Abstract
Självlysande Identifiering av funktionella element i 3'UTRs (3'LIFE) möjliggör snabb identifiering av mål för specifika miRNA inom en rad av hundratals frågas 3'UTRs. Målidentifiering är baserad på den dubbla luciferasanalysen, som detekterar bindning vid mRNA-nivå genom att mäta translations utsignal, vilket ger en funktionell utläsning av miRNA inriktning. 3'LIFE använder generiska buffertar och reagenser och allmänt tillgängliga bibliotek reporter, vilket gör genomet hela skärmar genomförbart och kostnadseffektivt. 3'LIFE kan utföras antingen i en vanlig labb inställning eller skalas upp med hjälp av flytande robotar hantering och andra hög genomströmning instrumentering. Vi visar tillvägagångssättet med hjälp av en datauppsättning av mänskliga 3'UTRs klonade i 96-brunnsplattor och två test miRNA, låt-7c och MIR-10b. Vi visar hur du utför DNA-preparation, transfektion, cellodling och luciferasanalyser i 96-brunnsformat och tillhandahålla verktyg för dataanalys. Sammanfattningsvis 3'LIFE är mycket reproducerbar, snabb, systematisk, och identifierar högt förtroende mål.
Introduction
Det övergripande målet med denna metod är att identifiera och exakt kartlägga mikroRNA (miRNA) mål i hög genomströmning. MiRNA endogena icke-kodande RNA ~ 22 nukleotider i längd. Efter transkription och bearbetning, är mogna miRNA införlivas i ett proteinkomplex som kallas RNA-inducerad tysta komplex (RISC). Varje miRNA guidar RISC att rikta delar i huvudsak återfinns 3'untranslated regioner (3'UTRs) av budbärar-RNA (mRNA), vilket resulterar i en omräknings förtryck eller mRNA klyvning 1. Mirna erkänner målplatser baserade på standard Watson-Crick och G: U vingla basparning, och är degenererade i naturen, innehåller flera inkompatibla baspar och utbuktande regioner. Många miRNA är i stort sett bevarad från växter till människor 2,3, där de spelar en mängd olika biologiska roller. I metazoans miRNA kan påverka flera biologiska processer inklusive cell öde beslut 4, utvecklings timing 5 6,7. Mirna misexpression kan också resultera i avvikande genreglering, som kan ha ett betydande inflytande på cellens beteende enbart baserat på funktionen av målgener. Som sådan är miRNA kopplade till ett brett spektrum av sjukdomar, inklusive neurodegeneration 8,9, diabetes 10 och cancer 11. Bioinformatiska och våt-bänk tillvägagångssätt tyder på att varje miRNA kan vara i stånd att rikta hundratals till tusentals olika mRNA 12-14, vilket tyder på att hög genomströmning eller genomet breda strategier behövs för att undersöka denna stora grupp av potentiella interaktioner.
Identifiera målgener är en kritisk komponent i mekanistiskt definiera miRNA funktion, och att göra det forskare måste kunna avslöja mål i stor skala. Flera metoder har utvecklats för att identifiera miRNA mål, inklusive bioinformatiska prediktionsalgoritmer, hög genomströmning sekvenseringriktad mRNA, och reporter baserade analyser. Var och en av dessa metoder har inneboende styrkor och svagheter. Med tanke på att miRNA inriktning styrs av sekvensspecificitet, notably av nukleotider 2-6 av miRNA (benämnd såddregionen), flera algoritmer har utvecklats för att förutsäga miRNA mål i hela genomet hos många organismer. Dessa algoritmer är utbildade med hjälp av observerade baspar motiv av validerade miRNA mål, och ofta använda parametrar såsom stränga utsäde parning, bevarandeområde, och / eller termodynamisk stabilitet 15. Även om dessa filter förfina stort antal förmodade mål med tillräcklig komplementaritet endast höga förtroende mål, kan de utesluter artspecifika och icke-kanoniska miRNA målställen, som nyligen bevis tyder är utbredd 16-24. Dessutom dessa förutsägelser inte hänsyn till mekanismer för mRNA behandling som exkluderar miRNA målställen, såsom alternativ polyadenylering25 RNA redigering 26, RNA metylering 27, och samverkande bindning. Som sådan, har höga falska positiva och falska negativa resultat har rapporterats för många algoritmer 22,24,28. Även om dessa algoritmer är användbara för att identifiera kandidat miRNA mål för efterföljande experimentell validering, dessa höga felprocent begränsa effekten av bioinformatiska metoder för systematisk miRNA måldetektering.
Att systematiskt sond för interaktioner mellan en given miRNA och potentiellt riktade 3'UTRs har vi utvecklat en hög genomströmning analys kallas Självlysande Identifiering av funktionella element i 3'UTRs (3'LIFE) 24. Denna analys mäter direkta växelverkan och translationell förtryck av test 3'UTR av en fråga miRNA med hjälp av en dubbel luciferas reportersystem. I detta system är 3'UTR av en gen av intresse klonad nedströms om eldflugeluciferas (Fluc) reporter läsram. De reporter nackdelartruct samtransfekteras med en fråga miRNA i HEK293T celler. MiRNA inriktning bestäms genom att mäta den relativa förändringen mellan test Fluc :: 3'UTR reporter och en andra icke-specifik Renilla luciferas reporter. Viktigt luciferasanalyser upptäcka funktionella miRNA / mRNA interaktioner som påverkar translations produktionen av reportern. Detta är en viktig fördel jämfört med traditionella metoder för att upptäcka miRNA reglering, såsom RT-qPCR och Western blöts, eftersom detta kringgår skillnader i mRNA nedbrytning och translationell förtryck, liksom förändringar i protein överflöd oberoende av 3'UTR baserad reglering.
Luciferasanalyser är allmänt används för att validera direkta miRNA mål på grund av sin relativa enkelhet och känslighet, men deras användning i hög genomströmning skärmar begränsas av höga kostnader som är förknippade med förbrukningsreagens, avsaknaden av 3'UTR bibliotek från offentliga källor, och frånvaron standardiserade luciferas protocols, vilket leder till svårigheter att jämföra funktionell repression över flera datamängder. För att underlätta användningen av 3'LIFE analysen har vi lagt vikt vid förenkling av experimentell design, utnyttjande av icke-kommersiella transfektion 24 och luciferasreagens 29, skapar en 3'UTR bibliotek som regelbundet uppdateras och utökas, och är tillgänglig via en offentlig plasmid förvar 30.
Skalbarheten av 3'LIFE analysen möjliggör screening av ett stort 3'UTR bibliotek för inriktning på en viss miRNA utan förspänning skärmen mot bioinformatically identifierade generna. Förutom att testa kanoniska och förutsedd interaktion, gör detta systematiskt tillvägagångssätt att identifiera nya mål drivs via icke-kanoniska och / eller arter-specifika interaktioner. Viktigt är effekten av miRNA inriktning på proteinproduktion i allmänhet förstås leda till blygsam translationell förtryck 15,31 </ Sup>, vilket tyder på att en primär roll miRNA förordningen är att finjustera protein utgång, skyddar mot avvikande nivåer av genuttryck, och ger robusthet cell särskilda program 32,33. Känsligheten hos analys luciferas i kombination med den inneboende stort antal negativa miRNA / mRNA interaktioner i 3'LIFE skärmen kan upptäcka subtila effekter av miRNA inriktning på ett stort antal gener, och identifiering av flera komponenter av genen nätverk som regleras av en viss miRNA 24.
Här beskriver vi 3'LIFE protokollet, och visa att det är genomförbart genom screening två väl karakteriserade miRNA, MIR-10b och låt-7c mot en panel av 275 mänskliga 3'UTRs (Figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Culture (24-48 timmar före transfektion)
- 24-48 h före transfektion utsäde en tillräcklig kvantitet HEK293T celler baserat på antalet 96-brunnars plattor som transfekteras.
OBS: För konsekventa transfektioner, att plattan cellerna vid en tillräcklig densitet gynna snabb delning, men inte vara mer än 70-90% konfluens vid tidpunkten för transfektion. - Varje 96-brunnars platta kräver 9 x 10 6 celler (75000 celler per brunn, och 120 brunnar per platta att redovisa användningen av reservoar och multikanalpipett). Beräkna dubbleringstid av HEK293-celler (typiskt ~ 20 h), och utsäde lämpligt antal celler för att erhålla åtminstone 9 x 10 6 celler vid tiden för transfektion. En 145 mm cirkulär odlingsplatta är vanligtvis tillräckligt för 3 96 brunnar transfektioner när vuxit till ~ 90% sammanflytning med ~ 10% av celler som återstår att reseed en ny platta.
2. Förberedelser före transfektion
_content "> OBS: Framställningen av buffertar och plasmid-DNA i steg 2,0-2,2 bör utföras i dagarna före transfektion, eftersom framställningen av dessa reagens kan vara tidskrävande.- Human 3'UTR kloner som är kompatibla med den 3'LIFE analys är tillgängliga via ett allmänt plasmiden förvar 30. Rena DNA-plasmid manuellt eller med flytande robotar hanterings. Använd en transfektion grad alkalisk lys mini-prep 96 brunnar kit och följa tillverkarens instruktioner. Resuspendera renade vektorer till ~ 100 ng / ul per brunn.
OBS: Otillräcklig luciferas signal kommer att leda om plasmid koncentration faller under 40 ng / l. - Skaffa pLIFE-miRNA vektorer 30 eller klon med hjälp av rörledningen i figur 1B 24. Resuspendera vektor vid en koncentration av 500 ng / l för varje miRNA och blankprov plasmider.
- På grund av känsligheten av villkoren nucleofection buffert, se till attden totala volymen av transfekterade material (inklusive celler och plasmider) inte överstiger 10% av den totala vätskan i varje brunn i 96-brunnars transfektion platta. För att uppnå detta, koncentrera pLIFE-miRNA plasmid lager vid en koncentration av minst 500 ng / l.
- Förbered 10x eldflugeluciferas buffertreagens (Tabell 1), och 1x Renilla luciferas buffertreagens (Tabell 2), som kan lagras i upp till 6 månader.
NOTERA: DTT i eldfluga luciferas bufferten måste som skall lagras i lösning vid -20 ° C i engångsbruk alikvoter.
3. Förbered följande punkter Omedelbart före transfektion
- Bered transfektionsbuffert innehållande PBS, 1,5% HEPES, pH 7,0. Bered denna fräscha, även om det kan lagras i upp till 1 månad vid 4 ° C utan märkbara sänkningar av transfektion effektivitet. Vid beredning av buffert och plasmid-DNA-volymer, antag 120 reaktioner för varje 96-brunnsplatta till sufficiently svarar för fel i pipettering och volym förlorade med hjälp av flytande reservoarer och flerkanalspipetter. Alikvotera 18 ul per brunn transfektion buffert (120 brunnar / 96-brunnar = 2,16 ml per platta), och ställ åt sidan.
OBS: Cell elektroporering enheten är extremt känslig för buffertbetingelser som användes för att transfektera celler. Noggrannhet när förbereder buffertar garanterar jämn prestanda av utrustningen. Extra försiktighet måste iakttas vid analysen utförs för att förhindra avdunstning av buffertar, särskilt genom att minimera den tid som bufferten täckas i mikrocentrifugrör, 96 brunnar, reservoarer och elektrodplattor. - Reserv fyra brunnar för följande kontroller, ingen pLIFE-3'UTR (för att mäta bakgrundskontroll av luciferasanalys), pLIFE-SV40 3'UTR (negativ mål kontroll), positiv kontroll för miRNA # 1, positiv kontroll för miRNA # 2.
OBS: Dessa vektorer är allmänt tillgänglig 30. Alternativt, något tidigare validerat målkan användas som en positiv kontroll. - Varma media, trypsin (0,25%) till 37 ° C.
- Till varje brunn i 96-brunnars cellodlingsplatta, tillsätt 200 | il av DMEM kompletterat med 10% FBS, 1% Pen / Strep, och placerades i en 37 ° C inkubator för användning efter transfektion.
- Slå på alla cell elektroporation enheter följt av stödprogrammet. Använd Pulse kod FF120 för HEK293T celler och PBS / HEPES-buffert.
4. Framställning av plasmid-DNA och cellblandningen
OBSERVERA: Följande protokoll förutsätter transfektering tre 96-brunnsplattor i ett experiment för en skärm med två miRNA (miRNA- # 1 och miRNA- # 2). Varje platta kommer att motsvara samma 96-brunnsplatta av pLIFE-3'UTR plasmider, och behandlas tre gånger med pLIFE-miRNA-tom, pLIFE-miRNA- # 1, eller pLIFE-miRNA- # 2.
- Förbered 3 lager av pLIFE-miRNA + transfektion buffert för varje miRNA. Detta lager bör svara för 50% (10 ^ il) av den totala volymen för varjeTja, multiplicerat med 120 brunnar. Därför bör varje lager innehålla 1,08 ml buffert + 120 pl plasmid-DNA (pLIFE-miRNA).
- Avlägsna celler från 145 mm odlingsplatta genom eluering medier, tvättning försiktigt med PBS, och behandling med ~ 5 ml 0,25% trypsin under 5 min vid 37 ° C. Neutralisera trypsin med en lika stor volym av medium, och pellets celler vid 300 xg under 5 minuter.
- Ta bort trypsin / media och resuspendera pelleten i ~ 5-10 ml media (beroende på celldensitet och korrekt urval av cellräknare).
- Räkna celler med användning av en cellräknare. Se till att cellerna är> 95% livskraftiga och inom korrekt område av maskinen.
Anmärkning: En felaktig cellräkning kan vara resultatet av extremt höga cellkoncentrationer (> 6.0x 10 6 / ml). Transfektion för många celler kan drastiskt minska effektiviteten av miRNA inriktning genom att minska plasmid: cellförhållande och / eller minska transfektion effektivitet. - Alikvotera tre rör vardera innehållande 9 x 10 6 celler, som motsvarar cellerna rbligatoriskt för transfektion av en 96-brunnsplatta. Snurra cellerna vid 300 xg under 3 min.
- Ta bort media. Var noga med att ta bort så mycket media som möjligt med minimal störning av pellets som överflödigt material kan påverka transfektionseffektivitet.
- Resuspendera cellerna i 1,2 ml transfektionsbuffert / miRNA plasmid blandning, och ställ åt sidan.
- Följande steg detalj resuspension av pLIFE-3'UTR plasmid i transfektion buffert. Då detta sker i 96-brunnsplattor, noga med att undvika avdunstning av buffert genom att täcka plattorna vid alla tidpunkter.
- Med hjälp av en multikanalpipett, flytta 32,4 pl transfektion buffert i varje brunn i en 96 väl PCR-platta (9 il [per transfektion] * 3 [plattor] * 1,2 [redogöra för pipett fel]).
- Lägg 3,6 pl (~ 100 ng / l) mini-förberedd pLIFE-3'UTR plasmid till varje brunn och blanda väl.
- Pipettera 10 | il av denna blandning till varje brunn i 96-brunnars transfektion platta och lock.
- Flytta 1,2 ml av den första cellen / buffert / pLIFE-miRNA plasmiden blandningen i behållaren. Blanda väl.
- Tillsätt 10 pl av denna blandning i den första 96-brunn transfektion platta som redan innehåller 10 ^ transfektionsbuffert / pLIFE-3'UTR. Blanda väl genom att pipettera upp och ned flera gånger.
OBS: Lika suspension av celler i bufferten kommer att säkerställa en jämn och grundlig passage av elektrisk ström genom kyvetten och maximera transfektionseffektivitet. - Placera 96 brunnar transfektion platta på cell elektroporering enheten och initiera transfektion.
- När transfektion är klar, tillsätt 100 | il av förvärmda media från 96-brunnars odlingsplatta till varje brunn i 96-brunnars transfektion platta och blanda väl. Flytta 100 | il från varje brunn i 96-brunnars odlingsplatta.
- Blanda cellerna i odlingsplatta med pipett placeras vertikalt i mitten av brunnen, som celler tenderar att aggregera på sidorna av well inte blandas ordentligt.
- Upprepa 5,1-5,5 för de återstående två plattorna.
- Rengöring 96-brunnars transfektion platta
- De 96-brunnars transfektion plattor kan återvinnas genom tvättning med 70% EtOH för att säkerställa att ingen Resthalten av nukleinsyror mellan experiment. Utför två 70% EtOH tvättar med användning av en sprayflaska för att fullständigt fylla varje brunn, följt av avtorkning överskott EtOH på elektrodremsorna (bottensidan) och tillåta transfektion plåtarna helt torr i odlings huven.
OBS: Vi har testat för carry-over DNA förorening genom transfektion 12 brunnar med 2 mikrogram pmaxGFP plasmid var i HEK293T celler, följt av en enda tvätt med 70% EtOH, och en andra transfektion utan plasmid-DNA. Med denna extremt hög plasmidkoncentration, extremt ljus reporter, och en enda tvätt, det fanns ingen observerbar fluorescens i något av de 12 upprepade transfektioner.
- De 96-brunnars transfektion plattor kan återvinnas genom tvättning med 70% EtOH för att säkerställa att ingen Resthalten av nukleinsyror mellan experiment. Utför två 70% EtOH tvättar med användning av en sprayflaska för att fullständigt fylla varje brunn, följt av avtorkning överskott EtOH på elektrodremsorna (bottensidan) och tillåta transfektion plåtarna helt torr i odlings huven.
- Kulturceller för 48-72 timmar vid 37 ° C, följt av den dubbla lucifradera analysen.
6. Cell Lysate Förberedelse för luciferas Assay
- Späd lysbuffert med 4 delar vatten, 1 del 5x passiv lysbuffert i en reservoar. Beräkna 26 ul / brunn, lägga ~ 20 extra volymer för att redogöra för förlust i behållaren.
OBS: Buffert lagras vid -20 ° C och kan vara extremt viskös, vilket sålunda före låta 5x buffert för att närma sig rumstemperaturen kommer att förbättra pipettering noggrannhet. - Analysera varje brunn för transfektionseffektivitet genom att använda fluorescensmikroskopi. Notera eventuella inkonsekvenser i brunnar som inte transfektera effektivt (> 90% transfektion effektivitet), eller uttrycker låga nivåer av RFP indikerar överbeläggning eller medie utmattning. Ta bort dessa brunnar från analysen.
- Helt ta bort mediet från cellerna, försiktigt så att inte eluera alltför snabbt vilket kommer att orsaka celler att lösgöra.
OBS: Övriga medier kommer att späda lysatet och orsaka svängningar i värden över experiments. - Lägg 26 pl lysbuffert till varje brunn, och lägg på en tallrik shaker / rocker på låg / måttlig hastighet för ~ 20-30 min. Använd denna tid att förbereda luciferas buffertar, tvätta och prima luminometer (s), och överföra lysatet till ogenomskinliga åmningen.
7. Dual Luciferase Assay
OBS: Om flera plattor som mäts i följd på en luminometer, skapa bufferthuvudblandningar med allt utom ATP och substrat, lägga till dessa reagens följt av pH-justering omedelbart före användning med varje platta. ATP och substrat kan försämras med tiden; konsekvens i tid dessa reagens är i bufferten kommer att förbättra enhetlighet över flera plattor.
- Förbered 1x luciferas buffertar (tabell 1):
- Wrap två rör (typiskt 15/50 ml centrifugrör) innehållande eldfluga och Renilla buffertar med aluminiumfolie, som substrat kan vara ljuskänsliga.
- Förbered 1x Eldflugeluciferas buffert. Tillsätt 1 ml av vardera de fem 10x eldflugeluciferas reagens, tillsats av EGTA sista, till 5 ml H 2 0 till en slut 1x koncentration.
- Lägg 0,025 g ATP till 10 ml 1x firefly buffert. Blanda genom att vända flera gånger. Håll ATP på is hela tiden. ATP bryts ned, så om mäta mer än en platta sekventiellt måste buffert göras färsk början i detta steg för varje ytterligare platta.
- Tillsätt 100 pl 100 skalbagge luciferin (substrat) (tabell 1) buffert bör ändras till gulaktig färg baserad på pH.
- 1x Renilla luciferas buffert beredning: Per 96-brunnar, portion 10 ml av 1 "Renilla buffert".
- Tillsätt 100 pl BSA (44 mg / ml lager).
- Om screening mer än en platta, separat Master Mix i 10 ml portioner.
- Tillsätt 100 pl coelenterazin att buffra (tidigare alikvoter och lagrades vid 100x konc.)
<li> Justera pH i 1x eldfluga buffert till 8,0, följt av 1 x Renilla bufferten till 5,0 med användning av NaOH och HCl.
OBS: Aktiviteten för varje buffert, och förmågan hos Renilla-buffert för att släcka Firefly luciferasaktiviteten är starkt beroende av pH-värdet. För konsekventa resultat vara extremt noggrann i det här steget. - Bringa volymen av varje buffert (motsvarande en 96-brunnars platta) till 10,5 ml för att rymma för luminometern priming.
- Välj brunnarna vara tserade (alla brunnar är standard).
- Utöka "Fördröjning före mätning" inställning till 5 sekunder, med en 10 sek mättid (se 29 för förklaring).
- Kapillär tvättsteg: vatten 3x, EtOH 3x, vatten 3x, torr 3x. Prime buffertar gång i avfallet, och sedan prime en andra gång tillbaka till buffertrören för att säkerställa blandning. Injicera firefly bufferten först och fyll den i vänster kapillär, följt av Renilla i rätt kapillär.
OBS: Flera plattor kan läsas och data som lagrats på samma Excel-fil, men problem kan uppstå med flera platta läser där luminometern programmet kommer att krascha. Var noga med att spara alla data mellan mätningar och ta skärmdumpar om programmet kraschar innan spara är möjlig.
- Byt ut gamla buffertarmed ny, var noga med att prime minst två gånger med nya buffertar innan den nya plattan.
8. Data Analysis
- Utnyttja Excel-tabeller "3'LIFE - enda skylt analys" och "3'LIFE - multiplate analys" tillgänglig från www.mangonelab.com . Kopiera rådata för eldfluga och Renilla luciferas mätningar från luminometer utdatafilen till platser som motsvarar det negativa villkoret, miRNA # 1, och miRNA # 2 i "3'LIFE - enda skylt analys" kalkylblad.
- Kalkylbladet beräknar automatiskt firefly / Renilla förhållande och normalisera varje miRNA till lämplig negativ kontroll, och normalisera förtryck värden över varje platta.
OBS: Detta kalkylblad kommer automatiskt identifiera brunnar med låg luciferas signal markerar signifikant undertryckta brunnar och tillhandahålla åtgärder repressipå över hela plattan. Se 24 för detaljerad förklaring av statistisk analys.- Kopiera värden från "normaliserad RI Index" rutan i motsvarande celler i "3'LIFE - multiplate analys" kalkylblad i det läge som motsvarar att replikera # 1 för varje testad miRNA. Upprepa för alla biologiska replikat som utförs på olika dagar.
- Om så önskas, infoga gen namn och mål förutsägelse status i kolumnerna B och D, respektive.
- Låt kalkylblad för att automatiskt beräkna medelvärdet av alla platta. Beakta data i 96-brunnsformat som en värmekarta (Figur 2). Filen arrangerar också data i listformat (Figur 2).
OBS: Förtrycket index är ett mått som används för att identifiera förmodade miRNA mål. Olika stringens parametrar kan användas, baserat på individuella preferenser. I genomsnitt anser vi sannolikt träffar under förtryck index på 0.8 och statistiskt signifikant genom t-test (p-värde <0,05). Som visas i Figur 3 potentiella mål baserade på dessa kriterier kommer att markeras i rött.
- Låt kalkylblad för att automatiskt beräkna medelvärdet av alla platta. Beakta data i 96-brunnsformat som en värmekarta (Figur 2). Filen arrangerar också data i listformat (Figur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Luminometern utdatafilen innehåller råa mätningar för både eldfluga och Renilla luciferas proteiner. Denna rå-format är kompatibelt med "3'LIFE - enda skylt analys" och "3'LIFE - multiplate analys" kalkylblad tillgängliga från labbet webbplats Mangone ( www.mangonelab.com ). Den enda skylt analys kalkylblad beräknar automatiskt firefly / Renilla förhållande, normaliserar varje miRNA till lämplig negativ kontroll, och normaliserar förtryck värden över varje platta. Detta kalkylblad identifierar automatiskt brunnar med låg Renilla luciferas signal, belyser brunnar som uppvisar förtryck jämfört med den negativa kontrollen, och ger åtgärder för förtryck över hela plattan (Figur 2). Se 24 för detaljerad förklaring av statistisk analys.
Flera replikat kan analyserad hjälp av "multiplate analys" kalkylblad. Varje kopia jämförs sida vid sida, och statistiska mått av uppgifterna beräknas automatiskt (Figur 3). Förutom att jämföra replikat med de "Normaliserad Repression" kolumner kan användaren jämföra förtrycket mellan de två miRNA under "miRNA # 1 / miRNA # 2" kolumner. Denna åtgärd skiljer förtrycket index för varje miRNA för varje kopia. Denna åtgärd kan tyda på felaktiga värden från luciferasanalysen (t ex onormalt höga eller låga värden med den negativa kontrollen, se figur 3, rad A9, Rep # 3), och brunnar där förtrycket index kan tyda på betydande förtryck, men som inte gör uppvisar betydande skillnader mellan de miRNA. Även om denna åtgärd inte kan användas direkt för att indikera en miRNA mål, är det bra för att identifiera extremvärden, problematiska brunnar, eller mönster i data som inte enbart tillskrivas direkt miRNA regulation.
Förtrycket index (RI) används för att ringa en förmodad miRNA mål, med lägre värden motsvarar högre relativ förtryck. Tröskeln för att ringa förmodade mål är baserad på graden av stringens som krävs av forskare, men kombinera RI med 3'UTRs som visar statistiskt signifikanta p-värden (p <0,05) kommer att indikera hög förtroende mål (se figur 2 rader B8 och B12).
Figur 1: 3'LIFE analys (A). Gateway-kompatibla vektorer som används i 3'LIFE analysen. Överst: luciferasgenen (Fluc) är sammansmält med test 3'UTR, medan Renilla luciferasgenen (RLuc) är sammansmält med den ospecifika SV40 pA 3'UTR som kontroll. Nederst: Den RFP- miRNA-intron vektor - Sonden pre-miRNA, plus ~ 400nukleotider inom dess genomisk lokus (att rekapitulera endogen miRNA bearbetning), klonas i en intron genom sitt samexpression med DsRed2 fluorokrom. Båda vektorer är allmänt tillgänglig (Seiler et al., 2013). (B) Flödesschema för 3'LIFE Assay. (C) 3'LIFE Pipeline: Dual-luciferas vektor innehållande test 3'UTR med eller utan miRNA vektor samtransfekteras in i HEK293-celler i 96-brunnsplattor. Samspelet mellan miRNA och en bona fide 3'UTR mål kommer att sänka den relativa luminiscens i vissa brunnar (exemplifieras av den orange plats i den experimentella plattan).
Figur 2: Exempel på data som produceras med 3'LIFE analys. Varje sond miRNA testas i fyra exemplar (replikerar 1-4). Färger representerar förtryck nivåer, med röttfärger som indikerar stark miRNA / 3'UTR interaktion. Alla replikat medelvärdes att producera förmodade mål av hög kvalitet som visas i sammanfattningen plattan under den gula pilen. Vit ruta representerar kontroller, misslyckades transfektioner eller brunnar med låg transfektionseffektivitet.
Figur 3:. Tabell representerar sammanfattningsdata av en delmängd av interaktioner som produceras med hjälp av 3'LIFE kalkyl förtrycket värden som i figur 2. Programmet beräknar standardavvikelse, standardfel och z-poäng för varje interaktion. Statistiskt signifikanta interaktioner är markerade i rött. De sista fyra raderna visar relativ förtryck av en miRNA till den andra, och används som sekundär indikator för att jämföra förtryck mellan två olika miRNA. Kalkylbladet kan laddas ner från www.mangonelab.com
| Firefly luciferas buffertreagens | Slutlig koncentration (1x) |
| Glycylglycin | 25 mM |
| K x PO 4 (pH 7,8) | 15 mM |
| MgSO 4 | 15 mM |
| DTT (förvaras vid 4º) | 1 mM |
| EGTA | 4 mM |
| ATP * | 2 mM |
| Beetle luciferin * | 250 pM |
Tabell 1: Lager firefly luciferasreagens: 10x Stamlösningar av Glycylglycin, K x PO 4, MgSO 4, DTT och EGTA kan framställas separat och lagras före buffert beredning. 100x Beetle Luciferin (eldflugeluciferas substrat) kan vara butikd genom upplösning 50 mg luciferin i 7,134 ml H 2 0 (25 mM). Alikvotera 105 ul / platta av löst Beetle luciferin i rör och förvaras vid -80 ° C. Per Promega teknisk support, bör detta vara stabila under> 6 månader, men kan vara ljuskänslig. OBS: EGTA kommer inte att gå i lösning vid neutralt pH. Tillsätt långsamt NaOH till EGTA tills det löser sig helt. * Reagens läggas till slutlig buffert omedelbart före luciferasanalysen
| Renilla luciferas buffertreagens | Slutlig koncentration (1x) |
| NaCI | 1,1 M |
| Na2EDTA | 2,2 mM |
| KH 2 PO 4 | 0,22 M |
| NaN3 | 1,3 mM |
| BSA * | 0,44 mg / ml |
| Coelenterazin * | 2,5 & #956; M |
Tabell 2: Lager Renilla luciferas buffert reagens Alla reagens utom BSA och Coelenterazine kan blandas vid en 1x koncentration och förvarades vid rumstemperatur. Coelenterazin kan lösas i surgjord metanol och alikvoterades per platta. Surgör metanol genom tillsats av HCl till slutlig koncentration av 5 mM (<3 pH). Lös 250 mikrogram coelenterazin i 2,36 ml surgjord metanol (250 M) alikvoter 105 ul / platta. Blandningen är stabil i minst 6 månader, men kan vara ljuskänslig. * Reagens sattes till buffert omedelbart före luciferasanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den 3'LIFE analysen identifierar funktionella miRNA mål i 3'UTRs i hög genomströmning. Denna analys är användbar för forskare som vill experimentellt identifiera ett stort antal förmodade mål för sin miRNA av intresse. Den 3'LIFE analysen är en kraftfull metod för att fråga efter 3'UTR driven reglering i att analysen ger en funktionell mått på miRNA inriktning, och den binära testning av en enda reporter :: 3'UTR mot en enda miRNA kan tryggt ta itu den målsökande status för enskilda gener. För att validera denna metod, skärmad vi en panel av 275 3'UTRs och mot två miRNA, låt-7c och MIR-10b, och ingår 10 tidigare godkända målgener i detta bibliotek. Åtta av dessa tio gener uppvisade förtryck 24. Vi observerade också en betydande anrikning av icke godkända bioinformatically förväntade mål och oförutsedda 3'UTRs som innehåller kanoniska utsäde element bland våra bästa hits, suggesting att 3'LIFE kan identifiera bona fide miRNA mål.
En viktig indikator på känsligheten hög genomströmning skärmar är de falska positiva och falskt negativa resultat. Även falska positiva graden av denna analys måste utvärderas med hjälp av ytterligare alternativa metoder för att validera hits, åtta av de tio positiva kontroller ingår i vår proof-of-principle skärm uppvisade förtryck, vilket tyder på ett falskt negativt med 20%. Men många tekniker som används för att identifiera miRNA mål i olika cellulära sammanhang, och 3'UTR bearbetning och reglering av trans-verkande faktorer är känd för att vara mycket vävnadsspecifika. Till exempel, de flesta 3'UTRs innehålla multipla polyadenyleringsställen, som styr längden av 3'UTR i det mogna mRNA: t. I många fall kan användning av proximala polyadenyleringsställen är vävnadsspecifik och kan utesluta miRNA målställen. Dessutom, kooperativ miRNA inriktning, konkurrens with RNA-bindande proteiner, och mRNA sekundär struktur kan alla effekter förmåga 3'LIFE att upptäcka miRNA mål i specifika vävnader. På grund av detta, kan detektion av mål vid 3'LIFE analysen varierar beroende på den cellulära sammanhanget i vilket analysen utförs, vilket komplicerar utvärderingen av absoluta felfrekvenser. Detta protokoll är optimerat för HEK293T celler, men alternativa cellinjer kan användas om forskaren önskar att utföra analysen i ett visst biologiskt sammanhang. Emellertid kommer en optimering av transfektionseffektiviteten och cellöverlevnad med varje cellinje måste optimeras med hjälp av flera buffertbetingelser, pulskoder, och antalet celler. Ett exempel på ett optimeringssystemet kan hittas på Wolter et al. 24.
Detta protokoll har optimerats i 96-hålsformat och anger användningen av vissa hög genomströmning instrumentering. När det gäller att institutionen inte har den utrustning som krävs för 96-Jo Nucleofection kunde alternativa transfektionsreagens användas för att utföra den 3'LIFE analysen, så länge som transfektionseffektiviteten förblir hög. Dessutom är luciferasanalysen den mest tidskrävande aspekt av 3'LIFE analysen. Som sådan är användningen av flera luminometrar rekommenderas för hög genomströmning skärmar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| glycylglycine | Sigma | G1127-25G | |
| Kx PO4 | Sigma | P2222 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| ATP | Sigma | FLAAS | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| CoA | Sigma | C4282 | |
| luciferin | Sigma | L9504 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2EDTA | Sigma | E0399 | |
| K H2 P O4 | Sigma | 1551139 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Coelenterazine | Sigma | C3230 | |
| PBS/HEPES | Corning | 21-040-CV | |
| DMEM | Sigma | D5546 | |
| FBS | Sigma | F2442 | |
| Pennicilin/Streptomicin | Sigma | P4333 | |
| Trypsin | T2600000 | ||
| Consumables | |||
| MaxiPrep Kit | Promega | A2392 | |
| 96-well miniprep plate | Pall | 8032 | |
| 96-well shuttle plates | Lonza | V4SP-2096 | |
| 5x Lysis Buffer | Promega | E1941 | |
| Instruments | |||
| 96-well GloMax Plate Reader | Promega | E9032 | |
| Biomech FX Liquid Handler Robot | Beckmann | A31842 | |
| 4D-Nucleofector Core Unit | Lonza | AAF-1001 | |
| 96-well Shuttle System | Lonza | AAM-1001 | |
| Cell Counter Countess | Invitrogen | C10227 |
References
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Pasquinelli, A. E., et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408 (6808), 86-89 (2000).
- Reinhart, B. J., Weinstein, E. G., Rhoades, M. W., Bartel, B., Bartel, D. P.
- Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 2 (3), 219-229 (2008).
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Wienholds, E., et al. MicroRNA expression in zebrafish embryonic development. Science. 309 (5732), 310-311 (2005).
- Darnell, D. K., et al. MicroRNA expression during chick embryo development. Dev Dyn. 235 (11), 3156-3165 (2006).
- Jin, P., Alisch, R. S., Warren, S. T. RNA and microRNAs in fragile X mental retardation. Nat Cell Biol. 6 (11), 1048-1053 (2004).
- Kim, J., et al. A MicroRNA feedback circuit in midbrain dopamine neurons. Science. 317 (5842), 1220-1224 (2007).
- Poy, M. N., et al. A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion. Nature. 432 (7014), 226-230 (2004).
- Calin, G. A., Croce, C. M.
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
- Paraskevopoulou, M. D., et al. DIANA-microT web server v5.0: service integration into miRNA functional analysis workflows. Nucleic Acids Res. 41 (Web Server issue), W169-W173 (2013).
- Krek, A., et al.
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3'UTR. Genes Dev. 18 (2), 132-137 (2004).
- Lal, A., et al. miR-24 Inhibits cell proliferation by targeting E2F2, MYC, and other cell-cycle genes via binding to 'seedless' 3'UTR microRNA recognition elements. Molecular Cell. 35 (5), 610-625 (2009).
- Cevec, M., Thibaudeau, C., Plavec, J. N. M. R. NMR structure of the let-7 miRNA interacting with the site LCS1 of lin-41 mRNA from Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 38 (21), 7814-7821 (1093).
- Shin, C., et al. Expanding the microRNA targeting code: functional sites with centered pairing. Molecular Cell. 38 (6), 789-802 (2010).
- Azzouzi, I., et al. MicroRNA-96 directly inhibits gamma-globin expression in human erythropoiesis. PLoS One. 6 (7), e22838 (2011).
- Chen, J., et al.
- Chi, S. W., Hannon, G. J., Darnell, R. B. An alternative mode of microRNA target recognition. Nat Struct Mol Biol. 19 (3), 321-327 (1038).
- Jiao, L. R., et al. MicroRNAs targeting oncogenes are down-regulated in pancreatic malignant transformation from benign tumors. PLoS One. 7 (2), e32068 (2012).
- Wolter, J. M., Kotagama, K., Pierre-Bez, A. C., Firago, M., Mangone, M. 3'LIFE: a functional assay to detect miRNA targets in high-throughput. Nucleic Acids Res. , (2014).
- Mangone, M., et al. The landscape of C. elegans 3'UTRs. Science. 329 (5990), 432-435 (2010).
- Ekdahl, Y., Farahani, H. S., Behm, M., Lagergren, J., Ohman, M. A-to-I editing of microRNAs in the mammalian brain increases during development. Genome Res. 22 (8), 1477-1487 (2012).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m(6)A RNA methylation. Nat Rev Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
- Zhou, P., et al. Large-scale screens of miRNA-mRNA interactions unveiled that the 3'UTR of a gene is targeted by multiple miRNAs. Plos One. 8 (7), e68204 (2013).
- Dyer, B. W., Ferrer, F. A., Klinedinst, D. K., Rodriguez, R. A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis. Anal Biochem. 282 (1), 158-161 (2000).
- Seiler, C. Y., et al. DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research. Nucleic Acids Res. , (2013).
- Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455 (7209), 64-71 (2008).
- Ebert, M. S., Sharp, P. A. Roles for MicroRNAs in Conferring Robustness to Biological Processes. Cell. 149 (3), 515-524 (2012).
- Pelaez, N., Carthew, R. W. Biological robustness and the role of microRNAs: a network perspective. Current Topics in Developmental Biology. 99, 237-255 (2012).
