المناعية وصفها متعددة مع الأجسام المضادة من نوع المضيف نفسه لدراسة الكبار الحصين تكوين الخلايا العصبية
Summary
This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.
Abstract
تكوين الخلايا العصبية الكبار هو عملية متعددة المراحل ينظم للغاية التي يتم إنشاؤها خلايا عصبية جديدة من الخلايا الجذعية العصبية تفعيلها عبر ملتزمة بشكل متزايد فرعية السلف وسيطة. كل من هذه الأنواع الفرعية عن مجموعة من الواسمات الجزيئية محددة، جنبا إلى جنب مع معايير شكلية محددة، ويمكن استخدامها للتعرف عليها. عادة، يتم تطبيق تقنيات مناعي التي تنطوي على الأجسام المضادة نوع فرعي معين في تركيبة مع علامات exo- أو الذاتية انتشار الأسلحة النووية. وصفنا هنا immunolabeling طرق للكشف النوعي والكمي لجميع مراحل تكوين الخلايا العصبية الحصين الكبار. تضم هذه تطبيق النظير ثيميدين، نضح transcardial، معالجة الأنسجة واسترجاعها حاتمة الناجم عن الحرارة، ABC المناعية، متعددة المناعي غير المباشر، الفحص المجهري متحد البؤر النوعي والكمي الخلية. وعلاوة على ذلك فإننا نقدم متتابعة متعددة بروتوكول المناعي التي تلتف مشاكل شالناشئة يو sually من الحاجة لاستخدام الأجسام المضادة الأولية التي أثيرت في الأنواع المضيفة نفسها. انها تسمح لتحديد دقيق لجميع أنواع فرعية السلف قرن آمون معا مع علامة الانتشار داخل قسم واحد. هذه التقنيات هي أداة قوية لدراسة تنظيم أنواع فرعية مختلفة السلف في موازاة ذلك، مشاركتهم في أمراض الدماغ ودورها في وظائف محددة في الدماغ.
Introduction
مناطق الدماغ اثنين توليد جوهري خلايا عصبية جديدة في جميع مراحل الحياة، ومنطقة subventricular من البطينات الجانبية ومنطقة جزئي التحبب (SGZ) من التلفيف المسنن قرن آمون (DG). الخلايا العصبية حديثي الولادة مستمدة من الخلايا الاصلية العصبية وتذهب من خلال مراحل مختلفة من التنمية المورفولوجية والفسيولوجية قبل أن تصل إلى مرحلة النضج 1،2. من تقسيم ببطء شعاعي تشبه الخلايا الجذعية الدبقية (نوع 1) مراحل متتالية العبور تضخيم الخلايا الاصلية المتوسطة تنشأ. أكثر الأنواع الفرعية غير متمايزة (نوع 2A و 2B نوع) لها شكل غير منتظم مع العمليات عرضية قصيرة. أنها تولد neuroblasts (نوع 3) أن الخروج تدريجيا دورة الخلية لتصبح خلايا عصبية غير ناضجة (مع التشعبات امتدت نحو الطبقة الجزيئية) ودمج أخيرا في شبكة الحصين الخلايا الحبيبية ناضجة كما. بسبب الخصائص الفسيولوجية الخاصة بها وتوفر هذه الخلايا الدوائر مع تعزيز اللدونة 3 suggesتينغ دورا فريدا في وظيفة قرن آمون. في الواقع، ولدت الدراسات في العقد الأخير أدلة قوية على تكوين الخلايا العصبية الكبار يساهم في الذاكرة المكانية، ونمط الانفصال والسلوك العاطفي 4،5.
ويمكن دراسة تكوين الخلايا العصبية الكبار باستخدام أساليب مختلفة. النظير ثيميدين تتضمن في الحمض النووي خلال المرحلة S من دورة الخلية وتسمح الولادة التي يرجع تاريخها، الكمي ومصير تحليل خلايا حديثي الولادة 6-8. تطبيق متتابعة من النظير ثيميدين مختلفة (على سبيل المثال، CldU، EDU أو إيدو) يمكن استخدامها لدراسة دوران خلية أو السكان الخلية ولد في نقاط زمنية مختلفة خلال تجربة 9. بديل، علامة الذاتية لتكاثر الخلايا هو Ki67. يتم التعبير عن ذلك في تقسيم الخلايا خلال جميع مراحل دورة الخلية (G1، S، G2، M) باستثناء مرحلة الراحة (G0) وبداية G1 10،11. لتحليل النمط الظاهري من السكان الخلية حديثي الولادة في الكبار dentatالبريد التلفيف عدة الواسمات الجزيئية مرحلة محددة يمكن استخدام مثل GFAP، nestin، DCX وNeuN 1،6. GFAP هو علامة من الخلايا النجمية الناضجة ولكن يتم التعبير أيضا في خلايا تشبه الخلايا الدبقية شعاعي في الدماغ الأمامي الكبار. Nestin هو خيوط وسيطة محددة لخلايا تشبه الخلايا الدبقية شعاعي والخلايا الاصلية المتوسطة في وقت مبكر. DCX هو بروتين المرتبط أنيبيب المعبر عنها في الأسلاف وسيطة، neuroblasts والخلايا العصبية غير ناضجة. وبناء على (المشارك) التعبير عن هذه العلامات الثلاث والميزات المورفولوجية من الخلايا المسمى ويمكن تحديد أربعة أنواع فرعية خلية سلفية متميزة: نوع 1 (GFAP +، nestin +، DCX -)، نوع 2A (GFAP -، nestin + ، DCX -)، نوع 2B (GFAP -، nestin +، DCX +) ونوع 3 (GFAP -، nestin -، DCX +) 1. شارك في وضع العلامات على DCX جنبا إلى جنب مع NeuN، وهو ما يعبر عنه في الخلايا العصبية تالية للتفتل، يسمح للتمايز immaturه (DCX +، NeuN +) وناضجة (DCX -، NeuN +) الخلايا العصبية الحبيبية.
وكثيرا ما تستخدم علامات المذكورة أعلاه لمناعي شارك في وضع العلامات واللاحق متحد البؤر المجهري لتحليل عدد وهوية الخلايا حديثي الولادة. وهذا يتطلب عادة الأجسام المضادة من الأنواع المضيفة مختلفة لمنع الأجسام المضادة غير مرغوب فيها عبر التفاعل. ومع ذلك، تربى معظم الأجسام المضادة الأولية المناسبة للبحوث الخلايا العصبية إما في الأرانب أو الفئران (على سبيل المثال، والماوس α-BrdU، والماوس α-NeuN، أرنب α-Ki67، أرنب α-GFAP). وهذا يؤدي إلى فرض قيود خطيرة على عدد ومجموعة من مولدات المضادات التي يمكن تقييمها في شريحة واحدة. وهذا بدوره لا يزيد فقط الجهد تلطيخ، كما stainings متعددة يجب أن يؤديها، ولكن يمكن أيضا تؤثر سلبا على مصداقية النتائج. وعلاوة على ذلك، فإن بعض المستضدات عرضة للالفورمالين التي يسببها تثبيت حاتمة اخفاء (على سبيل المثال، Ki67، nestin). وصفنا هنا التعديلات من البروتوكولات immunolabeling أحادية ومتعددة الكلاسيكية (على سبيل المثال، استرجاع حاتمة، متعددة المناعية متتابعة، واستخدام nestin-GFP الفئران المعدلة وراثيا 12) أن التغلب على الكثير من هذه القضايا. على وجه الخصوص، وبروتوكول المناعي متعددة متتابعة يسمح تلطيخ ضد ما يصل إلى أربعة مستضدات مختلفة حتى لو مشتق جزء من الأجسام المضادة من نفس المضيف. وهذا يتيح للكشف في وقت واحد من نوع 1، نوع 2A، 2B نوع ونوع الخلايا 3 السلف، وكذلك النشاط التكاثري في غضون مقطع واحد.
Protocol
Representative Results
Discussion
الكمي وتحديد المجموعات السكانية الفرعية الخلايا حديثي الولادة هو القضية المركزية في مجال البحوث تكوين الخلايا العصبية الكبار. الجمع بين علامات انتشار الأسلحة النووية والأجسام المضادة ضد البروتينات التي أعرب عنها خلال مراحل معينة من الخلايا العصبية الكبار يسمح كش?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank S. Tausch for excellent technical assistance. The work was supported by BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) and DFG (FOR1738).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments & Dilutions |
| Thymidine analog administration | |||
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU | Sigma-Aldrich | B9285 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | Sigma-Aldrich | C6891 | |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | MP Biomedicals | 2105478 | |
| 5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU | MP Biomedicals | 2100357 | |
| Tissue preparation | |||
| Isoflurane-Actavis | Piramal Healthcare | 700211 | |
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Riedel-De Häen | 16005 | toxic, flammable |
| Perfusion pump PD5206 | Heidolph Instruments | 523-52060-00 | |
| Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm | Thermo Fischer Scientific | 06409-13 | |
| Feeding needle, straight, 21G, 1.75mm olive tip, 40mm | Agnthos | 1036 | |
| Freezing microtome Microm HM 400 | Thermo Fischer Scientific | ||
| 24 Well Cell Culture Multiwell Plates | Greiner Bio-One | 662160 | |
| Immunohistochemistry | |||
| Tefal Vitacuisine Steamer | Tefal | VS 4001 | |
| Netwell 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 6-Well Culture Plates | Corning | 3479 | |
| Netwell 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates | Corning | 3477 | |
| Netwell Plastic 6-Well Carrier Kit for 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts | Corning | 3521 | |
| Netwell Plastic 12-Well Carrier Kit for 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts | Corning | 3520 | |
| Vectastain Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) | Sigma-Aldrich | D-5637 | carcinogenic, light sensitive |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Primary antibodies | |||
| rabbit IgG1 α-Ki67 | Novocastra/ Leica Biosystems | NCL-L-Ki67MM1 | DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval |
| rabbit α-GFAP, AS-3-GF | Synaptic Systems | 173 002 | 1:500 |
| goat IgG (H+L) α-GFP | Acris Antibodies | R1091P | 1:300 |
| mouse IgG1 α-nestin | Abcam | ab6142 | 1:200; requires epitope retrieval |
| guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin | Merck Millipore | AB2253 | 1:500 |
| rat IgG2a α-BrdU (ascites) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030CX | for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400 |
| rat IgG2a α-BrdU (purified) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030 | for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400 |
| mouse IgG1ĸ α-BrdU | BD Biosciences | 347580 | for detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350 |
| mouse IgG1 α-NeuN | Merck Millipore | MAB377 | 1:500 |
| Secondary antibodies | |||
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 711-065-152 | 1:500 |
| donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 712-065-150 | 1:500 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 715-065-151 | 1:500 |
| goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | 1:250 |
| donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11055 | 1:250 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment | Dianova | 715-097-003 | 1:100 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 715-605-151 | 1:250 |
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 706-605-148 | 1:250 |
| donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 712-295-150 | 1:250 |
| donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 711-295-152 | 1:250 |
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 706-296-148 | 1:250 |
| Streptavidin-Rhodamine Red-X | Dianova | 016-290-084 | 1:500 |
| goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA | Dianova | 111-155-144 | 1:250, works only with rabbit α-GFAP |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H3570 | 1:1000 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:1000 |
| Blocking | |||
| Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) | Dianova | 715-007-003 | 1:20 |
| Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) | Dianova | 711-007-003 | 1:20 |
| Normal donkey serum | Merck Millipore | S30 | |
| Normal rabbit serum | Dianova | 011-000-010 | |
| Normal goat serum | Dianova | 005-000-001 | |
| Bovine Serum Albumine | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Histology | |||
| Cresyl violett | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Neo-Clear | Merck Millipore | 109843 | non-toxic xylene substitute |
| Neo-Mount | Merck Millipore | 109016 | permanent mounting medium |
| Microscopy | |||
| Axioskop 2 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| LSM 710 | Carl Zeiss Microscopy |
Referências
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).
- Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus. J Physiol. 586 (16), 3759-3765 (2008).
- Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain. Neuron. 54 (4), 559-566 (2007).
- Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research. Rev Neurosci. 22 (3), 267-283 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 339-350 (2010).
- Encinas, J. M., Enikolopov, G. Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain. Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).
- Burns, K. A., Kuan, C. Y. Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus. Eur J Neurosci. 21 (3), 803-807 (2005).
- Cameron, H. A., McKay, R. D. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J Comp Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).
- Vega, C. J., Peterson, D. A. Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination. Nat Methods. 2 (3), 167-169 (2005).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182 (3), 311-322 (2000).
- Brown, D. C., Gatter, K. C. Ki67 protein: the immaculate deception. Histopathology. 40 (1), 2-11 (2002).
- Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice. Neuroreport. 11 (9), 1991-1996 (2000).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).
- Sicinski, P., et al. Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis. Nature. 384 (6608), 470-474 (1996).
- Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2. BMC Neurosci. 13, 46 (2012).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Res Rev. 53 (1), 198-214 (2007).
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. J Histochem Cytochem. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
- Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).
- Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations. Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8 (3), 228-235 (2000).
