אימונוהיסטוכימיה ותיוג מרובה עם נוגדנים ממיני Host אותו ללימוד למבוגרים בהיפוקמפוס נוירוגנזה
Summary
This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.
Abstract
neurogenesis למבוגרים הוא תהליך שבו תאי עצב חדשים נוצרים מתאי גזע עצביים מופעלים באמצעות תת אב ביניים מחויבים יותר ויותר פיקוח הדוק, רב-שלבים. כל אחד מאלה מבטא תת קבוצה של סמנים מולקולריים ספציפיים ש, יחד עם קריטריונים מורפולוגיים ספציפיים, יכול לשמש לזיהוי. בדרך כלל, טכניקות immunofluorescent מיושמות מעורבות נוגדנים תת ספציפיים בשילוב עם סמני התפשטות exo- או אנדוגני. אנחנו במסמך זה מתארים immunolabeling שיטות לאיתור והכימות של כל שלבי neurogenesis היפוקמפוס המבוגר. אלה מהווים היישום של אנלוגים thymidine, זלוף transcardial, עיבוד רקמות, אחזור epitope מושרה חום, אימונוהיסטוכימיה ABC, immunofluorescence העקיף מרובה, מיקרוסקופיה confocal וכימות תא. יתר על כן אנו מציגים פרוטוקול immunofluorescence מרובה רציף העוקף בעיות usually נובע מהצורך בשימוש בנוגדנים העיקריים שהועלו באותו מין המארח. זה מאפשר זיהוי מדויק של כל תת אב היפוקמפוס יחד עם סמן התפשטות בתוך קטע אחד. טכניקות אלה הן כלי רב עוצמה כדי ללמוד את הרגולציה של תת אב שונה במקביל, מעורבותם בפתולוגיות מוח ותפקידם בתפקודי מוח ספציפיים.
Introduction
שני אזורים במוח constitutively ליצור נוירונים חדשים לאורך כל חיים, אזור subventricular של חדרים לרוחב ואזור subgranular (SGZ) של gyrus בהיפוקמפוס המשונן (DG). נוירונים היילוד נובעים מהתאים עצביים ולעבור את שלבים שונים של פיתוח מורפולוגיים ופיזיולוגי לפני שהגיע לבגרות 1,2. מתא החלוקה לאט רדיאלי כמו גליה-גזע (סוג 1) שלבים רצופים של מעבר הגברה ותאי ביניים להתעורר. תת מובחן יותר (2 א ו -2 ב סוג הסוג) יש צורה לא סדירה עם תהליכים קצרים, משיקים. הם מייצרים neuroblasts (סוג 3) שיוצא בהדרגה את מחזור התא להפוך נוירונים בוגרים (עם דנדריטים מושטים אל השכבה המולקולרית) ולבסוף להשתלב ברשת בהיפוקמפוס תאי גרגיר כבוגר. בשל המאפיינים הפיסיולוגיים שלהם בפרט תאים אלה מספקים מעגלים עם פלסטיות 3 הצעותיה המשופרותטינג תפקיד ייחודי בתפקוד בהיפוקמפוס. למעשה, מחקרים בעשור האחרון נוצרו ראיות משמעותיות שneurogenesis למבוגרים תורמים לזיכרון מרחבי, הפרדת דפוס והתנהגות 4,5 רגשית.
neurogenesis למבוגרים ניתן ללמוד באמצעות גישות שונות. אנלוגים thymidine לשלב DNA במהלך S-השלב של מחזור התא ולאפשר ניתוח היכרויות לידה, כימות וגורלם של תאים שזה עתה נולד 6-8. יישום רציף של אנלוגים thymidine השונים (לדוגמא: IdU, CldU, edu או) יכול לשמש כדי לחקור את מחזור תא או אוכלוסיות תאים נולדו בנקודות זמן שונות במהלך ניסוי 9. אלטרנטיבה, סמן אנדוגני להתפשטות תאים הוא Ki67. זה בא לידי הביטוי בחלוקת תאים במהלך כל השלבים של מחזור התא (G1, S, G2, M) למעט שלב המנוחה (G0) ותחילת G1 10,11. כדי לנתח את הפנוטיפ של אוכלוסיות תאים שזה עתה נולדו במבוגרי dentatכמה סמנים מולקולריים בשלב מסוים gyrus הדואר יכולים לשמש כגון GFAP, nestin, DCX וNeuN 1,6. GFAP הוא סמן של האסטרוציטים בוגרים אלא גם בא לידי ביטוי בתאים כמו גליה-רדיאלי במוח הקדמי המבוגר. Nestin הוא סיבי ביניים ספציפיים לתאים כמו גליה-רדיאלי ובתאי ביניים מוקדמים. DCX הוא חלבון microtubule הקשורים בא לידי ביטוי באבות ביניים, neuroblasts ותאי עצב לא בוגרים. בהתבסס על הביטוי (שיתוף) של שלושת סמנים אלה ותכונות מורפולוגיות של התאים שכותרתו ניתן לזהות ארבעה תת תא אב נפרד: סוג 1 (GFAP +, + nestin, DCX -), 2 א הסוג (GFAP -, nestin + , DCX -), 2b הסוג (GFAP -, + nestin, DCX +) וסוג 3 (GFAP -, nestin -, DCX +) 1. Co-תיוג של DCX יחד עם NeuN, המתבטא בתאי עצב postmitotic, מאפשר הבידול של immaturדואר (DCX +, NeuN +) ובוגר (DCX -, NeuN +) נוירונים גרגיר.
הסמנים שהוזכרו לעיל משמשים לעתים קרובות לשיתוף תיוג immunofluorescent ומיקרוסקופיה confocal לאחר מכן לנתח את המספר וזהותם של תאים שזה עתה נולד. זה בדרך כלל דורש נוגדנים ממיני מארח שונים כדי למנוע נוגדן רצוי תגובה צולבת. עם זאת, הרוב המכריע של נוגדנים ראשוניים מתאימים למחקר neurogenesis גדלים גם בארנבות או עכברים (למשל, עכבר α-BrdU, עכבר α-NeuN, ארנב α-Ki67, α-GFAP ארנב). זה מוביל למגבלות חמורות במספר ובשילוב של אנטיגנים שיכולים להיות מוערך בפרוסה אחת. זה בתורו לא רק מגדיל את מאמץ הצביעה, כstainings מרובה צריכה להתבצע, אלא גם עלול לפגוע באמינות של תוצאות. יתר על כן, כמה אנטיגנים רגישים למיסוך פורמלין מושרה קיבעון epitope (למשל, Ki67, Nestin). אנחנו במסמך זה מתארים את השינויים מפרוטוקולי immunolabeling היחיד ו מרובה הקלאסיים (למשל, שליפת epitope, immunostaining רציף מרובה, שימוש בעכברי nestin-GFP מהונדסים 12) שלהתגבר על רבים מנושאים אלה. בפרט, פרוטוקול immunofluorescence מרובה רציף מאפשר צביעה נגד עד ארבעה אנטיגנים שונים, גם אם חלק מהנוגדנים נגזר מאותו המארח. זה מאפשר זיהוי סימולטני של סוג 1, 2 א הסוג, 2b הסוג וסוג תאי 3 אב, כמו גם פעילות השגשוג שלהם בתוך קטע אחד.
Protocol
Representative Results
Discussion
כימות וזיהוי של תת-אוכלוסיות של תאים שזה עתה נולדו הוא נושא מרכזי במחקר neurogenesis למבוגרים. שילוב סמני התפשטות ונוגדנים נגד חלבונים הביעו בשלבים מסוימים של neurogenesis המבוגר מאפשר זיהוי immunohistochemical של תת-אוכלוסיות אלה. חלק מהנוגדנים או שילובי נוגדן דורש תנאי מכתים ספציפיים….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank S. Tausch for excellent technical assistance. The work was supported by BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) and DFG (FOR1738).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments & Dilutions |
| Thymidine analog administration | |||
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU | Sigma-Aldrich | B9285 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | Sigma-Aldrich | C6891 | |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | MP Biomedicals | 2105478 | |
| 5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU | MP Biomedicals | 2100357 | |
| Tissue preparation | |||
| Isoflurane-Actavis | Piramal Healthcare | 700211 | |
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Riedel-De Häen | 16005 | toxic, flammable |
| Perfusion pump PD5206 | Heidolph Instruments | 523-52060-00 | |
| Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm | Thermo Fischer Scientific | 06409-13 | |
| Feeding needle, straight, 21G, 1.75mm olive tip, 40mm | Agnthos | 1036 | |
| Freezing microtome Microm HM 400 | Thermo Fischer Scientific | ||
| 24 Well Cell Culture Multiwell Plates | Greiner Bio-One | 662160 | |
| Immunohistochemistry | |||
| Tefal Vitacuisine Steamer | Tefal | VS 4001 | |
| Netwell 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 6-Well Culture Plates | Corning | 3479 | |
| Netwell 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates | Corning | 3477 | |
| Netwell Plastic 6-Well Carrier Kit for 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts | Corning | 3521 | |
| Netwell Plastic 12-Well Carrier Kit for 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts | Corning | 3520 | |
| Vectastain Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) | Sigma-Aldrich | D-5637 | carcinogenic, light sensitive |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Primary antibodies | |||
| rabbit IgG1 α-Ki67 | Novocastra/ Leica Biosystems | NCL-L-Ki67MM1 | DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval |
| rabbit α-GFAP, AS-3-GF | Synaptic Systems | 173 002 | 1:500 |
| goat IgG (H+L) α-GFP | Acris Antibodies | R1091P | 1:300 |
| mouse IgG1 α-nestin | Abcam | ab6142 | 1:200; requires epitope retrieval |
| guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin | Merck Millipore | AB2253 | 1:500 |
| rat IgG2a α-BrdU (ascites) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030CX | for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400 |
| rat IgG2a α-BrdU (purified) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030 | for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400 |
| mouse IgG1ĸ α-BrdU | BD Biosciences | 347580 | for detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350 |
| mouse IgG1 α-NeuN | Merck Millipore | MAB377 | 1:500 |
| Secondary antibodies | |||
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 711-065-152 | 1:500 |
| donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 712-065-150 | 1:500 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 715-065-151 | 1:500 |
| goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | 1:250 |
| donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11055 | 1:250 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment | Dianova | 715-097-003 | 1:100 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 715-605-151 | 1:250 |
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 706-605-148 | 1:250 |
| donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 712-295-150 | 1:250 |
| donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 711-295-152 | 1:250 |
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 706-296-148 | 1:250 |
| Streptavidin-Rhodamine Red-X | Dianova | 016-290-084 | 1:500 |
| goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA | Dianova | 111-155-144 | 1:250, works only with rabbit α-GFAP |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H3570 | 1:1000 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:1000 |
| Blocking | |||
| Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) | Dianova | 715-007-003 | 1:20 |
| Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) | Dianova | 711-007-003 | 1:20 |
| Normal donkey serum | Merck Millipore | S30 | |
| Normal rabbit serum | Dianova | 011-000-010 | |
| Normal goat serum | Dianova | 005-000-001 | |
| Bovine Serum Albumine | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Histology | |||
| Cresyl violett | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Neo-Clear | Merck Millipore | 109843 | non-toxic xylene substitute |
| Neo-Mount | Merck Millipore | 109016 | permanent mounting medium |
| Microscopy | |||
| Axioskop 2 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| LSM 710 | Carl Zeiss Microscopy |
Referências
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).
- Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus. J Physiol. 586 (16), 3759-3765 (2008).
- Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain. Neuron. 54 (4), 559-566 (2007).
- Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research. Rev Neurosci. 22 (3), 267-283 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 339-350 (2010).
- Encinas, J. M., Enikolopov, G. Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain. Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).
- Burns, K. A., Kuan, C. Y. Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus. Eur J Neurosci. 21 (3), 803-807 (2005).
- Cameron, H. A., McKay, R. D. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J Comp Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).
- Vega, C. J., Peterson, D. A. Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination. Nat Methods. 2 (3), 167-169 (2005).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182 (3), 311-322 (2000).
- Brown, D. C., Gatter, K. C. Ki67 protein: the immaculate deception. Histopathology. 40 (1), 2-11 (2002).
- Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice. Neuroreport. 11 (9), 1991-1996 (2000).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).
- Sicinski, P., et al. Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis. Nature. 384 (6608), 470-474 (1996).
- Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2. BMC Neurosci. 13, 46 (2012).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Res Rev. 53 (1), 198-214 (2007).
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. J Histochem Cytochem. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
- Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).
- Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations. Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8 (3), 228-235 (2000).
