Abstract
Små molekyler ger rika mål för biosensing applikationer på grund av deras fysiologiska konsekvenser som biomarkörer för olika aspekter av människors hälsa och prestation. Nukleinsyra aptamers har alltmer tillämpas som igenkänningselement på biosensor plattformar, men att välja aptamers mot småmolekylära mål kräver speciella design överväganden. Detta arbete beskriver modifiering och kritiska steg i en metod som syftar till att välja struktur-växling aptamers till småmolekylära mål. Bindnings sekvenser från ett DNA-bibliotek hybridiserades till komplementära DNA-infångningssonder på magnetiska pärlor separeras från nonbinders via en mål-inducerad förändring i konformation. Denna metod är fördelaktig eftersom sekvenser binder bärmatrisen (pärlor) kommer inte att ytterligare förstärkas, och det kräver inte immobilisering av målmolekylen. Emellertid är smälttemperaturen för infångningsproben och bibliotek hålls vid eller något över RT, sådana att sekvenser thatt dehybridize baserat på termodynamik kommer också att vara närvarande i den överstående lösningen. Detta begränsar effektivt partitioneeffektivitet (förmåga att separata mål bindande sekvenser från nonbinders), och därmed många urvalsomgångarna kommer att krävas för att ta bort bakgrundssekvenser. Den redovisade metoden skiljer sig från tidigare struktur-växling aptamer val på grund av genomförandet av negativa selektionssteg, förenklat övervaknings anrikning och utvidgning av längd infångningssökfragmentet följande urval anrikning för att ge förbättrad stringens. De valda strukturmodifierande omkopplings aptamerer är fördelaktiga i en guldnanopartiklar analysplattform som rapporterar förekomsten av en målmolekyl genom den konformationsförändring av aptamer. Guldet nanoparticle analysen tillämpades eftersom det ger en enkel, snabb kolorimetrisk avläsning som är bra i en klinisk eller utplacerade miljö. Design och optimering överväganden presenteras för analysen som proof-of-principle arbete i buffert för att ge en grund för ytterligare utvidgning av arbetet mot småmolekylära biosensing i fysiologiska vätskor.
Introduction
Små molekyler har länge setts som spelar viktiga roller i olika biologiska processer såsom fysiologisk toxicitet eller näring, cellsignalering och som läkemedelsbehandling till sjukdoms 1. Olika små molekyler har också föreslagits som biomarkörer som indikerar fysiologiska förhållanden bland annat stress 2,3, trötthet 4, och sjukdom 5. Till exempel, förhöjda kortisolnivåer korrelerar stress vilket kan resultera i minskad fysiologisk prestanda och andra hygienkrav 6-8. Likaså variationer i förhållandet mellan vissa peptider i saliv är prediktiva för trötthet, där fysiologiska manifestationer inkluderar brist på koncentration, försämrad reaktionstid och minskad kognitiv funktion 4. Därför kan utvecklingen av målspecifika biosensorer för att kontrollera nivåerna av små molekyler ger en ovärderlig statistiken för att bedöma hälso- och prestandan hos en individual.
Historiskt har liten molekyl detektering utförts av arbetsintensiva separationstekniker eller genom antikroppsbaserade erkännande 6,7. På senare tid har nukleinsyrasekvenser aptamerer 9,10 dykt upp som igenkänningselement som besitter distinkta fördelar jämfört med antikroppar i specifika tillämpningar. Med sin förmåga att binda ett mål som varierar i storlek från metalljoner 11 till vävnader 12, har aptamers har i stor utsträckning som igenkänningselement i biosensing plattformar 13,14. Jämfört med antikroppar, är aptamers kemiskt syntetiserade, och det är därför enkelt att införa reproducerbara kemiska modifieringar för ytan immobilisering eller rapportering. Aptamerer kan väljas med hög målspecificitet under de önskade förhållanden genom att ändra villkoren för urval används, medan antikroppar är begränsade till fysiologiska förhållanden 15,16. Dessutom aptamerer är kapabla högre ligandtäthet grund thEIR mindre storlek, vilket resulterar i högre mål signalerings verkningsgrad på en biosensor plattform, och den förbättrade stabiliteten hos aptamers möjliggör upprepad användning och långsiktig sensor förvaring 16.
Aptamerer genereras genom ett förfarande som kallas SELEX, där en initial bibliotek av sekvenser utvecklats från 10 13 -10 15 unika molekyler till en berikad final pool som innehåller flera (10 1 -10 2) sekvenser med potential att binda målmolekylen. Den slutliga anrikade poolen därefter sekvenseras och dissociationskonstanterna (Kd) erhålls från bindningsanalyser av de högsta kopietal sekvenser med målmolekylen. Utvecklingen av poolen till en slutlig anrikad population spåras genom att övervaka den procentuella andelen av poolen bindande målet på varje runda, tills maximal anrikning erhålles. Detta sker under ett antal evolutionära omgångar, där bindande sekvenser partitionerad från nonbinders och amplsom du angav användning av polymeraskedjereaktionen (PCR). Förmågan att effektivt partitionera och behålla bindemedel är en av de viktigaste faktorerna för effektiviteten i urvals- och direkt påverkar egenskaperna hos de utvalda aptamers 15. SELEX partitione skede är mer utmanande för små molekyler, eftersom de inte har den storlek eller olika funktionella grupper som stöd fördelningsprocessen av protein mål 1,15. Till exempel har många proteinpartitione plattformar förlitar sig på storlek eller laddning baserad separation, men egenskaperna hos bundna DNA-småmolekylära mål-komplex är i allmänhet inte signifikant annorlunda än för icke-bindande sekvenser, vilket resulterar i ineffektiv partitione 1. Alternativa SELEX partitionemetoder kan innebära immobilisering eller märkning av målet, vilket potentiellt förändra de bindande egenskaperna hos en liten molekyl. Följaktligen till utformning av ett urvalsförfarande genererar aptamers för liten molekyl riktar requires särskild hänsyn.
En mängd olika modifieringar har tillämpats på den ursprungliga SELEX metodik för att förbättra partitione effektivisera förfarandet, förbättra affinitet eller specificitet av sekvenserna i den slutliga poolen, eller göra det mer mottaglig för olika applikationer 15,16. Ett SELEX modifikation kapabla att välja för små molekyler designades för att generera strukturmodifierande omkopplings aptamerer, eller aptamerer som undergår en konformationsförändring vid interagera med målmolekylen 17,18. I ett exempel på detta förfarande, är biblioteket hybridiseras till en kort bit av nonbinding komplementärt DNA (cDNA) immobiliserade på magnetiska pärlor 17. Vid målet bindande, konformationsförändring av bindande sekvenser gör att de kan dehybridize från cDNA, släppa in dem i supernatantlösningen, medan nonbinders förblir hybridiserade till cDNA / pärlor är magnetiskt partitionerad och kasseras. Denna metod är Advanaktiga för små molekyler, eftersom den inte kräver immobilisering eller märkning av målmolekylen att uppnå separation.
Aptamerer som kan struktur-switch besitter en värdefull funktion för varje potentiell biosensor plattform som kräver en förändring i aptamer struktur för att påvisa förekomsten av en målmolekyl. Specifikt kan aptamers kombineras med guldnanopartiklar (AuNPs) för att skapa analyser som funktion baserad på principen strukturen växling för att producera en kolorimetrisk reaktion i närvaro av målmolekyl efter salt utmaning 19,20. I en AuNP analys, den enkelsträngat DNA (ssDNA) aptamer adsorberar initialt till AuNP ytan och skyddar den från salt utmaning. Närvaron av målet inducerar en konformationell förändring i aptamer som exponerar AuNP yta, vilket resulterar i en röd-till-blå färgförändring efter salttillsats. AuNP analyser har också visat att förstärka signalen, där mikromolar affinitet aptamers kan upptäcka mål på nivåer tiopotenser lägre än dissociationskonstanten (Kd) 21. Den här funktionen är särskilt attraktivt för småmolekylära mål, där tillhörighet sträcker vanligtvis från låg mikromolär till millimolära koncentrationer 1,15. Generellt är analysen också snabb och relativt enkel att utföra, uppmuntra ytterligare studier av aptamer-AuNP analyser som biosensordetektionsplattformar.
Målet med detta arbete är att ge en universell protokoll för att välja struktur-växling aptamers till små molekyler för biosensing applikationer som använder stressmarkören kortisol som en representativ molekyl. En ordning AuNP biosensor upptäckt är av intresse på grund av dess enkelhet i drift och kolorimetrisk avläsning, men struktur-växling aptamers är tillämpliga på alternativa sensorplattform utgångar, såsom elektro 22 eller fluorescens 23 som också upptäckt via en förändring i aptamer conformation vid målbindning. Jämfört med tidigare metoder, var flera negativa selektionssteg införlivas i utformningen 17,18, och en enkel UV-baserade system upptäckt anrikning fördes (Figur 1). Detta protokoll står i kontrast med radioligand anrikningsschema detektering används i äldre metoder 17. Den föreslagna metoden inkorporerade också en ökning av längden på cDNA infångningsprober används i urvals att öka partitioneeffektiviteten och effektivt ställa stringensen i urvalet efter maximal anrikning observerades 24. Den avstämda stringens leder till en lägre total procentandel av DNA elueras genom målet i den slutliga poolen, men resulterade i högre kopietal av en sekvens som band med förbättrad affinitet jämfört med det högsta kopietalet sekvens från en tidigare runda. Det högsta kopietalet sekvens från den slutliga poolen applicerades på en AuNP analys för att illustrera att sekvensen var mottaglig för en plattformsom kräver en strukturell förändring för att indikera målet bindande. Denna buffert baserad analys visar att svaret från AuNP analysen kan ändras genom att ändra tätheten av DNA appliceras på ytan, och fungerar som proof-of-principle arbete att ägna framtida forskningsinsatser mot att utveckla små molekyler aptamer baserade AuNP biosensorer i fysiologiska vätskor.
Protocol
1. Biblioteks- och Primer Design och syntes
- Designa den initiala biblioteket och primers (detta ämne har granskats i stor utsträckning i tidigare publikationer) 25,26.
- Syntetisera följande sekvenserna för denna studie genom standard fosforamidit kemi:
Bibliotek: GAATGGATCCACATCCATGG-N 40 -TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTTGACGAA
Framåt Primer: GGAATGGATCCACATCCATGG
Omvänd primer: Biotin-AAGCTTCGTCAAGTCTGCAGTGAA - Utforma cDNA infångningsprober att vara komplementär till 5'-regionen av biblioteket. Välj den ursprungliga längden genom analys av online-smälttemperatur programvaran för att tillhandahålla en smälttemperatur något över RT, med varje efterföljande bas levererar en ökad smälttemperatur.
mer-infångningsprob: CCATTCC-biotin
mer-infångningsprob: TCCATTCC-biotin
mer-infångningsprob: ATCCATTCC-biotin
- Syntetisera följande sekvenserna för denna studie genom standard fosforamidit kemi:
- Rena biblioteket med standard HPLC. Avsaltning är tillräck-räckligt för de primrar och infångningsprober. Bered oligonukleotider i nukleasfritt vatten vid den önskade koncentrationen och förvara vid -20 ° C i upp till flera månader.
2. Buffert, Bibliotek och Provberedning
- Bered 500 ml av buffert i Millipore eller nukleasfritt kvalitet vatten med koncentrationer av 50 mM Tris, 137 mM NaCl, 5 mM MgCl2, pH 7,4. Filtrera bufferten genom ett sterilt 0,2 fim membran; lagring är möjlig vid omgivningsbetingelser i månader.
- Alternativt använda andra buffertar såsom PBS (fosfatbuffrad saltlösning), HEPES (4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra), osv
- Ställ upp två thermomixers; ställa en till 95 ° C och hålla den andra vid omgivningsförhållanden (~ 20 ° C i detta arbete). Förbered en ishink.
- Värme / snap kyla DNA-biblioteket genom att placera 100 ^ bibliotek (~ 2,5 nmol 10 15 -10 16 sekvenser) i Thermo ställa ent 95 ° C under 5 min. Placera röret på is medan de magnetiska kulorna är beredda (avsnitt 3,1-3,6). Bestäm den faktiska koncentrationen av DNA-bibliotek genom UV-absorption vid λ = 260 nm och tillämpning av lämplig omvandlingsfaktor för biblioteket.
- Förbereda målgruppstamlösningar i ett medium lämpligt för målet löslighet.
- Förbered 100 mM analyt lager i DMSO. Dessa bestånd är lönsamt för ca 1 månad vid förvaring vid omgivningsförhållanden, men olika mål kommer att visa olika nedbrytningsprofiler.
3. Beredning av magnetiska pärlor och Initial Runda Urval
- Vortex 6.7 x 10 8 pärlor / ml streptavidinbelagda magnetiska pärlor och ta bort 400 pl till en ny mikrocentrifugrör. Placera röret på magneten för 2 min och avlägsna supernatanten.
- Tvätta kulorna genom tillsats 400 pl av bindningsbuffert, vortexa, och aspirering av supernatanten efter placeringröret på magneten för att separera pärlorna. Upprepa denna process tre gånger.
- Immobilisera infångningssonden på magnetiska kulor genom resuspendering pärlorna i 400 l bindningsbuffert med 50 ^ M (slutlig) infångningssökfragmentet och inkubation under 10 minuter under försiktig omrörning på Thermo vid omgivningsförhållanden.
- Tvätta pärlor tre gånger med 400 pl bindande buffert genom tvättstegen som beskrivs i avsnitt 3.2 för att ta bort fri infångningssökfragmentet upprepa.
- Resuspendera kulorna i 400 | il bindningsbuffert. Ta bort 100 pl av pärlan lösning för nästa steg, och behålla de resterande 300 ^ vid 4 ° C för att använda för ytterligare urvalsomgångarna i högst tre veckor.
- Tvätta pärlorna två gånger med 200 pl bindningsbuffert som beskrivs i avsnitt 3.2.
- Tillsätt 100 pl av snäpp kyld DNA från avsnitt 2.3 till de tvättade pärlorna och inkubera under 30 min med försiktig omröring med användning av Thermomixer vid omgivningsbetingelser.
NOTE: DNA koncentrationerna i de första omgångarna är högre än för efterföljande rundor för att minimera sekvensförlust i tidigare omgångar där unika sekvenser är teoretiskt närvarande. - Kvantifiera DNA i supernatanten med användning av UV-absorption såsom i avsnitt 2.3 och subtrahera denna från den ursprungliga mängden tillsatt i avsnitt 3.7 för att bedöma mängden av DNA bundet till pärlorna.
- Tvätta pärlorna med 200 ul bindningsbuffert följt av ytterligare två tvättningar med 200 pl bindningsbuffert med försiktig omröring på en Thermomixer under 5 min vid omgivande betingelser.
- Resuspendera kulorna i 200 | il av 100 | iM mål utspädda i bindningsbuffert, och rotera på Thermomixer under 30 minuter vid omgivningsbetingelser. Bered arbetslösningar färska vid början av varje dag före val eftersom målet och kontroll observerades att aggregera ur vattenhaltig lösning över tiden. Behåll supernatanten lösning som innehåller mål-elueras sekvenss för vidare studier.
- Utför negativt urval efter slutförandet av 1-2 rundor genom att lägga 200 pl 1 iM progesteron till pärlorna upprättats i avsnitt 3.8.1. Skaka försiktigt i 30 minuter på Thermo vid omgivningsförhållanden.
- Använd den magnetiska monter för att fånga kulorna och kassera supernatanten, tvätta pärlorna två gånger i 200 pl bindningsbuffert före kortisol tillägg som i avsnitt 3.9.
4. Anrikning Övervakning, PCR, och Single DNA Generation
- Lägg supernatantlösningen till en dialyskassett för att övervaka valet anrikning. Dialys är nödvändigt att avlägsna kortisol från eluerat DNA eftersom kortisol är närvarande i mycket högre koncentrationer än DNA, och har även en UV-absorptionstopp som överlappar den standard-DNA UV λ max = 260 nm.
- Utför detta steg vartannat v (rundor 2, 4, 6, och 8) i de första omgångarna av valet. Detta mildrar prov loss när potentiellt få kopior nummer varje sekvens är närvarande (högsta mångfald). För snabbare resultat, kan alternativa metoder såsom storlek uteslutningskolonner utnyttjas också.
- Dialysera kassett med prov i färska 250 ml bindningsbuffert under 2 h vid omgivningsbetingelser två gånger. Byt buffert och inkubera vid 4 ° CO / N.
- Analysera dialyse poolen med UV-spektroskopi för att bestämma den procentuella andelen av DNA som eluerades genom målet (jämför med resultaten från avsnitt 3.8).
- Bered en 3% agarosgel med 1% vikt / volym etidiumbromid. I detta arbete, förbereda en gel från 1,5 g agaros, 50 ml TAE-buffert (40 mM Tris-acetat, 1 mM EDTA, pH = 8,0), och 10 pl av etidiumbromid.
- Cykel-optimera dialys poolen genom att utföra en liten skala PCR (5 x 50 l alikvoter) använder ~ 5-15 cykler. För PCR komponenterna, använd 1x PCR-reaktionsbuffert (alla slutkoncentrationer), 200 iM dNTP, 10% reaktionsvolym av DNA-mall, 500 nM varje primer och 2,5U-polymeras (2,5 U / l lager).
- Kör PCR med användning optimerade betingelser vid 95 ° C under 2 min, följt av upprepade cykler av 95 ° C (30 sek), 55 ° C (30 sek), och 72 ° C (1 min), sedan en 72 ° C (10 min) slutlig förlängning och håll vid 4 ° C.
- Anställa en 25 bp standardstege för jämförelse och visualisera på en gel kameran. Välj antal cykler som ger den högsta intensitetsband i rätt storlek markör utan oönskade biprodukter.
- Analysera resultaten av cykeloptimering genom att kombinera 10 | il av varje PCR-cykel med 2 | il av 6x Blue / Orange laddningsfärg, och det fylls på i 5 separata brunnar i den 3% agarosgel som framställts i steg 4,4 (125 V under 45 min).
- Utför en storskalig PCR utnyttjar de villkor och lämplig cykelnummer som bestäms i avsnitt 4.5. Normalt 6-8 ml PCR-reaktioner krävdes för att erhålla 1-2,5 nmol används för varje runda i det här valet. Använd 8-stavsrören för att förenklahantering av de många rören som krävs för att alikvot denna volym för PCR-amplifiering.
- Förbered en 3% agarosgel som beskrivs i avsnitt 4.4, och validera att PCR-produkten band visas på rätt plats att följa stegen i avsnitten 4.5.2-4.5.3.
- Konvertera hela dubbelsträngad DNA-produkt från avsnitt 4.7 till enkelsträngat DNA genom stegen som beskrivs nedan:
- Lägg 300 pl streptavidinbelagda pärlor (ej magnetiska) till en liten kolonn blockerad av fritta. Tvätta pärlorna med 5 ml bindningsbuffert genom att fästa en luer-lockspruta och ett lätt tryck på kolven. Ta sprutan ur kolonnen och avlägsna kolven från sprutan off-line efter tillsats av varje material så pärlorna inte störs av kolv aspiration.
- Lägg PCR-produkten och passera den genom kolonnen med hjälp lätt tryck på kolven. Använd flera kolumner så att inte mer än 1-1,2 ml PCR-produkt läggs till varje kolumn. Kasta den slutliga flow igenom eftersom DNA kommer att kvarhållas på kolonnen genom biotindelen på antisenssträngen.
- Tvätta kolonnen med 5 ml bindningsbuffert.
- Dehybridize DNA genom tillsats av 0,5 ml av 0,2 M NaOH. Behåll eluatet eftersom den innehåller enkelsträngat sens-DNA.
- Avsalta ssDNA i 0,2 M NaOH genom tillsats av 0,5 ml till en avsaltningskolonn framställd av en tvätt med nukleasfritt vatten. Kasta den inledande 0,5 ml vätska, tillsätt sedan 1 ml nukleas fritt vatten och samla in denna avsaltat ssDNA prov. Användningen av flera avsaltnings kolumner kommer att krävas för varje 0,5 ml portion.
- Bestäm koncentrationen av DNA elueras genom UV-absorption vid λ = 260 nm.
- Vakuum torka provet och rekonstruera i en lämplig volym av bindningsbuffert. Om det inte fanns tillräckligt DNA erhållet för nästa omgång av valet, upprepa avsnitt 4.6-4.9.2.
5. Efterföljande rundor av Urval och sekvense
- Justera stringensen av villkoren för urval beroende på resultaten av övervakningen anrikning (avsnitt 4.1). Generellt gör villkor strängare i successiva urvalsomgångarna för att välja den högsta affiniteten bindemedel från poolen.
NOTERA: Detta kan innebära en kombination av ökad DNA-koncentrationen, öka antalet, tiden eller volymen av tvättstegen, vilket minskar målkoncentration, ökning av koncentrationen av det negativa urvalet förening, eller en mängd andra metoder 27.- Applicera ordentliga kontroller på lämpligt för att säkerställa specificiteten av sekvenserna för målmolekylen. I detta arbete, tillämpa en negativ selektions molekyl (progesteron) till systemet (tabell 1) med början i omgång 3 och ökar i koncentration i hela urvalet. Från och med omgång 11, pre-inkubera DNA pool för 30 min med 10-20 iM progesteron före immobilisering på pärlorna (före avsnitt 3.7). Öka längden på infångningssökfragmentet efter maximal anrikning observeras.
- Förbered den sista poolen (rund 15) och andra pooler representerar maximalt anrikad (rund 13) och minimalt berikade (rund 6) Villkoren för sekvensering genom PCR-amplifiering med kompatibla primers och en hifi-polymeras.
- Sätt upp en 50 ul reaktionsvolym med hjälp slutliga koncentrationer av 1x (reaktionsbuffert), 200 ^ M (varje dNTP), 400 Nm (varje primer), 0.5 pl DNA pool och 0,5 pl polymeras. Cykel optimera för varje runda att använda stegen i avsnitt 4.5 med användning av samma PCR villkor med undantag för en 7 min tag vid 72 ° C för den slutliga förlängningen.
- Skicka 50 pl av de förberedda pooler att en sekvense anläggning i mikrocentrifugrör med lock ordentligt tätade med icke-vidhäftande wrap. Placera rören i en 15 ml koniska rör packad med bubbelplast och fartyg O / N med is förpackningar till sekvense anläggning.
- Bestäm antalet kopior av varje sekvens för att bedöma anrikning av den sekvenserade poolen (er).
- Använd code-skrivande / sortering steg (Se Tilläggskodex File) för nästa generations sekvense data i FASTA format för att bestämma frekvens / kopieringsnummer varje sekvens upprepas i data för alla pooler levereras av sekvense anläggningen:
- Analysera specificiteten och affiniteten hos de högsta kopietal sekvenser. Den typ av interaktion (protein eller liten molekyl), strukturella egenskaper hos aptamer vid bindning, och förväntade affinitet avgör vilken metod är lämplig. Det här ämnet granskas närmare i ett antal referenser 1,28-30.
6. AuNP Syntes och Detection
- Syntetisera AuNPs använder citratet reduktionsmetoden 21. Blanda 98 ml Millipore vatten med 2 ml 50 mM HAuCl 4 och värm till kokning.
- Tillsätt 10 ml 38,8 mM natriumcitrat somsnart som reflux börjar. Färg kommer att ändras till en röd färg efter flera minuter. Fortsätt omröring av lösningen under 20 min med värmen bort.
- Låt AuNP lösningen svalna till RT sedan filtrera genom ett 0,2 pm polyestermembran. Förvara alla AuNP suspensioner i en mörk bärnstensfärgad flaska.
- Beräkna AuNP koncentrationen genom UV-absorption, med användning av extinktionskoefficienten för 2,4 x 10 8 L mol -1 cm -1 31. Koncentrationen var 10 nM i detta arbete, med en storlek på 17 ± 0,6 nm bestäms av dynamisk ljusspridning 21.
- Inkubera DNA med 10 nM AuNP under 1 h vid omgivningsbetingelser skyddas av aluminiumfolie. Variera volymen AuNP att ge tillräckligt lösning att låta alla önskade tester som ska utföras (~ 1-2 ml). Beläggningsgrad på 73, 120 och 200 D / NP (DNA-molekyler per AuNP) undersöktes i detta arbete, och volymen och koncentrationerna varierar därefter.
- Späd DNA / AuNP lösning 1: 1 med användning av HEPES-buffert (20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH = 7,4). Låt blandningen anta jämvikt vid RT täckt av aluminiumfolie.
OBS: Den tid som krävs för detta steg kommer att behöva optimeras av forskaren. I detta arbete, tider som sträcker sig från flera minuter till O / N undersöktes. - Förbered analyt (kortisol, cholsyra, 2-metoxinaftalen) stamlösningar vid 100 mM i DMSO och täck med aluminiumfolie. Gör färska initiala lösningar före varje experiment genom utspädning av aktie till 100 iM i en 1/3 utspädning av kortisol bindningsbuffert (avsnitt 2.1). Ytterligare späd den ursprungliga lösningen med 1/3 bindningsbuffert så att en konstant volym (10 pl) av målet tillsättes för att generera ett intervall av koncentrationer.
- Optimera saltkoncentrationen som krävs genom att tillsätta 80 pl av DNA / AuNP lösning med 10 | il 1/3 bindningsbuffert (kallad "blank").
- Inkubera under 20 min vid RT tillsätt sedan olika volymer av NaCl lösnjon. Leta efter volymen av salt som inducerar en knappt visuellt märkbar förändring mot en blå nyans efter salttillsats (13-40 pl av 1 M NaCl används i detta arbete). Detta ger en bra utgångspunkt, men kan behöva ytterligare justering efter resultater med målet tillsats.
- Kombinera 80 pl av DNA / AuNP lösning med 10 ul av mål-lösning och inkubera under 20 min vid RT. Utnyttja en 96-brunnar och flerkanalspipett att analysera flera målkoncentrationer samtidigt, alltid inklusive en blank (avsnitt 6.8).
- Tillsätt en lämplig volym av NaCl-lösning (13 pl av 1 M NaCl applicerades i detta arbete) och omedelbart analysera absorbansen vid 650 och 530 nm med användning av en plattläsare.
- Plotta resultaten som förhållandet av absorbansvärden (E 650 / E 530) som funktion av målkoncentration normaliserad i förhållande till tom mätning.
Representative Results
Den stringens av villkoren ursprungligen hållas låg för att behålla bindemedel närvarande i låga kopieantal i de första omgångarna. Den första omgången, i synnerhet, genomfört lägst stringens att bevara bindemedel vanligtvis presenteras som unika sekvenser, visas av den höga kortisol och DNA-koncentrationer, och bristen på negativa selektionssteg. Framgången för denna aptamer urval framgår av utvecklingen av pooler från en låg procentsats elueras genom målet (omgång 2) till en högre fraktion elueras genom målet som förblir relativt konstant i omgångar 12-13 (Tabell 1). Denna platå av DNA elueras genom målet är traditionellt en slutpunkt i valet ("berikning"). Emellertid, denna metod höjas ytterligare stringensen av markeringen efter anrikning genom att öka längden av cDNA infångningsproben (Figur 1). Förlängning denna sond ökar styrkan hos hybridiseringen mellan CDNA och poolen, öka smälttemperaturen (Tm) av komplexet, och som kräver en starkare interaktion mellan målet och sekvens för att frigöra de bindande sekvenserna i lösning. Den inledande omgången av valet genomfört en svagare cDNA interaktion på grund av en mindre G bas på 5'änden av biblioteket. Detta är i linje med de generellt lägre stringens i den första omgången, och förväntas inte väsentligt påverka annat än valet genom att tillåta fler potentiella bindemedel samt bakgrundssekvenser (dehybridize baserade på termodynamik) för att gå vidare till nästa urvalsomgång. Dessa bakgrundssekvenser minimerades eftersom urvalet fortsatte mot anrikning genom att genomföra högre stringens i efterföljande urvalsomgångarna. När cDNA utsträcktes från en 7-mer till en 8-mer i omgång 14, är den procentuella andelen av DNA som eluerades genom målet minskas från 15,3% till 11,1% för en Tm ökade från 19,2 ° C till 26,7 ° C. CDNA wytterligare förlängts till 9-mer i omgång 15 med en Tm av 31,3 ° C, släppa den totala elueras till 3,3%.
Ytterligare information om anrikning kan erhållas genom sekvense flera pooler, både berikat och icke-anrikade exempel, för att spåra utvecklingen av pooler i varje omgång. Nästa generations sekvense (NGS) har vuxit fram som en kraftfull metod för sekvense i urvalet, främst eftersom högre sekvens läser (totalt antal sekvenser rapporterade) erhålls jämfört med Sanger-sekvensering. Dessa högre sekvens läser innebär en större täckning av det totala antalet sekvenser i poolen, vilket ger en mer fullständig bild av den mångfald av sekvenser. NGS avlägsnar även kloning partiskhet 32, och möjliggör sekvensering av flera pooler i en enda sats med tillägg av streckkoder 24,33. NGS användes för att analysera utvecklingen av anrikning från tre separata pooler i denna urvals (Figur 2). Poolerfrån varv 6 (svag anrikning jämfört med runda 2 med% elueras), rund 13 (högsta anrikning), och runda 15 (högsta stringens) valdes som representativa punkter i urvalet. De kopietal av varje unik sekvens plottades som procentandel av det totala antalet sekvens läser för varje pool. Den topprankade (högsta antal kopior) sekvens endast utgjorde 0,1% av alla sekvenser i omgång 6 (33.435 totalt sekvenser, 22.463 unika sekvenser). Eftersom poolen blir maximalt anrikas i omgång 13, till de bästa rankade sekvensökningar omfattar 15,4% av hela poolen (17.681 totalt sekvenser, 2987 unika sekvenser), 150x större än i omgång 6 trots endast en ~ 5x ökning anrikning observerats av UV . Runda 15 (28.919 totalt sekvens läser, 2980 unika sekvenser) hoppade till 44,9% av alla sekvenser som representeras av den enda topprankade sekvens trots övervaknings UV anrikning visade att mängden elueras genom målet var ~ 5x lägre än för runda 13 ( Tabell 1
15-1 GGAATGGATCCACATCCATGGATGGGCAATGCGGGGTGGAGAATGGTTGCCGCACTTCGGCTT
CACTGCAGACTTGACGAAGCTT
15-3 GGAATGGATCCACATCCATGGGAGGGTTGGAAGGGAGGGGCCCGGGGTGGGCCATCGTTCGTT
CACTGCAGACTTGACGAAGCTT
Tidigare studier undersöktes bindningen av dessa båda sekvenser genom mikroskalig thermophoresis och jämviktsdialys 24. Resultaten visade signifikant kortisol bindande för sekvens 15-1 (Kd = 6,9 ± 2,8 iM genom jämviktsdialys, 16,177; 0.6 iM av mikro thermophoresis) medan minimal bindning observerades mellan kortisol och sekvens 15-3. Detta visar att den ökade längden på infångningssökfragmentet i omgång 15 hjälp i att ge högre stringens att tolka ut högre affinitet bindemedel. Dessutom varken sekvensen visade observerbar bindning till den negativa selektionsmolekylen, progesteron, som visar att tillsats av de negativa selektionssteg var fördelaktigt för förfarandet.
Det faktum att en högre affinitet bindemedel framkom efter maximal vinst (bestäms av den traditionella metoden för att analysera andelen DNA elueras genom målet) efter förhöjda stringens tillämpades i ytterligare omgångar av urvals validerar metoden för att förlänga längden av cDNA capture sond efter anrikning. Detta resultat visar att kopiera nummer från en sekvens pool och affinitet för målet får endast associeras under vissa förhållanden 24,34, i konmotsats med föregående rapport innebär en direkt korrelation 35. Det belyser också fördelen av övervakning anrikning av NGS, snarare än enbart av% elueras strategin vanligt i de flesta val, som kan variera naturligt från en runda till nästa eftersom högre stringens tillämpas. Dock är användbart för övervakning anrikning% elueras när liknande villkor gäller över flera omgångar. Till exempel, rundar 6-10 alla inblandade liknande förhållanden, utan någon signifikant förändring i anrikning (tabell 1). När detta observeras under flera omgångar, villkoren är sannolikt alltför stränga för att främja anrikning, och forskaren ska minska stringens i nästa omgång. Till exempel var det kortisol koncentrationen ökat från 35 ^ M till 100 nm i omgångarna 11-13, och% eluerades ökade från 2,5% i omgång 10-14,5% i omgång 12. Därför% eluerat kan fungera som en guide för att justera stringens under ett urval när similar villkor jämförs från omgång till omgång, och kan ge kompletterande information till NGS för att bestämma en urvals slutpunkt.
Sekvens 15-1 applicerades på en AuNP analys för att bestämma om en sekvens vald på ett sätt för att framställa en struktur-omkopplings aptamer skulle fungera i en analys som bygger på en strukturell förändring efter målbindning för att producera ett svar. Tidigare initiala studier visade att AuNP analysen med 15-1 svarade på stress biomarkör kortisol, men inte till två andra markörer för stress, epinefrin och norepinefrin, eller cholsyra, att en markör av leversjukdom strukturellt liknande kortisol 24. Responsen observerades i det normala intervallet för fritt kortisol rapporterades i humant serum (~ 150-600 nM) 6, validera att aptamer ut för en strukturell förändring på kortisol bindning ger ett svar i AuNP analysen. I denna nuvarande arbete, var karakterisering av systemet tagit ett steg längre genom att justeratäckningen (densitet) av 15-1 på AuNP ytan. Med samma uppsättning villkor, DNA täckningen ökat från 73 D / NP (DNA-molekyler / AuNP), till 120 D / NP och 200 D / NP (Figur 3). Cholsyra producerade en minimal respons, med undantag av 10 ^ M vid 200 D / NP. Svaret från analysen minskat eftersom täckningen ökades liksom detektionsgränser (LOD). LOD var 29,5 nM för 73 D / NP, 145,2 nM för 120 D / NP, och 27,3 ^ M för 200 D / NP. Detta resultat överensstämmer med arbetet i Smith et al., Som illustrerade att svaret från en AuNP analys utnyttjar kokain aptamer minskade när aptamer täckningen ökades från 60 D / NP till 300 D / NP 36. Detta innebär att detektionsområdet för målet av intresse kan justeras baserat på att optimera DNA yttäckning i AuNP analysen. Detta kan vara till nytta när man jämför till exempel utbudet av fritt kortisol i humant serum (~ 150-600 nM) kontra mänsklig saliv (~ 5-25 nM) <sup> 6,37. Även fysiologiska vätskor är mycket mer komplex än så buffert analys, resultaten ger en förlängning på proof-of-principle arbete visar att AuNP villkor kan justeras beroende på tillämpning, och att det fortsatta arbetet mot bredda medellång till biologiska vätskor skulle vara av intresse för biosensor samfundet.
Figur 1. Översikt över strukturen växling urvalsmetod. En liten biotinylerad cDNA infångningssökfragmentet immobiliseras på streptavidinbelagda magnetiska kulor. CDNA är komplementär till 5'-regionen av biblioteket, hybridisering av biblioteket till pärlorna. När mål sättes, är en konformationsförändring inducerad att frigöra bindande sekvenser från pärlan, vilket möjliggör uppdelning underlättas genom att applicera en magnet. Supernatanten kvarhålles för att övervaka anrikning (% DNA eluerades genom the mål) med UV efter dialys målet från DNA. Detta steg är endast nödvändigt om målmolekylen absorberar i samma UV-området som DNA. Sekvenser sedan PCR amplifieras och förberedda för nästa omgång av valet. Som valet fortskrider, är negativ selektering tillämpas, där sekvenserna elueras genom den negativa selektionsmolekylen kasseras, och pärlorna med potentiella mål-bindemedel inkuberas därefter med målet. Längden av cDNA proben ökas efter maximal anrikning (% elueras) för att öka stringensen i valet. Denna siffra har återges med tillstånd från 24. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Runda | [Kortisol] (pM) | [Progesteron] (pM) | Bunden DNA (pmol) | % Eluerat av Target | cDNA Längd |
| 1 | 100 | 0 | 357,57 | N / A | 7-mer |
| 2 | 50 | 0 | 145,49 | 1,4 | 7-mer |
| 3 | 50 | 1 | 188,74 | N / A | 7-mer |
| 4 | 50 | 5 | 336,4 | 2,3 | 7-mer |
| 5 | 35 | 5 | 88,05 | N / A | 7-mer |
| 6 | 35 | 10 | 303,89 | 3,1 | 7-mer |
| 7 | 35 | 10 | 255,01 | N / A | 7-mer |
| 8 | 35 | 10 | 236,81 | <td> 2.17-mer | |
| 9 | 35 | 10 | 318,95 | 2,6 | 7-mer |
| 10 | 35 | 10 | 297,18 | 2,5 | 7-mer |
| 11 | 100 | 10 | 147,61 | N / A | 7-mer |
| 12 | 100 | 10 | 154,36 | 14,5 | 7-mer |
| 13 | 100 | 10 | 150,39 | 15,3 | 7-mer |
| 14 | 75 | 20 | 247,71 | 11,1 | 8-mer |
| 15 | 50 | 40 | 409,63 | 3,3 | 9-mer |
Tabell 1. Urval progression och anrikning av% eluering 24 < strong>. N / A (Ej tillämpligt) redovisas för rundor där övervakningen dialys / UV anrikning inte utfördes i tidiga urvalsomgångarna för att mildra förlusten av låg kopierings talföljder. Denna tabell har återges med tillstånd från 24.
Figur 2. Val anrikning bestäms av nästa generations sekvensering (A) Round 6. (B) Round 13; (C) Runda 15. Sekvenser rangordnades enligt antalet exemplar. Det högsta kopietalet sekvens ökade från utgöra en liten andel av hela den sekvenserade poolen i omgång 6 (0,1%) till en hög procentandel i omgång 15 (44,9%) som poolen anrikades för kortisolbindningssekvenser. Denna siffra har återges med tillstånd från 24.et = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. AuNP testsvaret från varierande aptameren 15-1 täckning. Densiteten för aptameren inkuberas med AuNPs ökades från 73 D / NP (röd triangel), till 120 D / NP (grön fyrkant) och 200 D / NP ( blå cirkel). Kortisol svar är djärva färger, är cholsyra respons i ljusa färger. Analyssvaret förbättras med avseende på kortisol vid lägre densiteter, vilket sänker LOD och intervallet målet kan detekteras inom. Villkoren med högst kortisolsvaret (73 D / NP) karakteriserades ytterligare i det linjära området för att ge fler poäng inom det förväntade normala intervallet för fritt kortisol rapporterades i humant serum (~ 150-500 nM) och saliv (5-25 nM ) 6,37. Den minimala respons cholsyra tillämpa samma 73 D / NP villkor har varasv beskrivs i tidigare arbete 24. Samtliga tomter representerar medelvärdet ± SEM för dubbel eller tredubbel mätningar.
. Figur 4. Representativa resultat från PCR-cykel optimering från vänster till höger brunnarna representerar: 4 cykler, 6 cykler, åtta cykler, 10 cykler, 12 cykler, negativ (inget DNA mall), 25 bp DNA stege standard. Optimala förhållanden iakttas vid 8 cykler, där enda produkt bandet är på hög intensitet utan över-förstärkning produkterna som finns vid högre cykler.
Figur 5. AuNP analys inkubationstid optimering. Inkubationstiden för AuNP / DNA steg vid 73 D / NP minskades från O / N (fig 3) till 30 minuter, och målet incubation följdes omedelbart av salttillsats i stället för efter 20 minuter (figur 3). (A) Ett svar observeras för kortisol (blå diamanter) men inte för cholsyra (gröna cirklar) eller 2MNP (2-metoxinaftalen, röda fyrkanter). Samtliga tomter representerar medelvärdet ± SEM för dubbel eller tredubbel mätningar. (B) Från vänster till höger: tomt, 10 ^ M kortisol, 10 iM cholsyra, 10 iM 2MNP. Visuell förändring kan observeras med blotta ögat för kortisol. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Det faktum att små molekyler är av biologiskt intresse, utan bara utgör 19% av alla aptamers rapporterade gör metoder som utformats för att välja aptamers som är tillämpliga på små molekyler av stor betydelse. SELEX av små molekyler är särskilt utmanande eftersom färre funktionella grupper, strukturella motiv, och yta är tillgängliga för interaktion med sekvenser jämfört med proteiner en, och det har uppskattats att mindre än 30% av markeringar för alla mål försök har resulterat i en aptamer 38. Därför måste man vara extremt medveten om experimentell design och utförande för att framgångsrikt välja en aptamer till en liten molekyl mål.
Den aptamer urvalsmetod som beskrivs i detta arbete är fördelaktig eftersom den är tillämplig på små molekyler utan att kräva någon kemisk modifikation som kan förändra deras bindningsegenskaper. Det är också eluering baserad, vilket innebär att eftersom tHan DNA, snarare än målet, initialt binds därefter elueras från de magnetiska pärlor efter målet, DNA interagera med pärlan matrisen kommer inte att förstärkas för nästa omgång av valet eftersom bindemedel till molekylen av intresse släpps ut i den överstående bufferten och ospecifika matris bindemedel förblir bundet. Omvänt är en negativ-selektionsmetod mot matrisen krävs för metoder som immobilisera målet till den fasta bäraren varje runda grund av att DNA som interagerar med matrisen kommer att amplifieras i sidan av det mål bindemedel 1. Den nuvarande metoden var utformad som en Tm begränsat urval strategi. Detta innebär att Tm av cDNA / pool hybridisering hölls nära till RT. Morse använde en liknande strategi, men tillämpat en 6-mer-cDNA-sond med en Tm <10 ° C med selektionsbetingelser vid 4 ° C 17. Vår ansökan var för en biosensing analys utförd vid RT, så längden av cDNA justeras enligtly. Detta håller stringens av markeringen så låg att potentiella bindemedel inte går förlorade på grund av att målet bindande interaktionen sker i en avlägsen plats som inte inducerar en konformationsförändring som kan störa cDNA bindande. Emellertid är partitione effektiviteten för den föreslagna metoden låg eftersom vissa sekvenser kommer dehybridize enbart baserat på termodynamik. Däremot Nutiu et al. Tillämpat en 15-mer-cDNA, och kunde bara identifiera aptamerer för två av de fyra målen, möjligen på grund av att Tm av 15-mer var för hög för att en frigivning av en liten molekyl mål 18. Därför, medan den aktuella markeringen strategin kommer att kräva många rundor för att ta bort bakgrundssekvenser, genom att kontrollera stringens av markeringen och minimera förlusten av potentiella bindemedel sannolikheten för framgång kommer att höjas.
Många forskare nya till aptamer urval är omedvetna om viktiga aspekter av PCR avpotentiella bindemedel. Cycle optimering (avsnitt 4.5) är nödvändig eftersom över förstärkning av DNA-bibliotek ger oönskade biprodukter (typiskt större i storlek) vid höga cykelnummer, och den önskade produkten kan helt försvinna med ett överskott på endast 5 cykler 39. I fallet med överförstärkning, PCR-produkterna inte längre representerar de sekvenser elueras av målet, och chanserna att urvals lyckas avsevärt minskat. Figur 4 visar ett exempel på cykeloptimering från omgång 5 i detta arbete. Den lägsta cykeln ger en minimal produktband, bandet ökar i mängd genom åtta cykler; vid 10 cykler bandet börjar en övergång till en högre storlek över amplifieringsprodukt, och är nästan helt består av över förstärkta produkten inom 12 cykler. En annan detalj som många forskare oerfaren i SELEX kan förbise är att hela poolen måste förstärkas i stor skala PCR-amplifiering (avsnitt 4.6) i granst runda för att mildra förlusten av bindemedel. Antalet unika sekvenser möjliga från oligonukleotider är 4 N, där 4 betecknar de fyra nukleinsyrabaser, och N är antalet baser i den slumpmässiga regionen av biblioteket. För detta arbete, N = 40, vilket resulterar i en sekvenser utrymme av 1,2 x 10 24 möjliga unika sekvenser. Den 2,5 nmol av bibliotek som används i den första selektionsomgången motsvarar ~ 10 15 molekyler, innebärande att varje kopia av DNA sannolikt representerat i den initiala poolen som en unik sekvens. Därför måste hela volymen av DNA elueras från pärlorna av målet amplifieras att behålla en kopia av varje potentiell bindemedel för nästa omgång av valet. När denna initiala förstärkning har skett, flera kopior kan väljas i följande rundor där en homogen lösning förutsätts för provtagning.
Koncentrationen av målet bör också övervägas noga i varje omgång. Nutiu et al., Användningda koncentration av 1 mM mål under hela urvalsprocessen, och valt en ATP aptamer med Kd = 600 iM 18. Både den nuvarande arbetet och forskningen av Morse 17 började med 100 iM målet, minskar under hela urvalet, och resulterade i aptamers med låga mikromolära tillhörighet. Exakt vilka runt stringens bör ökas (lägre målkoncentration) beror på när anrikning observeras. En annan kritisk steg är att tillämpa lämpliga negativa selektionssteg så aptamers demonstrerar specificitet till målmolekylen. Vilka kontroller används är avhängigt den avsedda tillämpningen av den valda aptamer. Till exempel var aptamer 15-1 avsedda att fungera som ett igenkänningselement i en biosensing analys för kortisol, så progesteron användes som en negativ selektions molekyl eftersom det är en metabolisk prekursor till kortisol som påträffas i fysiologiska fluider 40. ATP aptamer utvalda av Nutiu et al. </ Em> inte innehöll ett negativt urval steg, och samverkar med strukturellt liknande molekyler inklusive ADP, AMP, adenosin, och dATP 18.
En sista anmärkning för övervägande är att AuNP analys kräver ofta betydande optimering för varje aptamer / target paret. Letar du efter den volym av salt som inducerar en knappt visuellt märkbar förändring mot en blå nyans efter salt tillägg är en bra utgångspunkt, men justering av startpunkten kan krävas för att följa ett svar. Vi har också funnit att analysen ger drastiskt olika svar beroende på buffertkoncentration (buffert val kan kräva späd eftersom den höga saltkoncentrationen buffertar ofta orsakar aggregering) och sammansättning, grad av DNA-täckning (Figur 3), provberedning (vissa organiska lösningsmedel som används för upplösning av mål kan orsaka en hög bakgrund som masker rikta respons), temperatur, salt typ och koncentration, och incubationstiden (både DNA med AuNP och DNA / AuNP med målet). Under fullt optimerade förhållanden erhålls typiskt observeras med ett mål inkubationstid <5 min, vilket visar fördelen av en snabb målsvaret av AuNP biosensing plattformen. Till exempel i figur 5 inkuberingstiden av aptamer / AuNP steg minskades från O / N (fig 3) till 30 minuter, och salt tillsattes omedelbart (<10 sek) efter mål tillägg snarare än 20 min senare (figur 3 ) vid en laddningsdensitet av 73 D / NP. Detta ökade kortisolsvaret till ~ 82% högre än den tomma (Figur 5A) vid 10 ^ M målkoncentration kontra ~ 40% med hjälp av de tidigare förhållandena (Figur 3). Denna reaktion kan urskiljas med blotta ögat (figur 5B). Notera att det linjära området för kortisol detektering är annorlunda än att använda de tidigare betingelser, vilket tyder på att dessa villkor kan optimeras för en önskaddetekteringsområde. Cholsyra och 2-metoxinaftalen (2MNP) kontroller gav inte en signifikant respons (figur 5A-B). Forskare måste vara medvetna om att minska dessa inkubationstider kan underlätta ökad respons av analyter med AuNP ytan, vilket kan bidra till övergripande förstärkt signal (mål) eller bakgrund (icke-målmolekyler). Därför är det nödvändigt med noggrann AuNP analys design och prestanda karakterisering för varje aptamer / target paret.
Detta förfarande beskriver ett protokoll för att välja småmolekylära strukturmodifierande omkopplings aptamerer som fungerar i ett biosensing plattform såsom den beskrivna AuNP analysen, som kräver en konformationsförändring av DNA för att detektera närvaro av målet. Dock skulle denna metod kunna tillämpas på andra biosensorsystem såsom elektrokemisk eller fluorescens som fungerar på samma premiss för praktiskt taget alla storlekar målet. Kraften i protokollet kan vidareutvecklas experimentellt genomflera tillvägagångssätt. Först, kan uttagnings själv vara potentiellt förbättras genom att undersöka metoder för optimering såsom bestämning av ideala Tm av cDNA / bibliotek hybridisering som ger en interaktion som är tillräckligt svag för att interagera med en liten molekyl mål, men ändå tillräckligt starka för att minska mängden av bakgrundssekvenser dehybridiserad enbart från termodynamiken. Detta kommer att kondensera det antal cykler som krävs för selektion, vilket sparar tid i arbetskraft och minska reagensförbrukning. Fortsatta undersökningar om modifieringar av val skulle vara att fastställa de mest gynnsamma koncentrationer av pärlor och DNA, så att en mångfaldig population av sekvenser exponeras för målet, speciellt i den initiala omgången. Framgången för dessa proof-of-principle experiment ger en grund för att satsa ytterligare resurser att optimera och anpassa AuNP buffert analys för fysiologiska vätskor. Det finns ett legitimt behov av en snabb, robust biosensing plattform som kan funktion som ett diagnostiskt verktyg för fysiologiska tillstånd hos en individ, och vidareutveckling av AuNP analysen i humant serum, skulle svett eller saliv träffa en denna nuvarande klyftan.
Disclosures
Distribution Uttalande A: Godkänd för offentliggörande; distributionen är obegränsad (88 ABW-2014-4103). Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynabeads M280 Streptavidin | Invitrogen | 112.06D | Compatible with DynaMag-2 Magnet |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | Compatible with Dynabeads M280 Streptavidin |
| Streptavidin Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-5113-01 | This is a high density streptavidin product for ssDNA preparation |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | ≥98% |
| Progesterone | Sigma | P0130 | ≥99% |
| Cholic Acid | Sigma | C1129 | ≥98% |
| NanoDrop ND-1000 | NanoDrop | ND-1000 | Replaced by ND-2000 model |
| Tris Base | Promega | H5135 | ≥99.9% |
| Sodium Chloride | Sigma | S9888 | ≥99.5% |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fluka | 63068 | ≥98% |
| 500 ml Filter System | Corning | 430769 | 0.22 µm cellulose acetate membrane |
| DNA Library | Operon | Custom | HPLC purified |
| All other DNA | IDT | Custom | Capture probes and primers — desalted; Aptamers — HPLC |
| Thermomixer | Eppendorf | R | Any model with temperature and mixing speed control will work |
| PfuUltra II Fusion HotStart DNA Polymerase, 400 rxn | Agilent | 600674 | Taq polymerase can be used as well |
| Deoxynucleotide Mix, PCR-Grade | Agilent | 200415 | Other brands will work here |
| 10x Cloned Pfu DNA Polymerase Buffer | Agilent | 200532 | This buffer was optimized for PfuUltra II polymerase |
| GeneAmp PCR System | Applied Biosystems | 9700 | Any model that allows researcher to open lid for cycle optimization will work |
| Agarose-LE | Ambion | AM9040 | ≥99.9% |
| Ethidium Bromide | Sigma | E-1510 | Acute toxicity, inhalation; suspected carcinogen |
| Empty Synthesis Columns, 1 µm Expedite Style | Glen Research | 20-0021-01 | This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with syringe |
| Replacement Filters Expedite | Glen Research | 20-0021-0F | 1 µm size |
| Illustra NAP-25 Columns | GE Healthcare | 17-0852-01 | Any brand with DNA grade resin gel filtration column will work |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette | ThermoFisher Scientific | 66205 | 2k MWCO used |
| Gold(III) chloride hydrate | Sigma | 254169 | 99.999% purity is important |
| Sodium Citrate Dihydrate | SAFC | W302600 | We have found that the compound produced from different manufacturers greatly affects AuNP assays |
| SpectraMax | Molecular Devices | M5 | Results were similar to Bio-TEK system |
| Synergy | Bio-TEK | HT | Results were similar to Molecular Devices system |
| HEPES Buffer | Amresco | J848 | Any brand that makes a sterilized product will work |
| 250 ml Filter System | Corning | 430767 | 0.22 µm cellulose acetate membrane |
| UV Spectrophophotometer | Varian | Cary 300 | Other brands will work here |
| 5 ml Syringe | Becton-Dickinson | 309646 | This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with Expedite column |
| ThermoEC Minicell Primo | ThermoFisher Scientific | EC320 | Compatible with Power Supply |
| Power Supply | Fisher Scientific | FB300 | Compatible with ThermoEC Minicell Primo |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | Flammable liquid |
| 2-Methoxynaphthalene | Sigma | 148245 | 99% |
| Assay Plate | Corning | 3370 | 96-well Flat Bottom, Sterile |
References
- McKeague, M., DeRosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. J. Nucleic Acids. 2012, 1-20 (2012).
- Gatti, R., Antonelli, G., Prearo, M., Spinella, P., Cappellin, E., De Palo, E. F. Cortisol assays and diagnostic laboratory procedures in human biological fluids. Clin. Biochem. 42, 1205-1217 (2009).
- Morgan, C. A., Wang, S., Rasmusson, A., Hazlett, G., Anderson, G., Charney, D. S. Relationship among plasma cortisol, catecholamines, neuropeptide Y, and human performance during exposure to uncontrollable stress. Psychosom. Med. 63 (3), 412-422 (2001).
- Michael, D. J., Valle, B., Cox, J., Lalns, J. E., Fogt, D. L. Salivary Biomarkers of Physical Fatigue as Markers of Sleep Deprivation. J. Clin. Sleep Med. 9 (12), 1325-1331 (2013).
- Kwak, J., et al. Volatile biomarkers from human melanoma cells. J. Chrom. B. 931, 90-96 (2013).
- Stevens, R. C., Soelberg, S. D., Near, S., Furlong, C. E. Detection of Cortisol in Saliva with a Flow-Filtered, Portable Surface Plasmon Resonance Biosensor System. Anal. Chem. 80 (17), 6747-6751 (2008).
- Arya, S. K., Ghornokur, G., Venugopal, M., Bhansali, S. Antibody functionalized interdigitated μ-electrode (IDμE) based impedimetric cortisol biosensor. Analyst. 135 (8), 1941-1946 (2010).
- Kapczinski, F., et al. Allostatic load in bipolar disorder: Implications for pathophysiology and treatment. Neurosci. Biobehav. Rev. 32 (4), 675-692 (2008).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Ciesiolka, J., Gorski, J., Yarus, M. Selection of an RNA domain that binds Zn2. RNA. 1 (5), 538-550 (1995).
- Liu, J., et al. Selection of Aptamers Specific for Adipose Tissue. PlosOne. 7, e37789 (2012).
- McCauley, T. G., Hamaguchi, N., Stanton, M. Aptamer-based biosensor arrays for detection and quantification of biological macromolecules. Anal. Biochem. 319 (2), 244-250 (2003).
- Huang, L., et al. A label-free electrochemical biosensor based on a DNA aptamer against codeine. Anal. Chim. Acta. 787, 203-210 (2013).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX—A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomol. Eng. 24 (4), 381-403 (2007).
- Jayasena, S. D. Aptamers: An Emerging Class of Molecules That Rival Antibodies in Diagnostics. Clin Chem. 45 (9), 1628-1650 (1999).
- Morse, D. P. Direct selection of RNA beacon aptamers. Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 94-101 (2007).
- Nutiu, R., Li, Y.
- Luo, F., Zheng, L., Chen, S., Cai, Q., Lin, Z., Qiu, B., Chen, G. An aptamer-based fluorescence biosensor for multiplex detection using unmodified gold nanoparticles Chem. Commun. 48 (51), 6387-6389 (2012).
- Li, H., Rothberg, L. J. Label-Free Colorimetric Detection of Specific Sequences in Genomic DNA Amplified by the Polymerase Chain Reaction. J. Am. Chem. Soc. 126 (35), 10958-10961 (2004).
- Chávez, J. L., MacCuspie, R. I., Stone, M. O., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer–gold nanoparticle conjugates: effect of aptamer length on response. J. Nanopart. Res. 14 (9), 1166-1177 (2012).
- Hagen, J. A., et al. Biofunctionalized Zinc Oxide Field Effect Transistors for Selective Sensing of Riboflavin with Current Modulation. Sensors. 11 (7), 6645-6655 (2011).
- Han, K., Liang, Z., Zhou, N. Design Strategies for Aptamer-Based Biosensors. Sensors. 10 (5), 4541-4557 (2010).
- Martin, J. A., Chávez, J. L., Chushak, Y., Chapleau, R. R., Hagen, J., Kelley-Loughnane, N. Tunable stringency aptamer selection and gold nanoparticle assay for detection of cortisol. Anal. Bioanal. Chem. 406 (19), 4637-4647 (2014).
- Hall, B., et al. Synthesis, and Amplification of DNA Pools for In Vitro Selection. Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem. 39, 9.2.1-9.2.28 (2009).
- Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O’Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nat. Protoc. 5 (6), 1169-1185 (2010).
- Djordjevic, M. SELEX experiments: New prospects, applications and data analysis in inferring regulatory pathways. Biomol. Eng. 24 (2), 179-189 (2007).
- Thomas, J. R., Hergenrother, P. J. Targeting RNA with Small Molecules. Chem. Rev. 108 (4), 1171-1224 (2008).
- Jing, M., Boswer, M. T. A Review of Methods for Measuring Aptamer-Protein Equilibria. Anal. Chim. Acta. 686 (1-2), 9-12 (2011).
- Sachs, E. -F., Diederichsen, U. Binding of Triostin Analogues to DNA. , AN NT008. (2011).
- Liu, J., Lu, Y. Preparation of aptamer-linked gold nanoparticle purple aggregates for colorimetric sensing of analytes. Nat. Protoc. 1 (1), 246-252 (2006).
- Cho, M., et al. Quantitative selection of DNA aptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (35), 15373-15378 (2010).
- Martin, J. A., et al. Selection of an Aptamer Antidote to the Anticoagulant Drug Bivalirudin. Plos One. 8 (3), e57341 (2013).
- Schütze, T., et al. Probing the SELEX Process with Next-Generation Sequencing. Plos One. 6 (12), e29604 (2011).
- Kupakuwana, G. V., Crill, J. E., McPike, M. P., Borer, P. N. Acyclic identification of aptamers for human alpha-thrombin using over-represented libraries and deep sequencing. Plos One. 6 (5), (2011).
- Smith, J. E., Griffin, D. K., Leny, J. K., Hagen, J. A., Chávez, J. L., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates coupled to an android-based color analysis application for use in the field. Talanta. 121, 247-255 (2014).
- Chatterton Jr, R. T., Vogelsong, K. M., Lu, Y. -C., Hudgens, G. A. Hormonal Responses to Psychological Stress in Men Preparing for Skydiving. J. Clin. Endocrinol. Metab. 82 (8), 2503-2509 (1997).
- Gold, L., et al. Aptamer-Based Multiplexed Proteomic Technology for Biomarker Discovery. Plos One. 5 (12), (2010).
- Musheev, M. U., Krylov, S. N. Selection of aptamers by systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Addressing the polymerase chain reaction issue. Anal. Chim. Acta. 564 (1), 91-96 (2006).
- Wiebe, J. P.
