Abstract
Lichtgevende Identificatie van functionele elementen in 3'UTRs (3'LIFE) kan de snelle identificatie van doelwitten van specifieke miRNAs in een reeks van honderden bevraagd 3'UTRs. Target identificatie is gebaseerd op de dual-luciferase assay, die detecteert binding bij het mRNA niveau door meting translationele uitgang, die een functionele uitlezing van miRNA richten. 3'LIFE maakt gebruik van niet-merkgebonden buffers en reagentia, en publiekelijk beschikbare verslaggever bibliotheken, waardoor genoom-brede schermen haalbaar en rendabel. 3'LIFE kan worden uitgevoerd in een standaard lab instelling of opgeschaald met behulp van vloeibare handling robots en andere high-throughput instrumentatie. We illustreren de benadering met behulp van een dataset van menselijke 3'UTRs gekloond in 96-well platen en twee test-miRNAs, laat-7c en miR-10b. We demonstreren hoe DNA bereiding, transfectie, celcultuur en luciferase assays in 96 putjes format uit te voeren en zorgen voor gegevensanalyseanalyse. Tot slot 3'LIFE is zeer reproduceerbare, snelle, systematische, en identificeert groot vertrouwen doelen.
Introduction
Het algemene doel van deze methode is voor het opsporen en nauwkeurig microRNA (miRNA) doelen in kaart in high-throughput. MiRNAs endogene niet-coderende RNA's ~ 22 nucleotiden lang. Na transcriptie en verwerking, zijn volwassen miRNAs opgenomen in een eiwitcomplex genaamd de RNA-geïnduceerde silencing complex (RISC). Elk miRNA begeleidt de RISC elementen voornamelijk gevestigd zijn in de 3 'onvertaalde regio (3'UTRs) van messenger RNA (mRNA) te richten, wat resulteert in een van beide vertalingen repressie of mRNA splitsing 1. Mirna herkennen doelplaatsen op basis van standaard Watson-Crick en G: U wiebelen baseparing en zijn ontaard in de natuur, met meerdere mismatched basenparen en puilden regio. Veel miRNAs zijn in grote lijnen behouden van planten op de mens 2,3, waar ze spelen een breed scala van biologische rollen. In metazoa kan miRNAs meerdere biologische processen zoals mobiele beslissingen over het lot 4, ontwikkelingsstoornissen timing 5 beïnvloeden 6,7. MiRNA misexpression kan ook leiden tot afwijkende genregulatie, die grote invloed op celgedrag uitsluitend gebaseerd op de functie van doelgenen hebben. Als zodanig zijn miRNAs gekoppeld aan een groot aantal ziekten, waaronder neurodegeneratie 8,9, diabetes en kanker 10 11. Bioinformatic en natte bank benaderingen suggereert dat elke miRNA kan in staat targeting honderden tot duizenden verschillende mRNAs 14/12, wat aangeeft dat high-throughput of genoom benaderingen moeten deze grote groep potentiële interacties sonde.
Het identificeren van target genen is een cruciaal onderdeel van mechanistisch definiëren miRNA functie, en om dat te doen onderzoekers moeten in staat zijn om doelen te onthullen op een grote schaal. Verschillende benaderingen zijn ontwikkeld om miRNA doelen, waaronder bioinformatic voorspelling algoritmes identificeren, high-throughput sequentiebepalinggerichte mRNAs en reporter gebaseerde assays. Elk van deze benaderingen heeft inherent sterke en zwakke punten. Aangezien targeting miRNA wordt geleid door sequentiespecificiteit, met name van 2-6 nucleotiden van het miRNA (genoemd het zaad regio), diverse algoritmen ontwikkeld om miRNA targets gehele genoom van veel organismen te voorspellen. Deze algoritmen zijn ontwikkeld op basis van de waargenomen baseparing motieven van gevalideerde miRNA targets, en vaak gebruik parameters zoals stringente zaad koppelen behoud plaats en / of thermodynamische stabiliteit 15. Hoewel deze filters te verfijnen het grote aantal vermeende doelwitten met voldoende complementariteit om alleen hoge vertrouwen targets, kunnen zij worden uitgesloten soorten specifieke en niet-canonieke miRNA doelwit sites, die recent bewijs suggereert zijn wijdverspreid 16-24. Bovendien hoeven deze voorspellingen geen rekening mechanismen van mRNA verwerking die miRNA doelplaatsen, zoals alternatieve polyadenylatie sluiten25, RNA editing 26, RNA methylatie 27 en coöperatieve binding. Als zodanig, hebben hoge vals-positieve en vals-negatieve tarieven gemeld voor vele algoritmen 22,24,28. Hoewel deze algoritmes zijn nuttig om kandidaat miRNA targets te identificeren voor de volgende experimentele validatie, deze hoge foutenpercentages beperken de effectiviteit van bioinformatica methoden voor systematische miRNA doeldetectie.
Om systematisch sonde voor interacties tussen een bepaalde miRNA en potentieel doelwit 3'UTRs hebben we een high-throughput assay genoemd Lichtgevende Identificatie van functionele elementen in 3'UTRs (3'LIFE) 24 ontwikkeld. Deze test meet de directe interacties en translationele onderdrukking van de test 3'UTR van een query miRNA met een dual luciferase reporter systeem. In dit systeem zijn de 3'UTR van een gen van belang wordt gekloneerd stroomafwaarts van het luciferase (Fluc) reporter leesraam vuurvlieg. De verslaggever nadelentruct wordt gecotransfecteerd met een query miRNA in HEK293T cellen. MiRNA targeting wordt bepaald door de relatieve verandering tussen de test fluctuaties :: 3'UTR reporter en een tweede niet-specifieke Renilla luciferase reporter. Belangrijk luciferase assays detecteren functionele miRNA / mRNA interacties die de translationele uitgang van de reporter beïnvloeden. Dit is een belangrijk voordeel ten opzichte van traditionele methoden miRNA regelgeving, zoals RT-qPCR en Western blots te detecteren, doordat deze omzeilt verschillen in mRNA degradatie en translationele repressie, evenals veranderingen in eiwitgehalte onafhankelijk van 3'UTR based regulation.
Luciferase assays worden algemeen gebruikt voor directe miRNA targets valideren vanwege hun relatieve eenvoud en gevoeligheid, maar hun gebruik in high-throughput screens wordt beperkt door de hoge kosten van de verbruikbare reagentia, het ontbreken van 3'UTR bibliotheken uit openbare bronnen, en het ontbreken gestandaardiseerde luciferase protocols, wat leidt tot moeilijkheden bij het vergelijken van functionele repressie over meerdere datasets. Om het gebruik van de 3'LIFE test te vergemakkelijken, hebben we de nadruk gelegd op de vereenvoudiging van de experimentele opzet, het gebruik van niet-commerciële transfectie 24 en luciferase reagentia 29, het creëren van een 3'UTR bibliotheek die regelmatig wordt bijgewerkt en uitgebreid, en is beschikbaar via een openbare plasmide repository 30.
De schaalbaarheid van de 3'LIFE assay maakt het screenen van een grote bibliotheek 3'UTR voor het richten van een bepaalde miRNA zonder voorspannen van het scherm richting bioinformatically geïdentificeerde genen. Naast het testen canonieke en voorspelde interacties, deze systematische aanpak maakt de identificatie van nieuwe targets aangedreven via niet-canonieke en / of species-specifieke interacties. Belangrijk is dat het effect van miRNA gericht op eiwitproductie algemeen verstaan te resulteren in bescheiden translationele repressie 15,31 </ Sup>, wat suggereert dat een primaire rol van miRNA regelgeving is te fine-tunen eiwit-uitgang, bescherming tegen afwijkende niveaus van genexpressie, en zorgen voor robuustheid aan specifieke programma's 32,33 cel. De gevoeligheid van de luciferase assay combinatie met de inherente aantal negatieve miRNA / mRNA interacties in het 3'LIFE scherm kan de detectie van subtiele effecten van miRNA gericht op een groot aantal genen en de identificatie van verschillende componenten van gen netwerken worden geregeld door een bepaalde miRNA 24.
Hier beschrijven we de 3'LIFE protocol, en tonen het is haalbaar door het screenen van twee goed gekarakteriseerde miRNAs, miR-10b en laat-7c tegen een panel van 275 menselijke 3'UTRs (figuur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Culture (24-48 uur voorafgaand aan transfectie)
- 24-48 uur voor transfectie zaad voldoende hoeveelheid HEK293T cellen op basis van het aantal 96-wells platen getransfecteerd.
Opmerking: Voor een constante transfecties plaat cellen op voldoende dichtheid begunstigen snelle verdeling, maar niet meer dan 70-90% confluentie op het moment van transfectie. - Elke 96-putjesplaat vereist 9 x 10 6 cellen (75.000 cellen per putje en 120 wells per plaat verantwoorden gebruik van reservoir en multichannel pipet). Bereken de verdubbelingstijd van HEK293-cellen (typisch ~ 20 uur), en zaad het geschikte aantal cellen met ten minste 9 x 10 6 cellen op het moment van transfectie verkrijgen. Een 145 mm ronde cultuur plaat is meestal voldoende voor 3 96-well transfecties wanneer gegroeid tot ~ 90% confluentie, met ~ 10% van de cellen die overblijven om een nieuwe plaat reseed.
2. Preparaat voor transfectie
_content "> NB: De bereiding van de buffers en nucleïnezuren in stap 2,0-2,2 moeten worden uitgevoerd in de dagen voorafgaand aan transfectie aangezien ter bereiding van deze reagentia tijdrovend kan zijn.- Human 3'UTR klonen die compatibel zijn met de 3'LIFE test zijn, zijn beschikbaar via een openbare plasmide repository 30. Zuiver DNA plasmide handmatig of met vloeibare handling robots. Gebruik een transfectie graad alkaline lysis mini-prep 96-well kit en volg de instructies van de fabrikant. Resuspendeer de gezuiverde vectoren ~ 100 ng / ul per putje.
OPMERKING: Onvoldoende luciferase signaal zal ontstaan als plasmide concentratie daalt tot onder 40 ng / ul. - Het verkrijgen van de pLIFE-miRNA vectoren 30 of kloon met behulp van de pijplijn in figuur 1B 24. Resuspendeer de vectoren in een concentratie van 500 ng / ul per miRNA en blanco controle plasmiden.
- Door de gevoeligheid van de nucleofection bufferomstandigheden voor datde totale hoeveelheid getransfecteerd materialen (inclusief cellen en plasmiden) niet meer dan 10% van de totale vloeistof in elke well van de 96-well plaat transfectie. Om dit te bereiken, concentreren de pLIFE-miRNA plasmide voorraad bij een concentratie van tenminste 500 ng / ul.
- Bereid 10x vuurvlieg luciferase buffer reagens (Tabel 1), en 1 x buffer Renilla luciferase reagentia (Tabel 2), die kan worden bewaard tot 6 maanden.
OPMERKING: De DTT in de vuurvlieg luciferase buffer moet worden opgeslagen in oplossing bij -20 ° C in één aliquots.
3. Bereid Na Artikelen onmiddellijk voorafgaand aan Transfection
- Bereid transfectie buffer met PBS, 1,5% HEPES, pH 7,0. Bereid dit vers, maar het kan worden bewaard tot 1 maand bij 4 ° C zonder merkbare afname in transfectie-efficiëntie. Bij het formuleren van buffer en plasmide DNA volumes, neem 120 reacties voor elke 96-well plaat om sufficiently goed voor fouten in pipetteren en het volume verloren met behulp van vloeibare reservoirs en multichannel pipetten. Aliquot 18 ul per putje transfectie buffer (120 put / 96-well plaat = 2,16 ml per plaat), en zet apart.
OPMERKING: De cel-elektroporatie-apparaat is zeer gevoelig voor de buffercondities gebruikt om cellen te transfecteren. Nauwkeurigheid bij het opstellen van buffers zal zorgen voor consistente prestaties van de apparatuur. Extra zorg moet worden genomen bij het uitvoeren van de bepaling om verdamping van buffers te voorkomen, in het bijzonder door het minimaliseren van de tijd die buffer is onbedekt gelaten in microcentrifuge buizen 96-well platen, reservoirs en elektrodeplaten. - Reserve vier putten voor de volgende controles, geen pLIFE-3'UTR (op de achtergrond van luciferasetest te meten), pLIFE-SV40 3'UTR (negatieve doel controle), positieve controle voor miRNA # 1, positieve controle voor miRNA # 2.
OPMERKING: Deze vectoren zijn publiekelijk beschikbaar 30. Als alternatief, een eerder gevalideerde doelwitkan worden gebruikt als een positieve controle. - Warm media, trypsine (0,25%) tot 37 ° C.
- Aan elke well van 96-well celkweek plaat, voeg 200 ul DMEM gesupplementeerd met 10% FBS, 1% Pen / Strep, en geplaatst in een 37 ° C incubator gedurende gebruik na transfectie.
- Schakel alle mobiele apparaten elektroporatie gevolgd door de ondersteunende software. Gebruik Pulse code FF120 voor HEK293T cellen en PBS / HEPES buffer.
4. Bereiding van plasmide DNA and Cell Mengsel
Opmerking: Het volgende protocol veronderstelt transfecteren drie 96-well platen in één experiment gedurende een scherm met twee miRNAs (miRNA- # 1 en # 2 miRNA-). Elke plaat correspondeert met dezelfde 96-well plaat pLIFE 3'UTR-plasmiden, en drie maal behandeld met pLIFE-miRNA-blank, pLIFE-miRNA- # 1 of pLIFE-miRNA- # 2.
- Bereid 3 voorraden pLIFE-miRNA + transfectie buffer voor elke miRNA. Deze voorraad zou goed zijn voor 50% (10 pl) van het totale volume van iederegoed, vermenigvuldigd met 120 waterputten. Zo moet elk aandeel 1,08 ml buffer + 120 ul plasmide DNA (pLIFE-miRNA) bevatten.
- Verwijder cellen van 145 mm kweekplaat onder elueren media, voorzichtig wassen met PBS, en behandelen met ~ 5 ml 0,25% trypsine gedurende 5 min bij 37 ° C. Neutraliseer trypsine met een gelijk volume medium en pellet cellen bij 300 g gedurende 5 min.
- Verwijder trypsine / media en resuspendeer pellet in ~ 5-10 ml media (afhankelijk van de celdichtheid en nauwkeurige reeks cel teller).
- Tellen cellen met behulp van een cel teller. Zorg ervoor dat de cellen zijn> 95% levensvatbare en binnen nauwkeurige bereik van de machine.
OPMERKING: Onnauwkeurige celtelling kan ontstaan door zeer hoge cel concentraties (> 6,0x 10 6 / ml). Celverhouding en / of verminderen transfectie efficiency: transfecteren te veel cellen kan drastisch efficiëntie van miRNA gericht door vermindering plasmide verminderen. - Aliquot drie buizen die elk 9 x 10 6 cellen, overeenkomend met de cellen rerplicht voor transfectie van een 96-putjesplaat. Spin cellen bij 300 g gedurende 3 min.
- Verwijder media. Zorg ervoor dat u zo veel media verwijderen met zo weinig mogelijk verstoring van de pellet als overtollige media transfectie-efficiëntie kan beïnvloeden.
- Resuspendeer cellen in 1,2 ml transfectie buffer / miRNA plasmide mengsel en zet apart.
- De volgende stappen detail hersuspensie van pLIFE-3'UTR plasmide transfectie buffer. Zoals dit in 96 puts platen, zorg om verdamping van buffer vermijden door afdekplaten te allen tijde.
- Met behulp van een multichannel pipet, bewegen 32,4 ul transfectie buffer in elk putje van een 96 goed PCR-plaat (9 ul [per transfectie] * 3 [platen] * 1.2 [om rekening te houden pipet fout]).
- Voeg 3,6 pi (~ 100 ng / ul) van mini-klaargestoomd pLIFE-3'UTR plasmide aan elk putje en meng.
- Pipetteer 10 ul van dit mengsel in elk putje van de 96-well plaat transfectie en deksel.
- Verplaats 1,2 ml van de eerste cel / buffer / pLIFE-miRNA plasmide mengsel in het reservoir. Meng goed.
- Voeg 10 ul van dit mengsel in de eerste 96-well transfectie plaat al 10 ul transfectie buffer / pLIFE-3'UTR bevatten. Meng goed door en neer te pipetteren meerdere malen.
OPMERKING: Gelijke celsuspensie in de buffer ook zorgen en grondige passage van de elektrische stroom door de cuvette en maximale transfectie-efficiëntie. - Plaats de 96-well transfectie plaat op de cel electroporation apparaat en initiëren transfectie.
- Zodra transfectie is voltooid, voeg 100 ul voorverwarmde media van 96-well kweekplaat in elk putje van de 96-well plaat transfectie en meng. Verplaats 100 pi uit elk putje in de 96-well cultuur plaat.
- Meng cellen kweekplaat met pipet verticaal in het midden van de put, en cellen de neiging te aggregeren op de zijkanten van het well tenzij goed gemengd.
- Herhaal 5,1-5,5 voor de resterende twee platen.
- Reinigen van 96-well transfectie plaat
- De 96-well platen transfectie kan worden gerecycled door wassen met 70% EtOH geen overdracht overdracht van nucleïnezuren tussen proeven te garanderen. Voer twee 70% EtOH wassen met behulp van een spray fles volledig te vullen elk putje, gevolgd door vegen neer overtollige EtOH op de elektrode strips (onderkant) en waardoor de transfectie platen volledig droog in de cultuur kap.
LET OP: We hebben getest op carry-over DNA besmetting door transfecteren 12 putten met 2 ug pmaxGFP elk in HEK293T cellen plasmide, gevolgd door een enkele wassing met 70% EtOH, en een tweede transfectie zonder plasmide DNA. Met deze extreem hoge plasmideconcentratie, extreem heldere reporter en een één wasbeurt werd geen fluorescentie waargenomen in elk van de 12 herhaalde transfecties.
- De 96-well platen transfectie kan worden gerecycled door wassen met 70% EtOH geen overdracht overdracht van nucleïnezuren tussen proeven te garanderen. Voer twee 70% EtOH wassen met behulp van een spray fles volledig te vullen elk putje, gevolgd door vegen neer overtollige EtOH op de elektrode strips (onderkant) en waardoor de transfectie platen volledig droog in de cultuur kap.
- Kweekcellen gedurende 48-72 uur bij 37 ° C, gevolgd door de dubbele lucifwissen assay.
6. cellysaat Voorbereiding voor luciferasetest
- Verdunnen lysisbuffer met 4 delen water, 1 deel 5x passieve lysisbuffer in een reservoir. Bereken 26 ul / putje, het toevoegen van ~ 20 extra volumes om rekening te houden met het verlies in het reservoir.
OPMERKING: Buffer wordt opgeslagen bij -20 ºC en kan zeer viskeuze, dus vóór waardoor de 5x buffer op kamertemperatuur te benaderen zullen de nauwkeurigheid pipetting verbeteren. - Analyseer elk putje voor transfectie efficiëntie met behulp van fluorescentie microscopie. Opmerking inconsistenties in putten die niet efficiënt was transfecteren (> 90% transfectie efficiëntie) of tot expressie lage RFP indicatief overbevolking of media uitputting. Verwijder deze putten uit de analyse.
- Volledig te verwijderen van de media uit de cellen, en let niet te snel te elueren die zal leiden tot cellen los te maken.
OPMERKING: De resterende media zal het lysaat en veroorzaken schommelingen verdunnen in waarden over experimegen. - Voeg 26 ul van lysis buffer aan elk putje, en leg ze op een bord shaker / rocker bij lage / matige snelheid ~ 20-30 min. Gebruik deze tijd voor te bereiden luciferase buffers, wassen en prime de luminometer (s), en breng lysaat te ondoorzichtig meting platen.
7. Dual Luciferase Assay
OPMERKING: Als er meerdere platen worden gemeten opeenvolgend op een luminometer, maak buffer mastermengsels met alles behalve ATP en substraten, het toevoegen van deze reagentia, gevolgd door aanpassing van de pH direct voor gebruik met elke plaat. ATP en substraten kan na verloop van tijd; consistentie in de hoeveelheid tijd die deze reagentia zijn in de buffer zal consistentie over meerdere platen te verbeteren.
- Bereid 1x luciferase buffers (tabel 1):
- Wikkel twee buizen (meestal 15/50 ml centrifugebuizen) met de vuurvlieg en Renilla buffers met aluminiumfolie, als substraten licht gevoelig kan zijn.
- Bereid 1x vuurvliegluciferase buffer. Voeg 1 ml van elk vijf 10x vuurvlieg luciferase reagentia toevoegen EGTA eindelijk tot 5 ml H 2 0 tot een uiteindelijke concentratie van 1x.
- Voeg 0,025 g ATP 10 ml 1x vuurvlieg buffer. Meng door een paar keer om te keren. Blijf ATP op ijs te allen tijde. ATP zal degraderen, dus als het meten van meer dan één plaat sequentieel, moet buffer worden gemaakt van verse begin bij deze stap voor elke extra bord.
- Voeg 100 ul van 100 beetle luciferine (substraat) (Tabel 1) Buffer zou moeten veranderen tot geelachtige kleur op basis van pH.
- 1x Renilla luciferase buffer reconstitutie: Per 96 putjes, 10 ml aliquot van 1 "Renilla buffer".
- Voeg 100 ul van BSA (44 mg / ml voorraad).
- Als screening meer dan één plaat, aparte master mix in 10 ml porties.
- Voeg 100 ul van coelenterazine buffer (vooraf in porties verdeeld en bewaard bij 100x conc.)
<li> pH 1x instellen firefly bufferen tot 8,0, gevolgd door 1 x Renilla buffer 5,0 behulp NaOH en HCl.
OPMERKING: De activiteit van elke buffer en het vermogen van de Renilla buffer Firefly luciferaseactiviteit doven is sterk afhankelijk van de pH. Om consistente resultaten uiterst nauwkeurig in deze stap. - Breng inhoud van elke buffer (overeenkomend met 1 96-well plaat) tot 10,5 ml om tegemoet te luminometer priming.
- Selecteer de putten zijn tseerd (alle putjes is de standaardinstelling).
- Verleng de 'Vertraging voor de meting' instelling tot 5 seconden, met een 10 seconden meettijd (zie 29 voor uitleg).
- Capillaire wasstappen: water 3x, EtOH 3x, water 3x, droog 3x. Prime buffers eenmaal in het afval, en vervolgens prime een tweede keer terug in de bufferbuizen om ervoor te zorgen mengen. Spuit de vuurvlieg buffer eerste en vul het in de linker capillaire, gevolgd door Renilla in de juiste capillair.
OPMERKING: Meerdere platen kunnen worden gelezen en opgeslagen gegevens op dezelfde Excel-bestand echter problemen kunnen voordoen met meerdere plaat leest waar de lichtmeter programma zal crashen. Zorg ervoor dat u alle gegevens op te slaan tussen de metingen en neem screenshots als programma crasht voordat save mogelijk is.
- Vervang oude buffersmet nieuwe, waarbij u prime minstens tweemaal met nieuwe buffers voordat de nieuwe plaat.
8. Data Analyse
- Maak gebruik van Excel-tabellen "3'LIFE - enkele plaat analyse" en "3'LIFE - meervoudige analyse" verkrijgbaar bij www.mangonelab.com . Kopieer ruwe data voor vuurvlieg en Renilla luciferase metingen van luminometer output file naar locaties die overeenkomen met de negatieve voorwaarde, miRNA # 1, en miRNA # 2 in de "3'LIFE - enkele plaat analyse" spreadsheet.
- Het spreadsheet berekent automatisch vuurvlieg / Renilla ratio en normaliseren elke miRNA om de juiste negatieve controle, en normaliseren repressie waarden in elke plaat.
LET OP: Deze spreadsheet wordt automatisch putten met lage luciferase signaal te identificeren, markeert aanzienlijk onderdrukte putten, en zorgen voor maatregelen van repressiop in de hele plaat. Zie 24 voor een gedetailleerde uitleg van statistische analyse.- Kopieer de waarden uit de box "genormaliseerde RI Index", in de overeenkomstige cellen in de "3'LIFE - meervoudige analyse" spreadsheet op de positie die overeenkomt met repliceren # 1 voor elke miRNA getest. Herhaal voor alle biologische herhalingen uitgevoerd op verschillende dagen.
- Indien gewenst, plaatst het gen namen en target voorspelling staat in de kolommen B en D, respectievelijk.
- Laat de spreadsheet berekent automatisch het gemiddelde van alle plaat. Neem de data in 96 putjes als warmtebron kaart (figuur 2). Het bestand regelt ook de gegevens als een lijst (figuur 2).
LET OP: De repressie index is het gebruikt om vermeende miRNA targets te identificeren maatregel. Verschillende stringentie parameters kunnen worden gebruikt, gebaseerd op persoonlijke voorkeuren. Gemiddeld beschouwen we waarschijnlijk klappen onder repressie index van 0.8 en statistisch significant door t-test (p-waarde <0,05). Zoals getoond in figuur 3 potentiële doelen op basis van deze criteria wordt rood gemarkeerd.
- Laat de spreadsheet berekent automatisch het gemiddelde van alle plaat. Neem de data in 96 putjes als warmtebron kaart (figuur 2). Het bestand regelt ook de gegevens als een lijst (figuur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De luminometer output bestand bevat ruwe metingen voor zowel vuurvlieg en Renilla luciferase eiwitten. Deze RAW-formaat is compatibel met de "3'LIFE - enkele plaat analyse" en "3'LIFE - meervoudige analyse" spreadsheets beschikbaar op de Mangone lab website ( www.mangonelab.com ). De enkele plaat analyse spreadsheet berekent automatisch vuurvlieg / Renilla ratio, normaliseert elke miRNA om de juiste negatieve controle, en normaliseert repressie waarden in elke plaat. Deze spreadsheet automatisch geïdentificeerd putjes met lage Renilla luciferase-signaal wordt toegelicht bronnen die repressie vertonen in vergelijking met de negatieve controle en geeft dwangmaatregelen over het gehele bord (figuur 2). Zie 24 voor een gedetailleerde uitleg van statistische analyse.
Meerdere herhalingen kan worden geanalyseerdd met de "meervoudige analyse" spreadsheet. Elke duplo wordt vergeleken naast elkaar en statistische maten van de gegevens worden automatisch berekend (figuur 3). Naast het vergelijken van replica's van de "Normalized Repression" kolommen kan de gebruiker repressie tussen beide miRNAs vergelijken onder "miRNA # 1 / miRNA # 2" kolommen. Deze maatregel verdeelt de repressie wordt voor elke miRNA voor elke duplo. Deze maatregel kan aangeven foutieve waarden uit de luciferase assay (bijvoorbeeld abnormaal hoge of lage waarden van de negatieve controle, zie figuur 3, rij A9, Rep # 3), en putten waarin de onderdrukking index aanzienlijke onderdrukking niet kan aangeven, maar die wel vertonen significante verschillen tussen de miRNAs. Hoewel deze maatregel niet rechtstreeks kan worden gebruikt om een miRNA doelwit aanduiden, is bruikbaar voor het identificeren uitschieters problematisch putten, of patronen in de data die niet alleen worden toegeschreven aan directe miRNA regulation.
De repressie Index (RI) wordt gebruikt om een vermeende miRNA oproepnummer, met lagere waarden die overeenkomen met hogere relatieve onderdrukking. De drempel voor het oproepen vermeende targets is gebaseerd op het niveau van stringentie die door de onderzoeker, maar gecombineerd met de RI 3'UTRs die statistisch significant p-waarde (p <0,05) scherm toont groot vertrouwen targets (zie figuur 2 rijen en B8 B12).
Figuur 1: 3'LIFE Assay (A). Gateway verenigbare vectoren die in de 3'LIFE assay. Top: Het luciferasegen (fluctuaties) gefuseerd aan de test 3'UTR, terwijl de Renilla luciferase-gen (RLuc) gefuseerd aan de onspecifieke SV40 pA 3'UTR als controle. Bottom: De RFP- miRNA-intron vector - De sonde pre-miRNA, plus ~ 400nucleotiden binnen de genomische locus (endogene miRNA verwerking recapituleren), wordt gekloond in een intron aan zijn co-expressie met DsRed2 fluorchroom mogelijk te maken. Beide vectoren zijn publiekelijk beschikbaar (Seiler et al., 2013). (B) Stroomschema van de 3'LIFE Assay. (C) 3'LIFE pijplijn duale luciferase vector verpakte monster 3'UTR met of zonder miRNA vectoren worden tezamen getransfecteerd in HEK293-cellen in 96-well platen. De wisselwerking tussen het miRNA en een bona fide 3'UTR doel de relatieve luminescentie bij specifieke putjes (geïllustreerd door de oranje vlek in de experimentele plaat) verlagen.
Figuur 2: Voorbeeld van gegevens die met 3'LIFE assay. Elke probe miRNA in viervoud getest (replicaten 1-4). Kleuren vertegenwoordigen repressie niveaus, met rodekleuren aangeeft sterke miRNA / 3'UTR interactie. Alle herhalingen worden gemiddeld om hoogwaardige vermeende targets getoond in de samenvatting plaat onder de gele pijl te produceren. Witte doos vertegenwoordigen controles, mislukte transfecties of putten met een lage transfectie-efficiëntie.
Figuur 3:. Tabel vertegenwoordigt samenvattingsgegevens uit een subset interacties geproduceerd volgens 3'LIFE spreadsheet De verdringing waarden zijn in figuur 2. De software berekent standaardafwijking, standaardfout en z-score voor elke interactie. Statistisch significante interacties zijn rood gemarkeerd. De laatste vier rijen tonen relatieve onderdrukking van een miRNA naar de andere en wordt gebruikt als secundaire indicator repressie vergelijken tussen twee verschillende miRNAs. De spreadsheet kan worden gedownload van www.mangonelab.com
| Vuurvliegluciferase buffer reagentia | Eindconcentratie (1x) |
| Glycylglycine | 25 mM |
| K x PO 4 (pH 7,8) | 15 mM |
| MgSO 4 | 15 mM |
| DTT (winkel op 4º) | 1 mM |
| EGTA | 4 mM |
| ATP * | 2 mM |
| Kever luciferine * | 250 pM |
Tabel 1: De firefly luciferase reagentia: 10x Voorraadoplossingen van Glycylglycine, K x PO 4, MgSO 4, DTT en EGTA kunnen afzonderlijk worden vervaardigd en opgeslagen vóór reconstitutie buffer. 100x Beetle Luciferine (vuurvliegluciferase substraat) kunnen slaan wordend door het oplossen van 50 mg luciferine in 7,134 ml H 2 0 (25 mM). Aliquot 105 ul / plaat opgeloste Kever luciferine in buizen en op te slaan bij -80 ºC. Per Promega ondersteuning, dient deze stabiel gedurende> 6 maanden, maar kan licht gevoelig. OPMERKING: EGTA zal niet in oplossing bij neutrale pH te gaan. Langzaam NaOH toevoegen EGTA totdat het volledig oplost. * Reagentia toegevoegd aan de uiteindelijke buffer onmiddellijk voorafgaande aan de luciferase assay
| Renilla luciferase buffer reagentia | Eindconcentratie (1x) |
| NaCl | 1.1 M |
| Na 2 EDTA | 2,2 mM |
| KH 2 PO 4 | .22 M |
| NaN 3 | 1,3 mM |
| BSA * | 0,44 mg / ml |
| Coelenterazine * | 2,5 & #956; M |
Tabel 2: De Renilla luciferase buffer Reagentia Alle reagentia behalve BSA en Coelenterazine kunnen worden gemengd bij een 1 x concentratie en bewaard bij kamertemperatuur. Coelenterazine kan in verzuurde methanol worden opgelost en gealiquoteerd per plaat. Zuur methanol door toevoeging van HCl tot een eindconcentratie van 5 mM (<pH 3). Los 250 ug coelenterazine in 2,36 ml aangezuurde methanol (250 pm) monster 105 ul / plaat. Het mengsel is stabiel gedurende tenminste 6 maanden, maar kan licht gevoelig. * Reagentia toegevoegd onmiddellijk gebufferd voordat luciferase assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De 3'LIFE test identificeert functionele miRNA doelen in 3'UTRs in high-throughput. Deze test is bruikbaar voor onderzoekers die experimenteel identificeren van een groot aantal mogelijke doelwitten voor de miRNA plaats. De 3'LIFE assay is een krachtige benadering moet worden gezocht naar 3'UTR gedreven regulering, dat de test verschaft een maat voor de functionele miRNA targeting, en de binaire testen van een reporter :: 3'UTR tegen een enkele miRNA kan vertrouwen richten de targeting status van de individuele genen. Om deze aanpak te valideren, gescreend we een panel van 275 3'UTRs en tegen twee miRNAs, laat-7c en miR-10b, en omvatte 10 eerder gevalideerd target genen in deze bibliotheek. Acht van deze tien genen tentoongesteld repressie 24. We zagen ook een aanzienlijke verrijking van gevalideerde bioinformatically voorspelde targets en onverwachte 3'UTRs dat canonieke zaad elementen onder onze top hits bevatten, sugRekenhof dat 3'LIFE in staat is om het identificeren van bonafide miRNA targets.
Een belangrijke indicator van de gevoeligheid van high-throughput-schermen is de valse positieve en valse negatieve tarieven. Terwijl de valse positieve tarief van deze test moet worden geëvalueerd met behulp van aanvullende alternatieve benaderingen klappen te valideren, acht van de tien positieve controles opgenomen in onze proof-of-principle scherm exposeerde repressie, hetgeen duidt op een vals-negatieve tarief van 20%. Echter, veel technieken om miRNA doelen in verschillende cellulaire contexten herkennen en 3'UTR verwerking en regulering van trans-werkende factoren is bekend dat zeer weefselspecifiek zijn. Bijvoorbeeld, de meeste 3'UTRs bevatten meerdere polyadenylatieplaatsen, die de lengte van de 3'UTR van het rijpe mRNA regelen. In veel gevallen kan het gebruik van proximale polyadenyleringsplaatsen weefselspecifiek, en kunnen miRNA doelwitplaatsen sluiten. Bovendien, coöperatieve miRNA targeting, concurrentie with-RNA-bindende eiwitten en mRNA secundaire structuur kunnen alle invloed van het vermogen van 3'LIFE om miRNA targets te ontdekken in specifieke weefsels. Hierdoor kan de detectie van targets door 3'LIFE assay is afhankelijk van de cellulaire context waarin de test wordt uitgevoerd, bemoeilijkt de evaluatie van absolute fouten. Dit protocol is geoptimaliseerd voor HEK293T cellen, maar andere cellijnen kunnen worden gebruikt als de onderzoeker wenst de assay uit te voeren in een specifieke biologische context. Toch zal de optimalisatie van transfectie efficiency en celoverleving bij elke cellijn moeten worden geoptimaliseerd met behulp van meerdere buffercondities, pulse codes en aantal cellen. Een voorbeeld van een optimalisatie regeling kan worden gevonden op Wolter et al. 24.
Dit protocol werd geoptimaliseerd in 96-well formaat en specificeert het gebruik van bepaalde high-throughput instrumentatie. In het geval dat de instelling niet de vereiste 96-apparatuur beschikken-goed Nucleofectie alternatieve transfectie reagentia kunnen worden gebruikt om de 3'LIFE analyse uit te voeren, zolang de transfectie-efficiëntie hoog blijft. Daarnaast is de luciferase assay de meest tijdrovende aspect van de 3'LIFE assay. Als zodanig is het gebruik van meerdere luminometers aanbevolen voor high-throughput screens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| glycylglycine | Sigma | G1127-25G | |
| Kx PO4 | Sigma | P2222 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| ATP | Sigma | FLAAS | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| CoA | Sigma | C4282 | |
| luciferin | Sigma | L9504 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2EDTA | Sigma | E0399 | |
| K H2 P O4 | Sigma | 1551139 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Coelenterazine | Sigma | C3230 | |
| PBS/HEPES | Corning | 21-040-CV | |
| DMEM | Sigma | D5546 | |
| FBS | Sigma | F2442 | |
| Pennicilin/Streptomicin | Sigma | P4333 | |
| Trypsin | T2600000 | ||
| Consumables | |||
| MaxiPrep Kit | Promega | A2392 | |
| 96-well miniprep plate | Pall | 8032 | |
| 96-well shuttle plates | Lonza | V4SP-2096 | |
| 5x Lysis Buffer | Promega | E1941 | |
| Instruments | |||
| 96-well GloMax Plate Reader | Promega | E9032 | |
| Biomech FX Liquid Handler Robot | Beckmann | A31842 | |
| 4D-Nucleofector Core Unit | Lonza | AAF-1001 | |
| 96-well Shuttle System | Lonza | AAM-1001 | |
| Cell Counter Countess | Invitrogen | C10227 |
References
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Pasquinelli, A. E., et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408 (6808), 86-89 (2000).
- Reinhart, B. J., Weinstein, E. G., Rhoades, M. W., Bartel, B., Bartel, D. P.
- Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 2 (3), 219-229 (2008).
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Wienholds, E., et al. MicroRNA expression in zebrafish embryonic development. Science. 309 (5732), 310-311 (2005).
- Darnell, D. K., et al. MicroRNA expression during chick embryo development. Dev Dyn. 235 (11), 3156-3165 (2006).
- Jin, P., Alisch, R. S., Warren, S. T. RNA and microRNAs in fragile X mental retardation. Nat Cell Biol. 6 (11), 1048-1053 (2004).
- Kim, J., et al. A MicroRNA feedback circuit in midbrain dopamine neurons. Science. 317 (5842), 1220-1224 (2007).
- Poy, M. N., et al. A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion. Nature. 432 (7014), 226-230 (2004).
- Calin, G. A., Croce, C. M.
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
- Paraskevopoulou, M. D., et al. DIANA-microT web server v5.0: service integration into miRNA functional analysis workflows. Nucleic Acids Res. 41 (Web Server issue), W169-W173 (2013).
- Krek, A., et al.
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3'UTR. Genes Dev. 18 (2), 132-137 (2004).
- Lal, A., et al. miR-24 Inhibits cell proliferation by targeting E2F2, MYC, and other cell-cycle genes via binding to 'seedless' 3'UTR microRNA recognition elements. Molecular Cell. 35 (5), 610-625 (2009).
- Cevec, M., Thibaudeau, C., Plavec, J. N. M. R. NMR structure of the let-7 miRNA interacting with the site LCS1 of lin-41 mRNA from Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 38 (21), 7814-7821 (1093).
- Shin, C., et al. Expanding the microRNA targeting code: functional sites with centered pairing. Molecular Cell. 38 (6), 789-802 (2010).
- Azzouzi, I., et al. MicroRNA-96 directly inhibits gamma-globin expression in human erythropoiesis. PLoS One. 6 (7), e22838 (2011).
- Chen, J., et al.
- Chi, S. W., Hannon, G. J., Darnell, R. B. An alternative mode of microRNA target recognition. Nat Struct Mol Biol. 19 (3), 321-327 (1038).
- Jiao, L. R., et al. MicroRNAs targeting oncogenes are down-regulated in pancreatic malignant transformation from benign tumors. PLoS One. 7 (2), e32068 (2012).
- Wolter, J. M., Kotagama, K., Pierre-Bez, A. C., Firago, M., Mangone, M. 3'LIFE: a functional assay to detect miRNA targets in high-throughput. Nucleic Acids Res. , (2014).
- Mangone, M., et al. The landscape of C. elegans 3'UTRs. Science. 329 (5990), 432-435 (2010).
- Ekdahl, Y., Farahani, H. S., Behm, M., Lagergren, J., Ohman, M. A-to-I editing of microRNAs in the mammalian brain increases during development. Genome Res. 22 (8), 1477-1487 (2012).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m(6)A RNA methylation. Nat Rev Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
- Zhou, P., et al. Large-scale screens of miRNA-mRNA interactions unveiled that the 3'UTR of a gene is targeted by multiple miRNAs. Plos One. 8 (7), e68204 (2013).
- Dyer, B. W., Ferrer, F. A., Klinedinst, D. K., Rodriguez, R. A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis. Anal Biochem. 282 (1), 158-161 (2000).
- Seiler, C. Y., et al. DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research. Nucleic Acids Res. , (2013).
- Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455 (7209), 64-71 (2008).
- Ebert, M. S., Sharp, P. A. Roles for MicroRNAs in Conferring Robustness to Biological Processes. Cell. 149 (3), 515-524 (2012).
- Pelaez, N., Carthew, R. W. Biological robustness and the role of microRNAs: a network perspective. Current Topics in Developmental Biology. 99, 237-255 (2012).
