000).
- Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management. Prog Retin Eye Res. 27 (6), 622-647 (2008).
- Kaur, C., Sivakumar, V., Foulds, W. S. Early response of neurons and glial cells to hypoxia in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1126-1141 (2006).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvasc Res. 46 (2), 135-142 (1993).
- Yang, G. S., et al. Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size. J Virol. 76 (15), 7651-7660 (2002).
- Li, W., et al. Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye. Mol Vis. 15, 267-275 (2009).
- Koerber, J. T., et al. Molecular evolution of adeno-associated virus for enhanced glial gene delivery. Mol Ther. 17 (12), 2088-2095 (2009).
- Klimczak, R. R., Koerber, J. T., Dalkara, D., Flannery, J. G., Schaffer, D. V. A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells. PLoS One. 4 (10), e7467 (2009).
- Vacca, O., et al. AAV-mediated gene delivery in Dp71-null mouse model with compromised barriers. Glia. , (2013).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Hum Genet. 12 (Unit 12 19), (2007).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use. Curr Protoc Mol Biol. 16 (Unit 16 25), (2007).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348 (2011).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. J Vis Exp. (8), 313 (2007).
- Kolstad, K. D., et al. Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration. Hum Gene Ther. 21 (5), 571-578 (2010).
- Sene, A., et al. Functional implication of Dp71 in osmoregulation and vascular permeability of the retina. PLoS One. 4 (10), e7329 (2009).
- Benard, R. A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice. ARVO Annual Meeting. , (2011).
