Иммуногистохимия и множественные Маркировка с антителами из того же вида-хозяина по изучению взрослых гиппокампа нейрогенеза
Summary
This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.
Abstract
Нейрогенез является строго регулируется, многоступенчатый процесс, в котором новые нейроны генерируются из активированного нервной стволовой клетки с помощью более совершенных промежуточных подтипов предшественников. Каждый из этих подтипов выражает набор конкретных молекулярных маркеров, которые, вместе с конкретными морфологических критериев, могут быть использованы для их идентификации. Как правило, иммунофлуоресцентные методы применяются с участием подтипов специфических антител в сочетании с экзо- или эндогенных маркеров пролиферации. Здесь мы опишем иммунного методы для обнаружения и количественного определения всех этапах взрослого гиппокампа нейрогенеза. Они включают в себя применение тимидина аналогов, transcardial перфузии, обработки ткани, тепло-индуцированной поисковых эпитоп, ABC иммуногистохимических, рассеянный непрямой иммунофлюоресценции, конфокальной микроскопии и сотовый количественной оценке. Кроме того, мы представляем очередную несколько протоколов иммунофлюоресценции, которая обходит проблемы ˙Usually, вытекающие из необходимости использования первичных антител, поднятые в одних и тех же видов хозяев. Это позволяет точно идентифицировать все гиппокампа подтипов предшественников вместе с маркером пролиферации в пределах одного раздела. Эти методы являются мощным инструментом для изучения регуляции различных подтипов предшественников параллельно, их участие в патологий головного мозга и их роль в специфических функций головного мозга.
Introduction
Две области мозга конструктивно генерировать новые нейроны на протяжении всей жизни, субвентрикулярная зона боковых желудочков и субгранулярной зона (SGZ) в зубчатой извилине гиппокампа (ГД). Новорожденные нейроны происходят из нервных клеток-предшественников и пройти через различные этапы морфологического и физиологического развития до достижения зрелости 1,2. С медленно деления радиальной глии, как стволовые клетки (тип 1) последовательных стадий переходные делящиеся клетки-предшественники промежуточных возникает. Более недифференцированные подтипов (тип 2a и 2b типа) имеют неправильную форму с короткими, касательных процессов. Они генерируют нейробласты (тип 3), которые постепенно выйти из клеточного цикла, чтобы стать незрелые нейроны (с дендриты распространялась и на молекулярном слое) и, наконец, интегрироваться в гиппокампе сети, зрелые зернистых клеток. Из-за их особых физиологических особенностей эти клетки обеспечивают схемы с улучшенными пластичность 3 suggesка уникальную роль в гиппокампе функции. На самом деле, исследования последнего десятилетия вызвал значительный доказательства того, что нейрогенез вносит свой вклад в пространственной памяти, разделение образов и эмоционального поведения 4,5.
Нейрогенез может быть изучено с использованием различных подходов. Аналоги тимидина включить в ДНК во время S-фазы клеточного цикла и позволяют рождение знакомств, количественного и судьба анализ новорожденных клеток 6-8. Последовательное применение различных аналогов тимидина (например, CldU, EDU или ПИН) могут быть использованы для изучения обновление клеток или клеточных популяций, родившихся в различные моменты времени в ходе эксперимента 9. Альтернативный, эндогенный маркер клеточной пролиферации является Ki67. Это выражается в делящихся клетках на всех этапах клеточного цикла (G1, S, G2, M), за исключением фазы покоя (G0) и в начале G1 10,11. Для анализа фенотипа новорожденных клеточных популяций у взрослых dentatе извилины несколько сценических конкретных молекулярных маркеров может быть использован, например, GFAP, нестина, DCX и NeuN 1,6. GFAP является маркером зрелых астроцитов, но также выражается в радиальной глии-подобные клетки во взрослом переднего мозга. Нестин представляет собой промежуточный нити, характерные для радиальных глиальных клеток, как и в начале промежуточных клеток-предшественников. DCX является ассоциированный с микротрубочками белок экспрессируется в промежуточных предшественников, нейробластов и незрелых нейронов. На основании (со) выражения этих трех маркеров и морфологических особенностей меченых клеток четыре различных подтипов клеток-предшественников можно выделить: тип 1 (GFAP +, нестин +, DCX -), тип 2а (GFAP -, нестин + , DCX -), тип 2б (GFAP -, нестин +, DCX +) и 3 (GFAP -, нестин -, DCX +) 1. Co-маркировка DCX вместе с NeuN, которая выражается в постмитотических нейронов, позволяет дифференцировать immaturе (DCX +, NeuN +) и зрелых (DCX -, NeuN +) гранул нейроны.
Указанные выше маркеры часто используются для иммунофлуоресцентным сотрудничества маркировки и последующего конфокальной микроскопии, чтобы проанализировать количество и личности новорожденных клеток. Это обычно требует антител из различных видов хозяев, чтобы предотвратить нежелательное антител перекрестной реактивности. Тем не менее, большинство первичных антител, пригодных для исследования нейрогенеза поднимаются либо у кроликов или мышей (например, мыши α-BrdU, мыши α-NeuN, кролика α-Ki67, кролика α-GFAP). Это приводит к серьезным ограничениям в количестве и комбинации антигенов, которые могут быть оценены в одной секции. Это, в свою очередь, не только увеличивает усилие окрашивания, а несколько окрашивание должны быть выполнены, но также может поставить под угрозу достоверность результатов. Кроме того, некоторые антигены, восприимчивы к фиксации формалином индуцированных эпитопа маскировки (например, Ki67, Нестин). Здесь мы опишем изменения от классических протоколов единичного и множественного иммунноокрашивания (например, поиск эпитоп, несколько последовательный иммуноокрашивание, использование нестин-GFP трансгенных мышей 12), что преодолеть многие из этих проблем. В частности, протокол последовательного многократного иммунофлюоресценции позволяет окрашивание против до четырех различных антигенов, даже если часть антител, полученных из того же хоста. Это дает возможность одновременно регистрировать типа 1, типа 2а, 2b типа и клеток типа 3-предшественников, а также их пролиферативную активность в течение одной секции.
Protocol
Representative Results
Discussion
Количественная и идентификация субпопуляций новорожденных клеток является центральным вопросом во взрослой исследований нейрогенез. Сочетание распространения маркеров и антител против белков, высказанных в ходе определенных этапах взрослого нейрогенеза позволяет иммуногистохим?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank S. Tausch for excellent technical assistance. The work was supported by BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) and DFG (FOR1738).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments & Dilutions |
| Thymidine analog administration | |||
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU | Sigma-Aldrich | B9285 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | Sigma-Aldrich | C6891 | |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | MP Biomedicals | 2105478 | |
| 5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU | MP Biomedicals | 2100357 | |
| Tissue preparation | |||
| Isoflurane-Actavis | Piramal Healthcare | 700211 | |
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Riedel-De Häen | 16005 | toxic, flammable |
| Perfusion pump PD5206 | Heidolph Instruments | 523-52060-00 | |
| Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm | Thermo Fischer Scientific | 06409-13 | |
| Feeding needle, straight, 21G, 1.75mm olive tip, 40mm | Agnthos | 1036 | |
| Freezing microtome Microm HM 400 | Thermo Fischer Scientific | ||
| 24 Well Cell Culture Multiwell Plates | Greiner Bio-One | 662160 | |
| Immunohistochemistry | |||
| Tefal Vitacuisine Steamer | Tefal | VS 4001 | |
| Netwell 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 6-Well Culture Plates | Corning | 3479 | |
| Netwell 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates | Corning | 3477 | |
| Netwell Plastic 6-Well Carrier Kit for 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts | Corning | 3521 | |
| Netwell Plastic 12-Well Carrier Kit for 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts | Corning | 3520 | |
| Vectastain Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) | Sigma-Aldrich | D-5637 | carcinogenic, light sensitive |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Primary antibodies | |||
| rabbit IgG1 α-Ki67 | Novocastra/ Leica Biosystems | NCL-L-Ki67MM1 | DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval |
| rabbit α-GFAP, AS-3-GF | Synaptic Systems | 173 002 | 1:500 |
| goat IgG (H+L) α-GFP | Acris Antibodies | R1091P | 1:300 |
| mouse IgG1 α-nestin | Abcam | ab6142 | 1:200; requires epitope retrieval |
| guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin | Merck Millipore | AB2253 | 1:500 |
| rat IgG2a α-BrdU (ascites) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030CX | for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400 |
| rat IgG2a α-BrdU (purified) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030 | for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400 |
| mouse IgG1ĸ α-BrdU | BD Biosciences | 347580 | for detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350 |
| mouse IgG1 α-NeuN | Merck Millipore | MAB377 | 1:500 |
| Secondary antibodies | |||
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 711-065-152 | 1:500 |
| donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 712-065-150 | 1:500 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 715-065-151 | 1:500 |
| goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | 1:250 |
| donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11055 | 1:250 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment | Dianova | 715-097-003 | 1:100 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 715-605-151 | 1:250 |
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 706-605-148 | 1:250 |
| donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 712-295-150 | 1:250 |
| donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 711-295-152 | 1:250 |
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 706-296-148 | 1:250 |
| Streptavidin-Rhodamine Red-X | Dianova | 016-290-084 | 1:500 |
| goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA | Dianova | 111-155-144 | 1:250, works only with rabbit α-GFAP |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H3570 | 1:1000 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:1000 |
| Blocking | |||
| Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) | Dianova | 715-007-003 | 1:20 |
| Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) | Dianova | 711-007-003 | 1:20 |
| Normal donkey serum | Merck Millipore | S30 | |
| Normal rabbit serum | Dianova | 011-000-010 | |
| Normal goat serum | Dianova | 005-000-001 | |
| Bovine Serum Albumine | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Histology | |||
| Cresyl violett | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Neo-Clear | Merck Millipore | 109843 | non-toxic xylene substitute |
| Neo-Mount | Merck Millipore | 109016 | permanent mounting medium |
| Microscopy | |||
| Axioskop 2 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| LSM 710 | Carl Zeiss Microscopy |
Referências
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).
- Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus. J Physiol. 586 (16), 3759-3765 (2008).
- Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain. Neuron. 54 (4), 559-566 (2007).
- Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research. Rev Neurosci. 22 (3), 267-283 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 339-350 (2010).
- Encinas, J. M., Enikolopov, G. Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain. Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).
- Burns, K. A., Kuan, C. Y. Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus. Eur J Neurosci. 21 (3), 803-807 (2005).
- Cameron, H. A., McKay, R. D. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J Comp Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).
- Vega, C. J., Peterson, D. A. Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination. Nat Methods. 2 (3), 167-169 (2005).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182 (3), 311-322 (2000).
- Brown, D. C., Gatter, K. C. Ki67 protein: the immaculate deception. Histopathology. 40 (1), 2-11 (2002).
- Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice. Neuroreport. 11 (9), 1991-1996 (2000).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).
- Sicinski, P., et al. Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis. Nature. 384 (6608), 470-474 (1996).
- Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2. BMC Neurosci. 13, 46 (2012).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Res Rev. 53 (1), 198-214 (2007).
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. J Histochem Cytochem. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
- Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).
- Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations. Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8 (3), 228-235 (2000).
