大人の海馬神経新生を研究するために、同じホスト種由来の抗体による免疫組織化学および複数のラベル
Summary
This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.
Abstract
成体神経新生は、新しいニューロンが次第にコミット中間前駆体サブタイプを介して活性化神経幹細胞から生成された高度に調節され、多段階プロセスである。これらのサブタイプの各々は、一緒に、特定の形態学的基準とのそれらの同定のために使用することができる特定の分子マーカーの組を表す。典型的に、免疫蛍光技術は、エキソヌクレアーゼまたは内因性の増殖マーカーと組み合わせてサブタイプに特異的な抗体を含む適用される。私たちはここに大人の海馬の神経新生のすべての段階の検出および定量のための方法を免疫標識について説明します。これらは、チミジン類似体、腔的灌流、組織処理、熱誘導性エピトープ回復、ABC免疫組織化学、複数の間接的免疫蛍光、共焦点顕微鏡法および細胞定量化の適用を含む。さらに私たちは、問題のuを回避するシーケンシャル複数の免疫蛍光プロトコルを提示sually同じ宿主種に上げ、一次抗体を使用する必要性から生じる。これは、単一のセクション内増殖マーカーと一緒にすべての海馬前駆細胞サブタイプの正確な同定を可能にする。これらの技術は、並列に異なる前駆体サブタイプの調節、脳の病理への関与、特定の脳機能におけるそれらの役割を研究するための強力なツールである。
Introduction
二つの脳領域を構成的生涯を通じて新しいニューロンを生成し、側脳室の脳室下帯と海馬歯状回（DG）の下帯（SGZ）。新生ニューロンは、神経前駆細胞から派生し、成熟1,2に到達する前に形態学的および生理学的な開発のさまざまな段階を経る。ゆっくり分裂放射状グリア様幹細胞（タイプ1）から、トランジットの連続したステージは、中間前駆細胞を増幅が生じる。より未分化のサブタイプ（タイプ2aおよび2b型）が短く、接線プロセスとの不規則な形状を有する。彼らは徐々に未熟ニューロン（樹状突起と分子層の方に延長）になるために細胞周期を終了し、最終的に成熟した顆粒細胞などの海馬ネットワークに統合する神経芽細胞（タイプ3）を生成します。それらの特定の生理学的特性には、これらの細胞は、強化された可塑3 suggesで回路を提供ティン海馬機能で独自の役割。実際には、最後の十年の研究では、成人の神経新生が空間記憶、パターン分離と情動行動4,5に寄与することを実質的証拠を生成した。
成体神経新生は、異なるアプローチを用いて研究することができる。チミジン類似体は、細胞周期のS期の間にDNAに組み込むと新生児の細胞6-8の誕生デート、定量化と運命分析を可能にする。別のチミジン類似体（ 例えば、CldU、EDUのまたはIDU）を順次適用は、細胞の代謝回転または実験9の経過中の異なる時点で生まれた細胞集団を研究するために使用することができる。代替、細胞増殖のための内因性のマーカーはKi67のです。これは、細胞周期（G1、S、G2、M）休止期を除く（G0）及びG1 10,11の先頭のすべての段階の間に分裂する細胞において発現される。成人における新生児細胞集団の表現型を解析するために、dentat電子状回いくつかの段階特異的な分子マーカーは、GFAP、ネスチン、およびNeuNのDCX 1,6として使用することができる。 GFAPは成熟したアストロサイトのマーカーであるだけでなく、大人の前脳における放射状グリア細胞様細胞に発現している。ネスチンは、放射状グリア様細胞および初期の中間前駆細胞に特異的な中間径フィラメントである。 DCXは、中間前駆細胞、神経芽細胞と未熟ニューロンにおいて発現微小管結合タンパク質である。 +、ネスチン– 、2A型（GFAP – 1型（GFAP +、ネスチン+、DCX）：これらの3つのマーカーと4の異なる前駆細胞のサブタイプを識別できる標識された細胞の形態学的特徴の（共）式に基づいて、 、DCX – ）、2B型（GFAP – 、ネスチン+、DCX +）とタイプ3（GFAP – 、ネスチン– 、DCX +）1。一緒に有糸分裂後ニューロンに発現しているのNeuN、とDCXの同時標識、immaturの分化を可能にする電子（DCX +、のNeuN +）および（DCX – 、のNeuN +）成熟顆粒ニューロン。
上述したマーカーは、しばしば、新生児細胞の数および同一性を分析するために免疫蛍光同時標識およびその後の共焦点顕微鏡検査のために使用される。これは、典型的には望ましくない抗体の交差反応性を防止するために、異なる宿主種由来の抗体を必要とする。しかし、神経発生の研究に適した一次抗体の大部分は、どちらウサギまたはマウス（ 例えば、マウスα-BrdUを、マウスα-のNeuN、ウサギα-Ki67の、ウサギα-GFAP）で飼育されている。これは、単一のスライスで評価することができる抗原の数との組み合わせで重大な制約をもたらす。これは、複数の染色を実行しなければならないように、染色の労力を増加させるだけでなく、結果の信頼性を損なう可能性だけでなく。さらに、いくつかの抗原は、ホルマリン固定誘導性エピトープマスキング（ 例えば、Ki67の影響を受けやすい、ネスチン）。私たちはここに、これらの問題の多くを克服古典的な単一および複数の免疫標識プロトコル（ 例えば、エピトープ回復、複数の連続免疫染色、ネスチン-GFPトランスジェニックマウス12の使用）からの変更について説明します。特に、複数のシーケンシャル免疫プロトコルは、抗体の一部は、同じ宿主に由来する場合であっても、最大4つの異なる抗原に対する染色を可能にする。これは、同時タイプ1、タイプ2aと2b型と3型前駆細胞の検出、ならびに単一セクション内のそれらの増殖活性を可能にする。
Protocol
Representative Results
Discussion
新生児細胞の亜集団の定量および同定は、成人の神経発生研究の中心的な課題である。大人の神経発生の特定の段階の間に発現タンパク質に対する増殖マーカーおよび抗体を組み合わせることにより、これらの亜集団の免疫組織化学的検出を可能にする。抗体または抗体の組み合わせのいくつかは、特定の染色条件を必要とする。
合成チミジン類似体の分裂細胞の標識?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank S. Tausch for excellent technical assistance. The work was supported by BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) and DFG (FOR1738).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments & Dilutions |
| Thymidine analog administration | |||
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU | Sigma-Aldrich | B9285 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | Sigma-Aldrich | C6891 | |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | MP Biomedicals | 2105478 | |
| 5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU | MP Biomedicals | 2100357 | |
| Tissue preparation | |||
| Isoflurane-Actavis | Piramal Healthcare | 700211 | |
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Riedel-De Häen | 16005 | toxic, flammable |
| Perfusion pump PD5206 | Heidolph Instruments | 523-52060-00 | |
| Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm | Thermo Fischer Scientific | 06409-13 | |
| Feeding needle, straight, 21G, 1.75mm olive tip, 40mm | Agnthos | 1036 | |
| Freezing microtome Microm HM 400 | Thermo Fischer Scientific | ||
| 24 Well Cell Culture Multiwell Plates | Greiner Bio-One | 662160 | |
| Immunohistochemistry | |||
| Tefal Vitacuisine Steamer | Tefal | VS 4001 | |
| Netwell 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 6-Well Culture Plates | Corning | 3479 | |
| Netwell 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates | Corning | 3477 | |
| Netwell Plastic 6-Well Carrier Kit for 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts | Corning | 3521 | |
| Netwell Plastic 12-Well Carrier Kit for 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts | Corning | 3520 | |
| Vectastain Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) | Sigma-Aldrich | D-5637 | carcinogenic, light sensitive |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Primary antibodies | |||
| rabbit IgG1 α-Ki67 | Novocastra/ Leica Biosystems | NCL-L-Ki67MM1 | DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval |
| rabbit α-GFAP, AS-3-GF | Synaptic Systems | 173 002 | 1:500 |
| goat IgG (H+L) α-GFP | Acris Antibodies | R1091P | 1:300 |
| mouse IgG1 α-nestin | Abcam | ab6142 | 1:200; requires epitope retrieval |
| guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin | Merck Millipore | AB2253 | 1:500 |
| rat IgG2a α-BrdU (ascites) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030CX | for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400 |
| rat IgG2a α-BrdU (purified) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030 | for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400 |
| mouse IgG1ĸ α-BrdU | BD Biosciences | 347580 | for detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350 |
| mouse IgG1 α-NeuN | Merck Millipore | MAB377 | 1:500 |
| Secondary antibodies | |||
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 711-065-152 | 1:500 |
| donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 712-065-150 | 1:500 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 715-065-151 | 1:500 |
| goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | 1:250 |
| donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11055 | 1:250 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment | Dianova | 715-097-003 | 1:100 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 715-605-151 | 1:250 |
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 706-605-148 | 1:250 |
| donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 712-295-150 | 1:250 |
| donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 711-295-152 | 1:250 |
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 706-296-148 | 1:250 |
| Streptavidin-Rhodamine Red-X | Dianova | 016-290-084 | 1:500 |
| goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA | Dianova | 111-155-144 | 1:250, works only with rabbit α-GFAP |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H3570 | 1:1000 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:1000 |
| Blocking | |||
| Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) | Dianova | 715-007-003 | 1:20 |
| Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) | Dianova | 711-007-003 | 1:20 |
| Normal donkey serum | Merck Millipore | S30 | |
| Normal rabbit serum | Dianova | 011-000-010 | |
| Normal goat serum | Dianova | 005-000-001 | |
| Bovine Serum Albumine | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Histology | |||
| Cresyl violett | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Neo-Clear | Merck Millipore | 109843 | non-toxic xylene substitute |
| Neo-Mount | Merck Millipore | 109016 | permanent mounting medium |
| Microscopy | |||
| Axioskop 2 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| LSM 710 | Carl Zeiss Microscopy |
Referências
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).
- Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus. J Physiol. 586 (16), 3759-3765 (2008).
- Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain. Neuron. 54 (4), 559-566 (2007).
- Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research. Rev Neurosci. 22 (3), 267-283 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 339-350 (2010).
- Encinas, J. M., Enikolopov, G. Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain. Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).
- Burns, K. A., Kuan, C. Y. Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus. Eur J Neurosci. 21 (3), 803-807 (2005).
- Cameron, H. A., McKay, R. D. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J Comp Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).
- Vega, C. J., Peterson, D. A. Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination. Nat Methods. 2 (3), 167-169 (2005).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182 (3), 311-322 (2000).
- Brown, D. C., Gatter, K. C. Ki67 protein: the immaculate deception. Histopathology. 40 (1), 2-11 (2002).
- Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice. Neuroreport. 11 (9), 1991-1996 (2000).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).
- Sicinski, P., et al. Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis. Nature. 384 (6608), 470-474 (1996).
- Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2. BMC Neurosci. 13, 46 (2012).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Res Rev. 53 (1), 198-214 (2007).
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. J Histochem Cytochem. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
- Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).
- Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations. Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8 (3), 228-235 (2000).
