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Biology

3'LIFE परख का उपयोग उच्च throughput में miRNA लक्ष्य की जांच

Published: May 25, 2015 doi: 10.3791/52647
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2, 1,2
1School of Life Sciences, Arizona State University, 2Biodesign Institute, Arizona State University

Abstract

3'UTRs में कार्यात्मक तत्वों का Luminescent पहचान (3'LIFE) पूछे 3'UTRs के सैकड़ों की एक सरणी के भीतर विशिष्ट miRNAs की लक्ष्य की तेजी से पहचान की अनुमति देता है। लक्ष्य की पहचान miRNA को निशाना बनाने का एक कार्यात्मक readout दे रही है, translational उत्पादन को मापने के द्वारा mRNA के स्तर पर बाध्यकारी पता लगाता है दोहरे luciferase परख, पर आधारित है। 3'LIFE जीनोम चौड़ा स्क्रीन बनाने गैर मालिकाना buffers और अभिकर्मकों, और सार्वजनिक रूप से उपलब्ध संवाददाता पुस्तकालयों का उपयोग करता है संभव है और लागत प्रभावी है। 3'LIFE एक मानक प्रयोगशाला की स्थापना में या तो प्रदर्शन किया या तरल से निपटने रोबोट और अन्य उच्च throughput उपकरण का उपयोग को बढ़ाया जा सकता है। हम मानव 96 अच्छी तरह से प्लेट में क्लोन 3'UTRs, और दो ​​टेस्ट miRNAs की एक डाटासेट का उपयोग कर दृष्टिकोण को वर्णन, जाने-7C और मीर-10b। हम 96 अच्छी तरह प्रारूप में डीएनए तैयारी, अभिकर्मक, सेल संस्कृति और luciferase assays के प्रदर्शन, और डेटा के लिए उपकरण उपलब्ध कराने के लिए प्रदर्शनविश्लेषण। अंत में 3'LIFE अत्यधिक, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तेजी, व्यवस्थित है, और उच्च आत्मविश्वास लक्ष्यों की पहचान करता है।

Introduction

इस विधि के समग्र लक्ष्य का पता लगाने और ठीक उच्च throughput में माइक्रो RNA (miRNA) के लक्ष्यों को मैप करने के लिए है। MiRNAs ~ लंबाई में 22 न्यूक्लियोटाइड अंतर्जात गैर-कोडिंग RNAs हैं। प्रतिलेखन और प्रसंस्करण के बाद, परिपक्व miRNAs एक प्रोटीन परिसर में शामिल कर रहे हैं जटिल (RISC) मुंह बंद करने के लिए प्रेरित शाही सेना को बुलाया। प्रत्येक miRNA के अनुवाद दमन या mRNA दरार 1 या तो है, जिसके परिणामस्वरूप मुख्य रूप दूत RNAs के 3'untranslated क्षेत्रों (3'UTRs) (mRNAs) में स्थित तत्वों को लक्षित करने के लिए RISC मार्गदर्शन करता है। यू आधार बाँधना लड़खड़ा रहे हैं, और पतित प्रकृति में, कई बेमेल आधार जोड़े युक्त और क्षेत्रों bulged: Mirna मानक वाटसन-क्रिक और जी के आधार पर लक्ष्य साइटों को पहचानते हैं। कई miRNAs मोटे तौर पर वे जैविक भूमिकाओं में से एक विविध रेंज खेलने जहां मनुष्य 2,3, पौधों से संरक्षित कर रहे हैं। मेटाजोअन में miRNAs सेल भाग्य का निर्णय 4, विकासात्मक समय 5 सहित कई जैविक प्रक्रियाओं को प्रभावित कर सकते हैं 6,7 दिखा रहे हैं। Mirna misexpression भी लक्ष्य जीन के समारोह पर पूरी तरह आधारित सेल व्यवहार पर काफी प्रभाव पड़ सकता है, जो न्यायपालिका जीन विनियमन, में परिणाम कर सकते हैं। जैसे, miRNAs neurodegeneration 8,9, मधुमेह और कैंसर के 10 से 11 सहित रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला से जुड़ी हैं। पहले से पंजीकृत है और गीला-बेंच दृष्टिकोण प्रत्येक miRNA के उच्च throughput या जीनोम विस्तृत दृष्टिकोण संभावित बातचीत के इस बड़े पूल की जांच के लिए आवश्यक हैं यह दर्शाता है कि अलग mRNAs 12-14 के हजारों सैकड़ों को लक्षित करने में सक्षम हो सकता है कि सुझाव।

लक्ष्य जीन की पहचान mechanistically को परिभाषित miRNA समारोह का एक महत्वपूर्ण घटक है, और ऐसा करने के लिए शोधकर्ताओं ने एक बड़े पैमाने पर लक्ष्य प्रकट करने के लिए सक्षम होना चाहिए। कई दृष्टिकोण पहले से पंजीकृत भविष्यवाणी एल्गोरिदम सहित miRNA लक्ष्यों की पहचान करने के लिए विकसित किया गया है, उच्च throughput अनुक्रमणके mRNAs को निशाना बनाया, और संवाददाता assays के आधार पर। इन तरीकों में से प्रत्येक निहित शक्तियों और कमजोरियों है। MiRNA लक्ष्य-निर्धारण अनुक्रम विशिष्टता द्वारा निर्देशित है यह देखते हुए कि, सबसे विशेष रूप से न्यूक्लियोटाइड miRNA की 2-6 की, कई एल्गोरिदम कई जीवों के जीनोम भर miRNA लक्ष्य भविष्यवाणी करने के लिए विकसित किया गया है (बीज क्षेत्र कहा जाता है)। इन एल्गोरिदम मान्य miRNA लक्ष्य का मनाया आधार बाँधना रूपांकनों का उपयोग करने के लिए प्रशिक्षित है, और अक्सर इस तरह के कड़े बीज बाँधना, साइट संरक्षण, और / या Thermodynamic स्थिरता के रूप में 15 मापदंडों का उपयोग कर रहे हैं। इन फिल्टर केवल उच्च आत्मविश्वास लक्ष्य के लिए पर्याप्त पूरकता के साथ ख्यात लक्ष्य की बड़ी संख्या को परिष्कृत करते हैं, वे हाल ही में सबूत 16-24 बड़े पैमाने पर कर रहे हैं, जो पता चलता प्रजातियों विशिष्ट और गैर विहित miRNA लक्ष्य साइटों, बाहर कर सकते हैं। इसके अलावा, इन भविष्यवाणियों ऐसे वैकल्पिक polyadenylation के रूप में miRNA लक्ष्य साइटों, बाहर करते हैं कि mRNA के प्रसंस्करण के खाते तंत्र में नहीं लेते25, आरएनए संपादन 26, शाही सेना मिथाइलेशन 27, और सहकारी बंधन। जैसे, उच्च झूठी सकारात्मक और नकारात्मक झूठी दरों कई एल्गोरिदम 22,24,28 के लिए सूचित किया गया है। इन एल्गोरिदम बाद प्रायोगिक सत्यापन के लिए उम्मीदवार miRNA लक्ष्यों की पहचान करने के लिए उपयोगी होते हैं, इन उच्च त्रुटि दर व्यवस्थित miRNA लक्ष्य का पता लगाने के लिए पहले से पंजीकृत दृष्टिकोण की प्रभावकारिता को सीमित।

योजनाबद्ध तरीके से एक दिया miRNA के बीच बातचीत और संभावित रूप से लक्षित 3'UTRs के लिए जांच करने के लिए हम 3'UTRs (3'LIFE) 24 में कार्यात्मक तत्वों का Luminescent पहचान नामक एक उच्च throughput परख विकसित किया है। यह परख उपायों प्रत्यक्ष बातचीत और एक दोहरी luciferase संवाददाता प्रणाली का उपयोग करते हुए एक क्वेरी miRNA द्वारा परीक्षण 3'UTR के translational दमन। इस प्रणाली में, ब्याज की एक जीन की 3'UTR जुगनू luciferase (fluc) संवाददाता पढ़ने फ्रेम के बहाव के क्लोन है। संवाददाता विपक्षtruct HEK293T कोशिकाओं में एक क्वेरी miRNA के साथ cotransfected है। Mirna लक्ष्य-निर्धारण परीक्षण fluc :: 3'UTR रिपोर्टर और एक दूसरे गैर विशिष्ट Renilla luciferase संवाददाता के बीच सापेक्ष परिवर्तन को मापने के द्वारा निर्धारित किया जाता है। महत्वपूर्ण बात है, luciferase assays के रिपोर्टर के translational उत्पादन को प्रभावित करने वाले कार्यात्मक miRNA / mRNA के बातचीत का पता लगाने। मतलब यह है कि इस 3'UTR आधारित विनियमन के स्वतंत्र प्रोटीन बहुतायत में mRNA गिरावट और translational दमन में मतभेद है, साथ ही परिवर्तन नजरअंदाज में, इस तरह के आर टी-qPCR और पश्चिमी दाग ​​के रूप में miRNA के विनियमन, पता लगाने के लिए पारंपरिक तरीकों के ऊपर एक महत्वपूर्ण लाभ है।

Luciferase assays के लिए व्यापक रूप से उपभोज्य अभिकर्मकों के साथ जुड़े उच्च लागत द्वारा सीमित है क्योंकि उनके रिश्तेदार सादगी और संवेदनशीलता, अभी तक उच्च throughput स्क्रीन में उनके उपयोग के प्रत्यक्ष miRNA लक्ष्य को मान्य करने के लिए उपयोग किया जाता है, सार्वजनिक स्रोतों से 3'UTR पुस्तकालयों की कमी है, और अभाव मानकीकृत luciferase prot कीocols, कई डेटासेट भर में कार्यात्मक दमन की तुलना में कठिनाइयों के लिए अग्रणी। 3'LIFE परख के उपयोग की सुविधा के लिए, हम नियमित रूप से अद्यतन और विस्तारित किया है, जो एक 3'UTR पुस्तकालय बनाने, प्रयोगात्मक डिजाइन, गैर वाणिज्यिक अभिकर्मक 24 और luciferase अभिकर्मकों 29 के उपयोग के सरलीकरण पर जोर दिया है, और के माध्यम से उपलब्ध है एक सार्वजनिक प्लाज्मिड रिपोजिटरी 30।

3'LIFE परख के scalability bioinformatically पहचान जीन की ओर स्क्रीन biasing बिना किसी दिए गए miRNA द्वारा लक्षित करने के लिए एक बड़ी 3'UTR पुस्तकालय की स्क्रीनिंग की अनुमति देता है। विहित और भविष्यवाणी की बातचीत का परीक्षण करने के अलावा, इस व्यवस्थित दृष्टिकोण गैर विहित और / या प्रजातियों विशिष्ट बातचीत के माध्यम से संचालित उपन्यास लक्ष्यों की पहचान की अनुमति देता। महत्वपूर्ण बात है, प्रोटीन के उत्पादन पर लक्षित कर miRNA के प्रभाव आम तौर पर मामूली translational दमन 15,31 <परिणाम में समझा जाता है/ Sup>, miRNA के विनियमन के एक प्राथमिक भूमिका, प्रोटीन उत्पादन ठीक धुन जीन अभिव्यक्ति की न्यायपालिका के स्तर के खिलाफ की रक्षा, और विशिष्ट कार्यक्रमों 32,33 सेल मजबूती प्रदान करने के लिए है कि सुझाव दे। 3'LIFE स्क्रीन में नकारात्मक miRNA / mRNA के बातचीत के स्वाभाविक बड़ी संख्या के साथ संयुक्त luciferase परख की संवेदनशीलता miRNA के जीन की एक बड़ी संख्या को निशाना बनाने का सूक्ष्म प्रभाव का पता लगाने, और जीन नेटवर्क के कई घटकों की पहचान की अनुमति देता है कि एक दिया miRNA के 24 द्वारा विनियमित रहे हैं।

यहाँ हम 3'LIFE प्रोटोकॉल का वर्णन है, और 275 मानव 3'UTRs (चित्रा 1) के एक पैनल के खिलाफ दो अच्छी तरह से विशेषता miRNAs, मीर-10b और जाने-7C स्क्रीनिंग द्वारा यह व्यवहार्यता है प्रदर्शित करता है।

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Protocol

1. सेल संस्कृति (24-48 घंटा अभिकर्मक से पूर्व)

  1. पूर्व अभिकर्मक बीज को 24-48 घंटा 96 अच्छी तरह से प्लेटों की संख्या के आधार पर HEK293T कोशिकाओं की पर्याप्त मात्रा ट्रांसफ़ेक्ट किया जा रहा है।
    नोट: लगातार transfections के लिए, एक पर्याप्त घनत्व पर थाली कोशिकाओं तेजी से विभाजन के पक्ष में है, अभी तक अभिकर्मक के समय में एक से अधिक 70-90 confluency% से कम नहीं।
  2. प्रत्येक 96 अच्छी तरह से थाली (जलाशय और multichannel विंदुक के उपयोग के लिए खाते में अच्छी तरह से प्रति 75,000 कोशिकाओं, और प्रति प्लेट 120 कुओं) 9 एक्स 10 6 कोशिकाओं की आवश्यकता है। HEK293 कोशिकाओं (आमतौर पर ~ 20 घंटा) की दुगनी समय की गणना, और कोशिकाओं की उपयुक्त संख्या अभिकर्मक के समय में कम से कम 9 एक्स 10 6 कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए बीज। एक नई प्लेट reseed करने के लिए शेष कोशिकाओं की ~ 10% के साथ, ~ 90% confluency हो गई जब एक 145 मिमी परिपत्र संस्कृति की थाली आमतौर पर 3 96 अच्छी तरह से transfections के लिए पर्याप्त है।

अभिकर्मक के लिए 2. तैयारी पहले

_content "> नोट: ये अभिकर्मकों की तैयारी में काफ़ी समय हो सकता है के बाद से कदम 2.0-2.2 में buffers और प्लास्मिड डीएनए की तैयारी से पहले अभिकर्मक वाले दिनों में किया जाना चाहिए।

  1. 3'LIFE परख के साथ संगत कर रहे हैं कि मानव 3'UTR क्लोन एक सार्वजनिक प्लाज्मिड रिपोजिटरी 30 के माध्यम से उपलब्ध हैं। स्वयं या तरल से निपटने रोबोट के साथ डीएनए प्लाज्मिड शुद्ध। एक अभिकर्मक ग्रेड क्षारीय सेल मिनी प्रस्तुत करने का 96 अच्छी तरह से किट का प्रयोग करें और निर्माता के निर्देशों का पालन करें। अच्छी तरह से करने के लिए ~ 100 एनजी / μl प्रति शुद्ध वैक्टर Resuspend।
    नोट: प्लाज्मिड एकाग्रता नीचे 40 एनजी / μl गिर गया तो अपर्याप्त luciferase संकेत परिणाम होगा।
  2. PLIFE-miRNA चित्रा 1 बी 24 में पाइप लाइन का उपयोग कर 30 या क्लोन वैक्टर प्राप्त करते हैं। प्रत्येक miRNA और खाली नियंत्रण प्लास्मिड के लिए 500 एनजी / μl की एकाग्रता में वैक्टर Resuspend।
  3. Nucleofection बफर की स्थिति की संवेदनशीलता के कारण, यह सुनिश्चित करें कि(कोशिकाओं और प्लास्मिड सहित) ट्रांसफ़ेक्ट माल की कुल मात्रा 96 अच्छी तरह से अभिकर्मक थाली के प्रत्येक कुएं में कुल तरल के 10% से अधिक नहीं है। इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, कम से कम 500 एनजी / μl की एकाग्रता में pLIFE-miRNA के प्लाज्मिड शेयर ध्यान केंद्रित।
  4. 10x जुगनू luciferase बफर अभिकर्मकों (तालिका 1), और अप करने के लिए 6 महीने के लिए भंडारित किया जा सकता है, जो 1x Renilla luciferase बफर अभिकर्मकों (तालिका 2), तैयार करें।
    नोट: जुगनू luciferase बफर में डीटीटी एकल उपयोग aliquots में -20 ओ सी पर समाधान में जमा करने के लिए आवश्यक है।

3. अभिकर्मक करने के तुरंत पहले निम्न आइटम तैयार करें

  1. पीबीएस युक्त अभिकर्मक बफर, 1.5% HEPES, पीएच 7.0 से तैयार करें। यह अभिकर्मक दक्षता में ध्यान देने योग्य घटने के बिना 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने के लिए भंडारित किया जा सकता है, यह ताजा तैयार करें। बफर और प्लास्मिड डीएनए संस्करणों को तैयार करने में, सु करने के लिए प्रत्येक 96 अच्छी तरह से थाली के लिए 120 प्रतिक्रियाओं मानfficiently pipetting और तरल जलाशयों और मल्टीचैनल pipettes का उपयोग खो मात्रा में त्रुटियों के लिए खाते। विभाज्य अच्छी तरह से अभिकर्मक बफर प्रति 18 μl (/ 96 अच्छी तरह से थाली में 120 कुओं = प्लेट प्रति 2.16 मिलीग्राम), और अलग निर्धारित करें।
    नोट: सेल इलेक्ट्रोपोरेशन डिवाइस कोशिकाओं transfect करने के लिए इस्तेमाल किया बफर की स्थिति के लिए अत्यंत संवेदनशील है। तैयारी बफ़र्स उपकरणों के लगातार प्रदर्शन सुनिश्चित करेगा जब सटीकता। विशेष रूप से है कि बफर microcentrifuge ट्यूब, 96 अच्छी तरह से प्लेटों, जलाशयों, और इलेक्ट्रोड प्लेटों में खुला छोड़ दिया है समय को कम करके, buffers के वाष्पीकरण को रोकने के लिए परख प्रदर्शन जब अतिरिक्त ध्यान रखा जाना चाहिए।
  2. रिजर्व निम्न नियंत्रण के लिए चार कुओं, कोई pLIFE-3'UTR (luciferase परख की पृष्ठभूमि को मापने के लिए), pLIFE-SV40 3'UTR (नकारात्मक लक्ष्य नियंत्रण), miRNA # 1 के लिए सकारात्मक नियंत्रण, miRNA # के लिए सकारात्मक नियंत्रण 2।
    नोट: ये वैक्टर 30 सार्वजनिक रूप से उपलब्ध हैं। वैकल्पिक रूप से, किसी भी पहले मान्य लक्ष्यएक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. गर्म मीडिया, 37 डिग्री सेल्सियस के लिए ट्रिप्सिन (0.25%)।
  4. DMEM 10% FBS, 1% पेन / Strep के साथ पूरक की 96 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट की हर अच्छी तरह से करने के लिए, 200 μl जोड़ें, और अभिकर्मक निम्न का उपयोग करने के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखा।
  5. समर्थन सॉफ्टवेयर के द्वारा पीछा सभी सेल electroporation के उपकरणों को चालू करें। HEK293T कोशिकाओं और पीबीएस / HEPES बफर के लिए पल्स कोड FF120 का प्रयोग करें।

प्लास्मिड डीएनए और सेल मिश्रण 4. तैयारी

नोट: निम्न प्रोटोकॉल दो miRNAs (miRNA- # 1 और miRNA- # 2) के साथ एक स्क्रीन के लिए एक प्रयोग में तीन 96 अच्छी तरह प्लेटें transfecting हो जाती है। प्रत्येक थाली pLIFE-3'UTR plasmids के एक ही 96 अच्छी तरह से थाली के अनुरूप होगा, और, pLIFE-miRNA के रिक्त pLIFE-miRNA- # 1, या pLIFE-miRNA- # 2 के साथ तीन बार इलाज किया जाएगा।

  1. प्रत्येक miRNA के लिए pLIFE-miRNA + अभिकर्मक बफर के 3 शेयरों तैयार करें। इस शेयर के लिए प्रत्येक की कुल मात्रा का 50% (10 μl) के लिए खाते चाहिएखैर, 120 कुओं से गुणा किया। इस प्रकार, प्रत्येक शेयर 1.08 मिलीग्राम बफर 120 μl प्लास्मिड डीएनए (pLIFE-miRNA) को शामिल करना चाहिए।
  2. , मीडिया eluting पीबीएस के साथ धीरे धोने, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ~ 5 मिलीलीटर 0.25% trypsin के साथ इलाज से 145 मिमी संस्कृति की थाली से कोशिकाओं को निकाल दें। 5 मिनट के लिए 300 XG पर एक समान मीडिया की मात्रा, और गोली कोशिकाओं के साथ trypsin बेअसर।
  3. 5-10 मिलीलीटर मीडिया (सेल घनत्व और सेल काउंटर का सटीक सीमा पर निर्भर करता है) ~ में / trypsin मीडिया, और resuspend गोली निकालें।
  4. एक सेल काउंटर का उपयोग कोशिकाओं की गणना। 95% व्यवहार्य और मशीन की सटीक सीमा के भीतर> कोशिकाओं रहे हैं कि सुनिश्चित करें।
    नोट: एक गलत सेल गिनती अत्यंत उच्च सेल सांद्रता (> 6.0x 10 6 / एमएल) से परिणाम कर सकते हैं। सेल अनुपात और / या अभिकर्मक क्षमता कम: Transfecting भी कई कोशिकाओं को काफी प्लाज्मिड को कम करने से लक्षित कर miRNA की क्षमता को कम कर सकते हैं।
  5. विभाज्य तीन ट्यूब प्रत्येक युक्त 9 एक्स 10 6 कोशिकाओं, कोशिकाओं के लिए इसी rएक 96 अच्छी तरह से थाली के अभिकर्मक के लिए equired। 3 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं स्पिन।
  6. मीडिया निकालें। अतिरिक्त मीडिया अभिकर्मक दक्षता प्रभावित कर सकता है के रूप में गोली की न्यूनतम अशांति के साथ जितना संभव हो उतना मीडिया को दूर करने के लिए सुनिश्चित करें।
  7. 1.2 मिलीलीटर अभिकर्मक बफर / miRNA के प्लाज्मिड मिश्रण है, और अलग सेट में Resuspend कोशिकाओं।
  8. निम्नलिखित अभिकर्मक बफर में pLIFE-3'UTR प्लाज्मिड का विस्तार मेजबान कदम। इस 96 अच्छी तरह से प्लेट में होता है, हर समय प्लेटों को कवर द्वारा बफर के वाष्पीकरण से बचने के लिए ध्यान रखना।
    1. एक multichannel विंदुक का प्रयोग, एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली के प्रत्येक कुएं में अभिकर्मक बफर μl 32.4 के लिए कदम ([अभिकर्मक प्रति] 9 μl * 3 [प्लेटों] * 1.2 [पिपेट त्रुटि के लिए खाते में])।
    2. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 3.6 μl मिनी तैयार pLIFE-3'UTR प्लाज्मिड की (~ 100 एनजी / μl) जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से।
    3. पिपेट 96 अच्छी तरह से अभिकर्मक प्लेट और कवर के प्रत्येक कुएं में इस मिश्रण के 10 μl।

  1. जलाशय में पहली सेल / बफर / pLIFE-miRNA के प्लाज्मिड मिश्रण के 1.2 मिलीलीटर ले जाएँ। अच्छी तरह से मिश्रण।
  2. पहले से ही 10 μl अभिकर्मक बफर / pLIFE-3'UTR युक्त पहले 96 अच्छी तरह से अभिकर्मक थाली में इस मिश्रण के 10 μl जोड़ें। ऊपर pipetting द्वारा और कई बार नीचे अच्छी तरह से मिलाएं।
    नोट: बफर में कोशिकाओं के समान निलंबन भी सुनिश्चित करने और क्युवेट के माध्यम से बिजली चालू की पूरी तरह से पारित होने और अभिकर्मक क्षमता को अधिकतम जाएगा।
  3. सेल electroporation के उपकरण पर 96 अच्छी तरह से अभिकर्मक थाली प्लेस और अभिकर्मक आरंभ करें।
  4. अभिकर्मक पूरा हो गया है एक बार, 96 अच्छी तरह से अभिकर्मक थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 96 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली से पूर्व गर्म मीडिया के 100 μl जोड़ने के लिए और अच्छी तरह मिला लें। 96 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में प्रत्येक अच्छी तरह से 100 μl ले जाएँ।
  5. कोशिकाओं डब्ल्यू के पक्षों पर कुल करने के लिए करते हैं जाएगा, के रूप में अच्छी तरह के केंद्र में खड़ी तैनात विंदुक के साथ संस्कृति की थाली में कोशिकाओं मिश्रणपक्ष ठीक से मिश्रित जब तक।
  6. शेष दो प्लेटों के लिए 5.1-5.5 दोहराएँ।
  7. सफाई 96 अच्छी तरह से अभिकर्मक थाली
    1. 96 अच्छी तरह से अभिकर्मक प्लेटों प्रयोगों के बीच न्यूक्लिक एसिड की पर कोई ले सुनिश्चित करने के लिए 70% EtOH के साथ धोने से साफ किया जा सकता है। पूरी तरह से इलेक्ट्रोड स्ट्रिप्स पर अतिरिक्त EtOH के नीचे पोंछते (नीचे की ओर) और संस्कृति हुड में पूरी तरह से सूखे के लिए अभिकर्मक प्लेटों की अनुमति के द्वारा पीछा किया, अच्छी तरह से प्रत्येक को भरने के लिए एक स्प्रे बोतल का उपयोग कर दो 70% EtOH के washes के प्रदर्शन करना।
      नोट: हम कोई प्लास्मिड डीएनए के साथ 70% EtOH के साथ एक एकल धोने, और एक दूसरे अभिकर्मक द्वारा पीछा किया, HEK293T कोशिकाओं में प्रत्येक प्लाज्मिड pmaxGFP 2 माइक्रोग्राम के साथ 12 कुओं transfecting द्वारा कैरी ओवर डीएनए संदूषण के लिए परीक्षण किया है। इस अत्यंत उच्च प्लाज्मिड एकाग्रता, अत्यंत उज्ज्वल संवाददाता, और एक एकल धोने के साथ, 12 को दोहराने transfections में से किसी में कोई नमूदार प्रतिदीप्ति वहां गया था।
  8. दोहरी lucif द्वारा पीछा 37 डिग्री सेल्सियस पर 48-72 घंटे के लिए संस्कृति कोशिकाओं,परख मिटा।

6. सेल luciferase परख के लिए Lysate तैयारी

  1. 4 भागों पानी, एक जलाशय में निष्क्रिय lysis बफर 5x 1 भाग के साथ lysis बफर पतला। 26 μl / अच्छी तरह से, ~ 20 अतिरिक्त संस्करणों को जोड़ने के जलाशय में नुकसान के लिए खाते में गणना।
    नोट: बफर -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है और pipetting सटीकता में सुधार होगा कमरे के तापमान दृष्टिकोण करने के लिए 5x बफर की इजाजत देने के लिए इस प्रकार पहले, अत्यंत चिपचिपा हो सकता है।
  2. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग अभिकर्मक दक्षता के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक का विश्लेषण करें। कुशलतापूर्वक transfect नहीं था कि कुओं में किसी भी विसंगतियों (> 90% अभिकर्मक दक्षता) नोट, या भीड़भाड़ या मीडिया थकावट का संकेत आरएफपी के निम्न स्तर व्यक्त कर रहे हैं। विश्लेषण से इन कुओं निकालें।
  3. पूरी तरह से कोशिकाओं को अलग करने के लिए कारण होगा, जो बहुत जल्दी elute के लिए सावधान नहीं किया जा रहा है, कोशिकाओं से मीडिया को दूर।
    नोट: शेष मीडिया experime भर में मूल्यों में lysate और कारण उतार-चढ़ाव कमजोर होगीएनटीएस।
  4. 20-30 मिनट ~ के लिए कम / मध्यम गति से एक थाली प्रकार के बरतन / घुमाव पर प्रत्येक अच्छी तरह से, और जगह के लिए lysis बफर के 26 μl जोड़ें। , Luciferase बफ़र्स को तैयार luminometer (एस) धोने और प्रधानमंत्री, और अपारदर्शी माप प्लेटों के लिए lysate हस्तांतरण करने के लिए इस समय का उपयोग करें।

7. दोहरी luciferase परख

नोट: कई प्लेटें एक luminometer पर क्रमिक रूप से मापा जा रहे हैं, तो तुरंत प्रत्येक थाली के साथ उपयोग करने से पहले पीएच समायोजन के द्वारा पीछा इन अभिकर्मकों, उनका कहना है एटीपी और substrates के अलावा सब कुछ के साथ बफर गुरु घोला जा सकता है बनाते हैं। एटीपी और substrates समय पर नीचा हो सकता है; इन अभिकर्मकों बफर में हैं समय की राशि में स्थिरता के कई प्लेटें भर में स्थिरता में सुधार होगा।

  1. 1x luciferase बफ़र्स की तैयारी (1 टेबल):
    1. Substrates के प्रकाश के प्रति संवेदनशील हो सकता है, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ जुगनू और Renilla बफ़र्स युक्त दो नलियों (आमतौर पर 15/50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब) लपेटें।
    2. 1x जुगनू luciferase बफर तैयार करें। एक अंतिम 1x एकाग्रता के लिए 5 एमएल एच 2 0, EGTA पिछले जोड़ने, प्रत्येक पांच 10x जुगनू luciferase अभिकर्मकों के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
      1. जुगनू बफर 1x 10 मिलीलीटर 0.025 जी एटीपी जोड़ें। कई बार inverting से मिलाएं। हर समय बर्फ पर एटीपी रखें। एटीपी नीचा दिखाना होगा, तो एक से अधिक प्लेट क्रमिक रूप से मापने हैं, बफर प्रत्येक अतिरिक्त प्लेट के लिए इस कदम पर ताजा शुरुआत बनाया जाना चाहिए।
      2. बफर पीएच के आधार पर पीले रंग को बदलना चाहिए 100 बीटल luciferin (सब्सट्रेट) (तालिका 1) के 100 μl जोड़ें।
    3. 1x Renilla luciferase बफर पुनर्गठन: 96 अच्छी तरह से थाली, विभाज्य 1 की 10 मिलीलीटर प्रति "Renilla बफर"।
      1. बीएसए के 100 μl (44 मिलीग्राम / एमएल शेयर) जोड़ें।
      2. एक से अधिक थाली, 10 एमएल aliquots में अलग मास्टर मिश्रण स्क्रीनिंग हैं।
      3. बफर coelenterazine के 100 μl जोड़ें (पहले aliquoted और 100x सान्द्र में संग्रहीत।)
      4. <ली> NaOH और एचसीएल का उपयोग कर 5.0 1x Renilla बफर द्वारा पीछा किया, जुगनू 8.0 करने के लिए बफर 1x का पीएच को समायोजित करें।
      नोट: प्रत्येक बफर की गतिविधि, और जुगनू luciferase गतिविधि बुझाने के लिए Renilla बफर की क्षमता पीएच पर अत्यधिक निर्भर है। अनुरूप परिणाम के लिए इस चरण में बेहद सटीक हो।
    4. Luminometer भड़काना के लिए समायोजित करने के लिए 10.5 मिलीलीटर (1 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए इसी) प्रत्येक बफर की मात्रा लाओ।
  2. अपारदर्शी सफेद प्लेटों के लिए lysate स्थानांतरण: इस बिंदु पर कोशिकाओं को 20 मिनट ~ के लिए lysis बफर में होना चाहिए। प्रत्येक अच्छी तरह से एक multichannel विंदुक का उपयोग करने से 25 μl ले लो, कोशिकाओं के clumps को तोड़ने और lysate homogenize करने के लिए नीचे अच्छी तरह से ऊपर pipet के लिए सुनिश्चित करें और हो।
  3. Luminometer तैयार करें। Luminometer चालू करें और "दो इंजेक्शन के साथ डीएलआर" कहा जाता है डीएलआर फ़ोल्डर में प्रोटोकॉल का चयन करें। अन्य प्रारूपों डेटा विश्लेषण पाइप लाइन (नीचे) के साथ संगत नहीं हैं।
    1. टी होने के लिए कुओं का चयन करेंदिलचस्पी (सभी कुओं डिफ़ॉल्ट है)।
    2. (विवरण के लिए 29 देखें) एक 10 सेकंड माप समय के साथ, 5 सेकंड के लिए सेटिंग 'माप से पहले देरी' बढ़ाएँ।
    3. केशिका धोने कदम: पानी 3x, EtOH के 3x, पानी 3x, सूखी 3x। वापस बफर ट्यूबों में एक बार बेकार में प्रधानमंत्री बफ़र्स, और उसके बाद प्रधानमंत्री को दूसरी बार मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए। सही केशिका में Renilla द्वारा पीछा छोड़ दिया केशिका में पहली और यह प्रधानमंत्री जुगनू बफर इंजेक्षन।
  4. Luciferase परख आरंभ करें। हर प्लेट पढ़ने के लिए ~ 48 मिनट के लिए ले जाना चाहिए। पूरा होने के बाद पहली फाइल को बचाने के लिए, और फिर धो चरणों को दोहराएँ और luminometer बंद।
    नोट: luminometer कार्यक्रम दुर्घटना होगा जहां कई प्लेटें पढ़ने के लिए और उसी पर संग्रहीत डेटा फ़ाइल उत्कृष्टता प्राप्त किया जा सकता है, मुद्दों कई थाली के साथ सामना किया जा सकता है, फिर भी पढ़ता है। माप के बीच सभी डेटा को बचाने और सेव संभव है इससे पहले कार्यक्रम दुर्घटनाओं अगर स्क्रीनशॉट लेने के लिए सुनिश्चित करें।
    1. पुराने बफ़र्स बदलेंनए के साथ, नई प्लेट शुरू करने से पहले कम से कम दो बार नया buffers के साथ प्रधानमंत्री के लिए सुनिश्चित किया जा रहा है।

8. डेटा विश्लेषण

  1. से उपलब्ध है - और "multiplate विश्लेषण 3'LIFE" - Excel तालिकाओं "एकल थाली विश्लेषण 3'LIFE" का उपयोग www.mangonelab.com । स्प्रेडशीट - "एकल थाली विश्लेषण 3'LIFE 'में नकारात्मक स्थिति, miRNA # 1, और miRNA # 2 के लिए इसी स्थानों में luminometer आउटपुट फ़ाइल से जुगनू और Renilla luciferase माप के लिए कच्चे डेटा की प्रतिलिपि।
  2. स्प्रेडशीट स्वचालित रूप से जुगनू / Renilla अनुपात की गणना और उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण करने के लिए प्रत्येक miRNA के मानक के अनुसार, और प्रत्येक थाली भर दमन मूल्यों मानक के अनुसार होगा।
    नोट: यह स्प्रेडशीट स्वचालित रूप से काफी दमित कुओं पर प्रकाश डाला, कम luciferase संकेत के साथ कुओं की पहचान है, और repressi के उपाय प्रदान करेगापूरी थाली भर पर। सांख्यिकीय विश्लेषण के विस्तृत विवरण के लिए 24 देखें।
    1. प्रत्येक परीक्षण miRNA के लिए # 1 को दोहराने के लिए इसी स्थान पर - "multiplate विश्लेषण 3'LIFE" स्प्रेडशीट में इसी कोशिकाओं में, "सामान्यीकृत आरआई सूचकांक" बॉक्स से मूल्यों की प्रतिलिपि। अलग अलग दिनों पर प्रदर्शन सभी जैविक प्रतिकृति के लिए दोहराएँ।
  3. अगर वांछित, क्रमशः, कॉलम बी और डी में जीन नाम और लक्ष्य भविष्यवाणी की स्थिति डालें।
    1. स्प्रेडशीट स्वचालित रूप से सभी प्लेट के औसत की गणना करने की अनुमति दें। एक गर्मी नक्शे के रूप में 96 प्रारूप (चित्रा 2) में डेटा का निरीक्षण करें। फाइल भी सूची प्रारूप में डेटा (चित्रा 2) व्यवस्था करते हैं।
      नोट: दमन सूचकांक ख्यात miRNA लक्ष्यों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल उपाय है। विभिन्न तंगी मापदंडों व्यक्तिगत वरीयताओं पर आधारित है, का इस्तेमाल किया जा सकता है। औसत पर हम 0 के दमन सूचकांक नीचे की संभावना हिट पर विचार करें।8 और टी परीक्षण (पी -value <0.05) द्वारा सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण। चित्र में दिखाया गया है कि इन मानदंडों के आधार पर 3 संभावित ठिकानों लाल रंग में प्रकाश डाला जाएगा।

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Representative Results

luminometer आउटपुट फ़ाइल दोनों जुगनू और Renilla luciferase प्रोटीन के लिए कच्चे माप होता है। और - Mangone प्रयोगशाला वेबसाइट (से उपलब्ध है "3'LIFE multiplate विश्लेषण" स्प्रेडशीट - यह कच्चा प्रारूप "एकल थाली विश्लेषण 3'LIFE" के साथ संगत है www.mangonelab.com )। एकल थाली विश्लेषण स्प्रेडशीट स्वचालित रूप से, जुगनू / Renilla अनुपात की गणना करता उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण करने के लिए प्रत्येक miRNA normalizes, और प्रत्येक थाली भर दमन मूल्यों normalizes। इस स्प्रेडशीट स्वचालित रूप से, कम Renilla luciferase संकेत के साथ कुओं को पहचानती है नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में दमन है कि प्रदर्शन के कुओं पर प्रकाश डाला गया है, और पूरे थाली भर दमन के उपायों (चित्रा 2) प्रदान करता है। सांख्यिकीय विश्लेषण के विस्तृत विवरण के लिए 24 देखें।

एकाधिक प्रतिकृति का विश्लेषण किया जा सकता हैडी "multiplate विश्लेषण" स्प्रेडशीट का उपयोग कर। प्रत्येक को दोहराने के कंधे से कंधा मिलाकर तुलना की जाती है, और डेटा के सांख्यिकीय उपायों स्वचालित रूप से (चित्रा 3) की गणना कर रहे हैं। "सामान्यीकृत दमन" कॉलम के साथ प्रतिकृति की तुलना करने के अलावा, उपयोगकर्ता "miRNA # 1 / miRNA # 2" कॉलम के तहत दो miRNAs के बीच दमन तुलना कर सकते हैं। इस उपाय से प्रत्येक को दोहराने के लिए प्रत्येक miRNA के लिए दमन सूचकांक में बिताते हैं। इस उपाय luciferase परख से गलत मूल्यों का संकेत कर सकते हैं (ए 9 पंक्ति, चित्रा 3 देखें, नकारात्मक नियंत्रण के साथ असामान्य रूप से उच्च या कम रीडिंग उदाहरण के लिए, प्रतिनिधि # 3), और दमन सूचकांक पर्याप्त दमन संकेत नहीं हो सकता जहां कुओं, लेकिन ऐसा कर miRNAs के बीच महत्वपूर्ण अंतर दिखा रहे हैं। इस उपाय के एक miRNA लक्ष्य इंगित करने के लिए सीधे इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है, यह पूरी तरह से miRNA पुनः निर्देशित करने के लिए जिम्मेदार ठहराया नहीं कर रहे हैं कि डेटा में outliers, समस्याग्रस्त कुओं, या पैटर्न की पहचान करने के लिए उपयोगी हैgulation।

दमन सूचकांक (आरआई) कम मूल्यों उच्च सापेक्ष दमन करने के लिए इसी के साथ, एक ख्यात miRNA लक्ष्य कॉल करने के लिए प्रयोग किया जाता है। ख्यात लक्ष्य फोन करने के लिए दहलीज शोधकर्ता द्वारा आवश्यक तंगी के स्तर पर आधारित है, लेकिन सांख्यिकीय महत्वपूर्ण पी-मूल्यों (पी <0.05) प्रदर्शित कि 3'UTRs साथ आरआई के संयोजन उच्च आत्मविश्वास लक्ष्य (चित्रा 2 पंक्तियों बी 8 देखने के संकेत जाएगा और बी 12)।

चित्र 1
चित्रा 1: 3'LIFE परख (ए)। 3'LIFE परख में इस्तेमाल किया गेटवे-संगत वैक्टर। शीर्ष: Renilla luciferase जीन (RLuc) नियंत्रण के रूप में unspecific SV40 पीए 3'UTR से जुड़े हुए है, जबकि luciferase जीन (FLuc), परीक्षण 3'UTR से जुड़े हुए है। नीचे: RFP- miRNA-Intron वेक्टर --miRNA के पूर्व जांच, प्लस ~ 400इसके जीनोमिक ठिकाना भीतर न्यूक्लियोटाइड (अंतर्जात miRNA के प्रसंस्करण पुनरावृत्ति करने के लिए), DSRed2 fluorochrome के साथ अपने सह अभिव्यक्ति की अनुमति के लिए एक Intron भीतर क्लोन है। दोनों वैक्टर सार्वजनिक रूप से उपलब्ध हैं (Seiler एट अल।, 2013)। (बी) 3'LIFE परख के फ्लो चार्ट। (सी) 3'LIFE पाइपलाइन: के साथ या miRNA वैक्टर बिना परीक्षण 3'UTR युक्त दोहरे luciferase वेक्टर सह ट्रांसफ़ेक्ट 96 अच्छी तरह से प्लेट में HEK293 कोशिकाओं में हैं। miRNA और एक सदाशयी 3'UTR लक्ष्य के बीच बातचीत (प्रायोगिक थाली में नारंगी मौके द्वारा उदाहरण) विशिष्ट कुओं में रिश्तेदार luminescence कम होगी।

चित्र 2
चित्रा 2: 3'LIFE परख के साथ उत्पादन डेटा का नमूना। MiRNA के चार प्रतियों में परीक्षण किया जाता है हर जांच (1-4 प्रतिकृति)। रंग लाल के साथ, दमन के स्तर का प्रतिनिधित्वमजबूत miRNA / 3'UTR बातचीत का संकेत रंग। सभी प्रतिकृति पीले तीर नीचे सारांश थाली में दिखाया गया है उच्च गुणवत्ता वाले ख्यात लक्ष्य का उत्पादन करने के लिए औसत निकाला जाता है। व्हाइट बॉक्स, नियंत्रण प्रतिनिधित्व कम अभिकर्मक दक्षता के साथ transfections या कुओं में विफल रहा है।

चित्र तीन
चित्रा 3:। 3'LIFE स्प्रेडशीट का उपयोग कर उत्पादन बातचीत का एक सबसेट का सारांश डेटा का प्रतिनिधित्व तालिका दमन मूल्यों चित्रा 2. सॉफ्टवेयर के रूप में कर रहे हैं प्रत्येक बातचीत के लिए मानक विचलन, मानक त्रुटि और Z-खरीदते हैं। सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण बातचीत लाल रंग में चिह्नित कर रहे हैं। पिछले चार पंक्तियाँ एक दूसरे miRNA के सापेक्ष दमन दिखाने के लिए, और दो अलग अलग miRNAs के बीच दमन तुलना करने के लिए माध्यमिक सूचक के रूप में प्रयोग किया जाता है। स्प्रेडशीट से डाउनलोड किया जा सकता www.mangonelab.com

जुगनू luciferase बफर अभिकर्मकों अंतिम एकाग्रता (1x) Glycylglycine 25 मिमी कश्मीर पीओ 4 एक्स (7.8 पीएच) 15 मिमी MgSO 4 15 मिमी डीटीटी (4º पर दुकान) 1 मिमी EGTA 4 मिमी एटीपी * 2 मिमी बीटल luciferin * 250 माइक्रोन

तालिका 1: शेयर जुगनू luciferase अभिकर्मकों: Glycylglycine के 10x शेयर समाधान, कश्मीर पीओ 4, MgSO 4 एक्स, डीटीटी और EGTA अलग से तैयार है और पुनर्गठन बफर करने के लिए पूर्व संग्रहित किया जा सकता है। 100x बीटल Luciferin (जुगनू luciferase सब्सट्रेट) स्टोर किया जा सकता है7.134 मिलीग्राम एच 2 0 (25 मिमी) में 50 मिलीग्राम luciferin भंग करके डी। -80 डिग्री सेल्सियस पर भंग बीटल ट्यूबों में luciferin और दुकान के विभाज्य 105 μl / प्लेट। Promega तकनीकी सहायता के अनुसार, इस> 6 महीने के लिए स्थिर होना चाहिए, लेकिन प्रकाश के प्रति संवेदनशील हो सकता है। नोट: EGTA तटस्थ पीएच पर समाधान में नहीं जाना होगा। यह पूरी तरह घुल धीरे धीरे जब तक EGTA को NaOH के जोड़ें। * अंतिम बफर करने के लिए जोड़ा अभिकर्मकों तुरंत पहले luciferase परख करने के लिए

Renilla luciferase बफर अभिकर्मकों अंतिम एकाग्रता (1x)
NaCl 1.1 एम
ना 2 EDTA 2.2 मिमी
के.एच. 2 पीओ 4 .22 एम
नेन 3 1.3 मिमी
बीएसए * .44 मिलीग्राम / मिलीलीटर
Coelenterazine * 2.5 & #956, एम

तालिका 2: बीएसए और coelenterazine छोड़कर स्टॉक Renilla luciferase बफर अभिकर्मकों सभी अभिकर्मकों एक 1x एकाग्रता में मिलाया जाता है और कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है। Coelenterazine acidified मेथनॉल में भंग और प्लेट प्रति aliquoted जा सकता है। 5 मिमी (<3 पीएच) के अंतिम एकाग्रता के लिए एचसीएल जोड़कर मेथनॉल खट्टा करना। 2.36 मिलीग्राम अम्लीकृत मेथनॉल (250 माइक्रोन) विभाज्य 105 उल / थाली में 250 माइक्रोग्राम coelenterazine भंग। मिश्रण में कम से कम 6 महीने के लिए स्थिर है, लेकिन प्रकाश के प्रति संवेदनशील हो सकता है। * अभिकर्मकों luciferase परख के तुरंत पहले बफर करने के लिए जोड़ा गया।

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Discussion

3'LIFE परख उच्च throughput में 3'UTRs में कार्यात्मक miRNA लक्ष्यों की पहचान करता है। यह परख प्रयोगात्मक उनके हित के miRNA के लिए ख्यात लक्ष्यों की एक बड़ी संख्या को पहचानने के लिए जो चाहते हैं शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी है। 3'LIFE परख परख miRNA के लक्ष्यों के लिए एक कार्यात्मक उपाय है, और आत्मविश्वास से पता कर सकते हैं एक भी miRNA के खिलाफ 3'UTR :: एक भी रिपोर्टर के द्विआधारी परीक्षण प्रदान करता है कि में 3'UTR संचालित नियमन के लिए क्वेरी करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है, व्यक्ति के जीन की लक्षित कर स्थिति। इस दृष्टिकोण को मान्य करने के लिए, हम 275 3'UTRs के एक पैनल की जांच की और दो ​​miRNAs के खिलाफ, जाने-7C और मीर-10b, और इस पुस्तकालय में 10 पहले से मान्य लक्ष्य जीन शामिल थे। इन दस जीनों के आठ दमन 24 का प्रदर्शन किया। हम यह भी एक अमान्य किए गए bioinformatically भविष्यवाणी लक्ष्यों की महत्वपूर्ण संवर्धन, और हमारे शीर्ष हिट के बीच में विहित बीज तत्व होते हैं कि unpredicted 3'UTRs मनाया, सुझावकि 3'LIFE gesting सदाशयी miRNA लक्ष्यों की पहचान करने में सक्षम है।

उच्च throughput स्क्रीन की संवेदनशीलता का एक महत्वपूर्ण संकेतक झूठी सकारात्मक और नकारात्मक झूठी दर है। इस परख की झूठी सकारात्मक दर हिट मान्य करने के लिए अतिरिक्त वैकल्पिक तरीकों का उपयोग कर मूल्यांकन किया जाना चाहिए, वहीं दस सकारात्मक नियंत्रण के आठ में 20% की एक झूठी नकारात्मक दर, सुझाव हमारे सबूत की सिद्धांत स्क्रीन प्रदर्शित दमन में शामिल थे। हालांकि, कई तकनीकों अलग सेलुलर संदर्भों में miRNA लक्ष्यों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, और ट्रांस-अभिनय कारकों से 3'UTR प्रसंस्करण और विनियमन अत्यधिक ऊतक विशिष्ट माना जाता है। उदाहरण के लिए, 3'UTRs के बहुमत परिपक्व mRNA में 3'UTR की लंबाई को नियंत्रित जो कई polyadenylation साइटों, होते हैं। कई मामलों में समीपस्थ polyadenylation साइटों के उपयोग के ऊतक विशिष्ट है, और miRNA लक्ष्य साइटों बाहर कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, सहकारी miRNA के लक्ष्यीकरण, प्रतियोगिता वाईवें शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन, और mRNA माध्यमिक संरचना सभी प्रभाव 3'LIFE की क्षमता विशिष्ट ऊतकों में miRNA लक्ष्य का पता लगाने के लिए कर सकते हैं। इस वजह से, 3'LIFE परख द्वारा लक्ष्य का पता लगाने के निरपेक्ष त्रुटि दरों का मूल्यांकन उलझी, परख किया जाता है, जिसमें सेलुलर संदर्भ के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। इस प्रोटोकॉल HEK293T कोशिकाओं के लिए अनुकूलित है, लेकिन शोधकर्ता एक विशिष्ट जैविक संदर्भ में परख प्रदर्शन करने के लिए चाहता है तो वैकल्पिक सेल लाइनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, प्रत्येक कोशिका लाइन के साथ अभिकर्मक दक्षता और सेल अस्तित्व के अनुकूलन के कई बफर की स्थिति, नाड़ी कोड, और कोशिकाओं की संख्या का उपयोग कर अनुकूलित किया जाना होगा। एक अनुकूलन योजना का एक उदाहरण Wolter एट अल। 24 पर पाया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल के 96 अच्छी तरह प्रारूप में अनुकूलित और कुछ उच्च throughput उपकरण के उपयोग को निर्दिष्ट किया गया है। मामले में संस्था के 96 के लिए आवश्यक उपकरणों के अधिकारी नहीं है कि-well nucleofection, वैकल्पिक अभिकर्मक अभिकर्मकों के रूप में लंबे समय के अभिकर्मक दक्षता उच्च बनी हुई है, के रूप में 3'LIFE परख प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, luciferase परख 3'LIFE परख की सबसे अधिक समय लेने पहलू है। जैसे, कई luminometers के उपयोग के उच्च throughput स्क्रीन के लिए सिफारिश की है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
glycylglycine Sigma G1127-25G
Kx PO4 Sigma P2222
EGTA Sigma E3889
ATP Sigma FLAAS
DTT Sigma D0632
MgSO4 Sigma M7506
CoA Sigma C4282
luciferin Sigma L9504
NaCl Sigma S7653
Na2EDTA Sigma E0399
K H2 P O4 Sigma 1551139
BSA Sigma A2153
NaN3 Sigma S2002
Coelenterazine Sigma C3230
PBS/HEPES Corning 21-040-CV
DMEM Sigma D5546
FBS Sigma F2442
Pennicilin/Streptomicin Sigma P4333
Trypsin T2600000
Consumables
MaxiPrep Kit Promega A2392
96-well miniprep plate Pall 8032
96-well shuttle plates Lonza V4SP-2096
5x Lysis Buffer Promega E1941 
Instruments
96-well GloMax Plate Reader Promega E9032
Biomech FX Liquid Handler Robot Beckmann A31842
4D-Nucleofector Core Unit Lonza AAF-1001
96-well Shuttle System Lonza AAM-1001
Cell Counter Countess Invitrogen C10227

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References

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 99 माइक्रो RNA luciferase परख 3 'untranslated क्षेत्र उच्च throughput अभिकर्मक बाद के ट्रांसक्रिप्शनल जीन विनियमन कैंसर
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Wolter, J. M., Kotagama, K., Babb, C. S., Mangone, M. Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay. J. Vis. Exp. (99), e52647, doi:10.3791/52647 (2015).

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