Abstract
Protein sentezi, çeşitli biyolojik süreçleri çevresel koşullara özellikle adaptasyon etkileyen gen ifadesi temel bir süreçtir. MRNA başlangıç kodonu da dahil olmak üzere ilgili eIF4G1 başlatma faktörü ribozomal alt birimlerinin düzenlenmesine içeren başlangıç aşaması. Çevirinin bu oran sınırlayıcı bir aşama kusurlar, çeşitli bozuklukları ile bağlantılıdır. Bu tür özerkleştirmeler olası sonuçlarını incelemek için, Xenopus oositler insanla temel hücresel ve moleküler mekanizmaları korunması yüksek derecede çekici bir model teşkil laevis. Buna ek olarak, mayoz olgunlaşma sırasında, oosit transkripsiyonel bastırılmış ve gerekli tüm proteinleri önceden var, maternal mRNA'lardan çevrilir. Bu ucuz modeli etkin bir çeviri ile mükemmel entegre olmak için eksojen mRNA sağlar. Burada (eIF4G1 here) ilgi konusu bir faktör ile çeviri değerlendirmek stor kullanmak için bir protokol açıklananİlk olduklarını anne mRNA ed poliadenile ve fizyolojik okuma olarak oosit olgunlaşması sırasında tercüme edilecek. İlk başta, mRNA ilgi plazmidler (buradan eIF4G1) in vitro transkripsiyonu ile sentezlenmiş oluşum safhası torbacığı yarılmasının tespiti ile oosit ve oosit olgunlaşma kinetiği enjekte edilir belirlenir. Çalışılan anne mRNA hedef, serin / treonin protein kinaz mos olup. Bu poliadenilasyon ve daha sonraki için oosit olgunlaşmasında yer alan sinyalleme kaskadında mos proteinlerinin ekspresyonu ve fosforilasyon ile birlikte incelenmiştir. Geçerli protokol Varyasyonları ortaya koymak için öteleme kusurları da genel uygulanabilirliğini vurgulamak için önerilmiştir. Anormal protein sentezinin nörolojik bozuklukların patogenezinde olabilir dair kanıtlar ortaya ışığında, böyle bir model kolayca bu bozukluğunu değerlendirmek ve yeni hedefler belirlemek için bir fırsat sunuyor.
Introduction
Proteinler organizmanın daha büyük ölçekte temel hücresel yaşam elemanları ve bu nedenle bulunmaktadır. Onlar yapısı, ulaşım, reaksiyon kataliz, yönetmelik, gen ifadesi vb Onların ifade protein içine bir mRNA'nın dönüşümünü sağlayan çeviri karmaşık bir mekanizmanın sonucudur içeren hücresel fonksiyonlarının çoğunu sağlamaktadır. Için uyarlamak ve gelişme ve farklılaşma, yaşlanma, fizyolojik baskılara ya da patolojik seyri sırasında, hücre ihtiyaçlarına göre gen ifadesini düzenlemek için çeşitli kontroller tabi tutulur.
Kap-bağımlı, kap-bağımsız İç Ribozom Giriş Segment (IRES) yapıları ve kap-Bağımsız Çeviri arttırıcılar (via: Çeviri 3 başlatma çeviri sistemleri bu ihtiyaçlara cevap vermek amacıyla, 3 aşamadan (başlatma, uzama ve sonlandırma) ve hediyeler ayrılmıştır ) CITE.
Çoğu eukaryotik mRNA bir kap-Depe çevrilirProtein sentezi sırasında bir tanıma özelliği olarak hizmet vermektedir 7-methylguanosine 5'-trifosfat kapağı aracılığıyla ndent şekilde. Bu kapak eIF4E, eIF4G1 ve eIF4A ile eIF4F kompleksi bileşenine bağlanır. Poli (A) bağlayıcı protein (PABP) gibi diğer ortaklarla ilişkili elF2-GTP-Met-tRNA Met, bu çeviri başlatma faktörleri mRNA sirküler ve tanınması 1 kodon Ağustos başlatılması kadar formlara 43S kompleksi olan erişilebilirliği iyileştirmek için izin verir. Bu olay, translasyon başlatma yani, çeviri birinci etabının sonuna karşılık gelmektedir.
Cap bağımsız için, örneğin hücre çoğalmasının ve apoptozun için neden stresli koşullar altında esas proteinler için kodlayan mRNA tarafından kullanılır. Bu mekanizma, mRNA ikincil yapısını içerir 5'-çevrilmemiş bölümü (UTR) IRES adlandırılan eIF4A ve 43S kompleksi ile ilişkili eIF4G1 karboksi-terminal ucu. Bu 43S, ön başlatma c bağlanmasınınIRES için omplex eIF4E faktörü 2,3 gerek kalmadan kapak bağımsız çeviri başlatır.
MRNA UTR 4 içinde yer alan yapıların CITE aracılığıyla Nihayet, yine iyi anlaşılmış değildir başka bir çeviri mekanizması vurguladı şartlar altında bu kap-bağımsız çeviri etkinliğini destekler.
Kendi başlatma aşamalarının göre farklı tercüme bu çeşitli modları ile, çeviri, hücresel homeostazında kritik bir rol ve böylece büyük ölçekli etkileri küçük organizmaya etkisi olur, bu işlemlerin biri herhangi bir değişiklik oynar. Nitekim, başlatma proteinlere mRNA doğru çeviri süreçlerini yöneten bir oran sınırlayıcı bir adımdır ve bu nedenle çok sayıda kontrol ve düzenleme noktalarının 5 hedefidir. Ikincisi için ya da bu işlemlerin bileşenleri için olsun biri arızalı olduğu ortaya çıkarsa, bu hücrede kurulan dengeyi bozacak ve böylece patolojik Condi yol açabilirleri. Bu bağlamda, çeviri faktörlerinin mutasyonlar, potansiyel olarak, beyaz matter' (eIF2B1-5 alt-birimi) 6, Walcott-Rallison sendromunda (Perk için EIF2AK3 kodlayan gen) 7, ufuk ile lökoensefalopati `gibi nörodejeneratif bozukluklar dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda yer almışlardır Parkinson hastalığı (eIF4G1 p.R1205H) 8. Bu hastalık gelişimi üzerine ve çeviri inisiyasyon genel sürecine bilgimizi artırmak için bu mutant proteinlerin hücresel ve moleküler çalışmalar yapmak için bu nedenle önemlidir.
Bu çalışmaları yürütmek için, bu mutasyonların sonuçlarını gözlemlemek için en uygun modelleri seçmek için esastır Xenopus oositler, özellikle de onların fizyolojik ve biyokimyasal özellikleri nedeniyle uyarlanmış laevis. Fizyolojik eşzamanlılık (hücre döngüsünün faz G2 bloke) , protein sentezinin yüksek kapasiteli (200-400 ng / gün / oosit), ekstre solüsyonu ° yüksek sayıdaaynı hayvandan ytes (800-1.000 oosit / kadın) ve manipülasyonunu daha da kolaylaştırır hücre boyutu (çapı 1.2-1.4 mm). Sentezlenen mRNA ile Xenopus oosit Mikroenjeksiyon kolayca tercüme adımları incelemek için yapılabilir. Bu görüşe göre, diğer avantajlar sağlar. Mayoz ilerleme hızı ve çevirinin mRNA mikroenjeksiyon (~ 24 saat) sonra göz önüne alındığında, Xenopus oosit yeniden hücresel (E.coli çıkarılan, buğday mikroplar veya tavşan retikülosit ...) sistemleri bir mRNA olduğu karşılaştırıldığında hızlı bir sistemi temsil azaltılmış tercüme oranıyla ve düşük bir hızda çevrilmiştir. Yani, bir mRNA tanıtılan bir mutasyonun etkisi hızla gözlemlenebilir ve kolayca birkaç oositlerinde okudu olacaktır. Xenopus oositleri diğer bir avantajı, maternal mRNA'lar latent ve protein için projesteron uyarması önce engellenmiş olmasıdır. Progesteron eklenmesi dolayısıyla çeviri indüksiyon kontrol için iyi bir araçtır. Sitoplazmik polyadenylation oogenez sırasında meydana gelmez. Bu zamansal sırayla progesteron uyarılmış oosit oosit olgunlaşması sırasında başlar ve erken gelişme boyunca devam eder ve çevirinin farklı adımları incelemek için kullanılabilir.
Mos mRNA poliadenilasyon meydana ilk arasındadır ve Charlesworth ark tanımlanan "erken olgunlaşma" genlerin sınıfına Aurora A / EG2, Histone Benzeri B4 mRNA ile aittir. (2004) 9. Böyle Cyclin A1 ve B1 Siklin olarak "geç" mRNA öteleme indüksiyon germinal vezikül arıza (GVBD) zamanında etrafında oluşur. Mos mRNA, bir serin / treonin protein kinazın-kodlar. Dolaylı oosit olgunlaşmasını aktive MAP kinaz kaskad indükler beri çeviri önemlidir. Gerçekten de, progesteron tepki olarak, mos mRNA poliadenilasyon eg2 düzenleyici proteinleri ve inci başka RNA bağlanma proteinleri Aurora A / kapsayan bir işlem ile arttırılırmos mRNA'nın e 3'UTR içerir. Mos mRNA bu artan poliadenilasyon da MEK1 aktive mos proteini seviyesinin bir artışa yol açar. Bu işlem, hücre dışı bir sinyal ayarlı kinaz 2-(ERK2) (Şekil 1) ait aktivasyon aracılık eder. Bu sinyal yolunun daha sonra faktör teşvik olgunlaşma M-fazı, Siklin B, Cdc2 kinaz tarafından oluşturulan bir kompleks tetikler ve sonunda öz değişmesine ait yeniden başlamasını sonuçlanır olabilir.
Xenopus oosit laevis nedenle, bu tür mos gibi anne mRNA çalışma kolayca birkaç mos, bileşenler sinyal de GVBD oranının belirlenmesi de dahil olmak üzere çeviri onların verimli poliadenilasyonu birkaç uç noktaları ile çevirilebilirlik test etmek için kullanılabilir. Bu sistem, yeni transkripsiyonu mRNA veya transfeksiyon verimlilik müdahalesi olmadan çeviri başlatma faktörleri mutasyonların ilk sonuçlarını değerlendirmek, bu nedenle ilginç sorunlar sıklıkla eukary ile meydana gelenotik hücre çalışmaları.
Burada, bir protokol Xenopus oosit laevis ve anne mRNA çeviri test edilir mutant eIF4G1 mRNAlar microinjected nerede kurulmuştur. Oosit mayoz hücre döngüsü boyunca ve erken ve geç sınıf mRNA'larının sonraki çeviri için ilerlemesi için gerekli olan bir GVBD ilerlemesinde defekt, mos mRNA polidenilasyondan huzurunda tespit edilmiştir. Fosforilasyonu Aurora A / EG2 ve ERK de mos deregulation.Thus sonucunu doğrulamak için çalışılmıştır, Xenopus oositler mRNA çeviri farklı adımlar analiz için basit bir yol gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm Xenopus deneyleri laboratuvar hayvanları deney için Avrupa Topluluğu Konseyi yönergelerine (86/609 / EEC) kurallarına göre Lille 1 Üniversitesi'nin hayvan tesisinde gerçekleştirildi. Hayvan protokolü (Comité d'Ethique en Deneme Animale Nord-Pas-de-Calais CEEA 07/2010) yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmıştır.
1. Oosit İşleme
- Anestezik hazırlayın: steril su, bir 1 L tricaine metan sülfonat tozu 1 g çözülür.
- Kadın Xenopus bu çözüm içine laevis Dalma, kaçış önlemek ve hayvan tamamen (bir bacak tutam herhangi bir tepki olmadan) sedasyon olmak için yaklaşık 45 dakika beklemek zorunda beher kapsamaktadır.
- Daha sonra temiz bir alüminyum folyo üzerine sırtında hayvan koyun sabunla yıkayın kurbağayı ve musluk suyu ile durulayın.
- Karın yan kısmında ve forseps ile yumurtalıklar düzeyinde cildi Kelepçe.Etanol% 70 ile kullanılmadan önce temizlenmelidir makasla yaklaşık 1 cm'lik bir kesi olun. Bölüm yeterince derin olduğundan emin olun ve çeşitli gelişim aşamalarında çeşitli oosit bulundu edildiği yumurtalık dokusunun çıkarılmasını sağlamak için altta yatan karın duvarı ulaşmak için.
- ND96 ortamı (96 mM NaCI, 2 mM KCI ile bir Petri kabı (50 mm) olanağına 4 kez yıkayın, yumurtalık loblar teşrih, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 5 mM HEPES, NaOH ile pH 7.4'e ayarlanmış takviye 50 ug / ml streptomisin / penisilin, 225 ug / ml sodyum piruvat, / ml soya fasulyesi tripsin inhibitörü, 30 ug, 1 ul / ml tetrasiklin) kan ve döküntü tüm izlerini silmek için.
Not: Tetrasiklin optimal koruma ve mikroenjeksiyon tedavisi sonrası iyi bir iyileşme sağlar. - Bir hafta boyunca kendi koruma sağlayan, 14 ° C 'de ortam içine kapalı bir Petri tabağına saklayın.
- Karın duvarı ve veteriner emilebilir t ile cildi Dikişhread ve dikiş iğnesi (3 ya da 4 dikiş gerekli olacaktır).
- Su olmadan beher hayvan koyun ve kurbağa tekrar hareket kadar musluk suyu ile cildi nemli. Kaçmasını önlemek için beher örtün.
- 10-kat büyütmeli bir stereomikroskop altında forseps 2 çiftleri kullanılarak dikkatli bir şekilde 5 ila 10 oosit gruplarda orta yumurtalık loblar ayırın. Sahne VI Seçin oositler. Bu, kahverengi bir pigmentli hayvan kutup çapında 10 1.2 mm ii) boyutları her türlü açık bir kayış ile ayrılan sarı bir bitki kutuplu i) kendi şekil ve renk tanınabilir.
- (Kolajenaz oosit / folikül hücresi bağlantısına digests) oosit defolliculation kolaylaştırmak için 45 dakika boyunca hafif hafif çalkalamak suretiyle bir Petri kabındaki (tetrasiklin olmayan ND96 içinde çözülmüş Clostridium histolyticum'dan, 1 mg / ml kollajenaz A) kolajenaz çözeltisi seçilen oositlerin inkübe edin. ND96 ortam ile 3 ya da 4 kez 14 tutulan oosit durulayın° C.
Not: oosit az ya da oosit yüzey proteinleri tahrip ve yoksul canlılığı neden riski nedeniyle fazla 45 dakika inkübe etmeyin. Kollajenaz tedavisi kendiliğinden GVBD indükleyebilir. - 3-4 saat boyunca ortam içinde oosit inkübe edin. Binoküler büyüteç altında ince cımbız ile foliküler hücreleri çıkarın ve ND96 ortamında 19 ° C'de saklayın.
MRNA Synthesis 2. Hazırlık
- I enzim PME ile enzimatik sindirme ile aşağıdaki plazmidlerle 5 ug Linearize.
NOT: pcDNA6.2 / a 1599 amino asitler eIF4G1 cDNA vahşi tip (eIF4G1-WT; NM_198241) içeren V5-DEST mutasyonları c.2105T ile, bir eIF4G1 dominant negatif cDNA (eIF4G1-DN) içeren pcDNA6.2 / V5-DEST > G c.2106A> C, c.2120-> G, c.2122T> A, 2125T> - ve c.2126T> G karşılık gelen protein içindeki 618 pozisyonuna 612 eIF4G1 ve eIF4E arasındaki etkileşim bölgesinde rahatsız etkileşim between eIF4G1 ve eIF4E 8 chloramphenicol acetyl transferase ihtiva eden pcDNA6.2 / C-EmGFP (GFP). 3 plazmidlerin her biri için 2 karışımları hazırlayın: I enzim de dahil olmak üzere, ilk ve ikinci PME kontrol olarak enzimsiz. - Klasik bir etanol prosedürü kullanılarak plazmid DNA çökelti ve nukleazsız H2O 20 ul içinde tekrar süspansiyon haline getirin
- Bir spektrofotometre kullanılarak konsantrasyonunu belirleyin. Konsantrasyon cRNA yazıya ul 150 ng / üstün olmalıdır.
- Plazmid doğrusallaştırma doğrulamak için 1 ul numune ve% 0.8 agaroz jeli üzerinde yükleme tamponu, 5 ul ile kontrol çalıştırın.
- In vitro transkripsiyonu, üreticinin talimatlarına göre cRNA saflaştırılması için bir kit kullanın. Transkribe cRNA, nukleazsız H2O 20 ul içinde tekrar süspanse edilir Gerekirse Numuneler -80 ° C'de saklanabilir.
- 0.2 M MOPS (pH 7.0), 20 m ihtiva MOPS 10X geçiş tamponu hazırlayınM sodyum asetat ve 10 mM EDTA (pH 8.0). 0.45 um filtre ile çözelti sterilize edin. Çözelti oksidasyonu önlemek için oda sıcaklığında ışıktan korunur çözelti stok.
- NaOH, HCl ile art arda elektroforez tankı temizleyin ve iyice bir O çift-filtrelenmiş su ile durulanır / N RNAaz ari önlemek ve RNA bozulmasını önlemek için.
- MOPS ve formaldehit içeren% 1.5 agaroz jel Cast. Tam agaroz çözülünceye kadar sıcak ve 55 ° C'ye kadar soğumasını bekleyin. Davlumbaz altında, MOPS 10X 0.1 hacim, formaldehit% 6.6 ve etidyum 4 mikrogram (10 mg / ml) ekleyin. Davlumbaz altında jel dökün ve jel sertleşmesine yaklaşık 1 saat bekleyin.
Not: Formaldehit ve etidyum bromür toksiktir. - CRNA 1 ul, formaldehit% 8.8, formamit 60 ve% MOPS 10X 0,1 hacmi ile 0.2 ml tüp içinde göç örnekleri hazırlayın. 70 ° C 'de 3 dakika süre ile inkübe edilir ve 10 dakika süreyle buz üzerinde tüpler koydu. Santrifüj örnekleri Birkaç saniye at5000 x g. , Jel yükleme tampon maddesi, 2 ul ekle.
Not: Formamid toksiktir. - 90V, 20 dakika boyunca numune çalıştırın. CRNA kalitesini kontrol etmek için analiz etmeden önce jel destain için nukleazsız H 2 OO / N jel bekletin.
- Bir spektrofotometre kullanılarak cRNA konsantrasyonunu belirleyin ve -80 ° C'de saklayın.
Sentezlenen RNA ve Oosit Olgunlaşma Uyarım 3. Mikroenjeksiyon
- Oosit mikroenjeksiyon için gerekli ekipman hazırlayın. Küçük cam kapiller çekmek için bir mikropipet çektirmesi kullanın. Stereomicroscope altında, kör bir uç oluşturmak için cımbız ile kılcal ekstremite kesiyorum. Karşı ucunda, bir Millipore 0,45 mikron filtre ile 1 ml şırınga kullanarak, mineral yağ ile kılcal mikropipet doldurun. Mikroenjeksiyon pipet üzerine mikropipet monte edin. Uygun cam kapiller ile kullanıldığında iyi doğruluk vermek için üretici tarafından kalibre doğru mikropipet seçin.
- Mikroenjeksiyon defolliculation sonra 1-2 saat gerçekleştirin, oosit üzerinde oosit kurtarma için gerekli gecikme 14 ° C'de muhafaza. Alt Kullan Petri kapları oositler için bir yapıştırıcı yüzey oluşturmak ve ND96 ortamı onları doldurmak için forseps ile kazınır.
- 45 ° C 'lik bir açıda kılcal mikropipet ile oosit ardışık enjekte etmeyi sağlamak bir Petri kabındaki kazınmış şerit boyunca oosit düzenlemek.
- Sitoplazmada örneklerin optimal difüzyonu için pigmentli, hayvan alanının altında, oosit ekvatoryal mıntıkasında enjekte edilir. Derinliği yaklaşık 150-200 mikron üzerinde kılcal ucu sadece ince bir kısmını yerleştirin.
- Bir birinci oosit içinde 60 nl bir hacimde farklı plazmid sırasıyla elde edilen cRNA 30 ng enjekte edilir. Enjeksiyon sonrası, numune kaçış (Şekil 2A) önlemek için kılcal ucu çıkarmadan önce 5-10 saniye bekleyin.
Not: 120 nl aşmayın. Yavaş olabildiğince enjekte edilir. Damıtılmış su olan bir kontrol yapılması tavsiye edilir. - Bir sonraki oositi enjekte elle Petri kabı taşıyın.
Not: İpucu 2 ila 3 microinjections sonra banyo solüsyonu dışarı küçük bir darbe oluşturarak tıkanmış olmadığından emin olun. - 24 kuyu kültür plakaları içinde Aktarım enjekte edilmiş oositler (10 oosit / oyuk), taze ND96 ortamının 3 ml ile doldurulur ve 19 ° C'de bırakın.
- , 19 ° C de mayoz olgunlaşmasını (GVBD) tetiklemek için progesteron (PG) (2 ug / ml) ile ND96 içinde oosit inkübe 15 saat veya pcDNA6.2 / V5-DESTeIF4G1 ve pcDNA6 sırasıyla elde edilen poliadenile edilmiş cRNAs mikroenjeksiyon 4 saat sonra 0,2 / C-EmGFP bir kontrol (Şekil 2A) olarak kullanılır.
Not: cRNA ile floresan markör ortak enjeksiyonu cRNA enjekte edilmiş ve oosit kalmıştır sağlamak için iyi bir araçtır. GFP etiketi ile ilgi bir cRNA kullanarak bu tür ön deneyler yapın. - Microinject olarak içerisinde 3,5 farklı oranları (1: 3; 2: 2: 3: 1) te üzere eIF4G1-WT ve eIF4G1-DN cRNAs poliadenile arasındast mutant fenotipinin (Şekil 2B) üzerindeki eIF4G1-WT cRNAs translasyon etkisi.
4. Germinal Vesikül Arıza Tespiti
- Bir stereomikroskopta siyah hayvan kutup beyaz bir nokta varlığını gözlemleyerek PG uyarıldıktan sonra olgun oosit sayısını. 20-4 saat (Şekil 2B, 2C) kadar saymaya her saat tekrarlayın.
5. Western Blot (WB) analizi
- 50 mM Hepes, pH 7.4, 500 mM NaCl,% 0.05 SDS, 5 mM MgCI2, 1 mg aşağıdaki tampon maddesi içinde 200 ul 4 ° C 'de, 10 arka oositler ve bir mikro pipet ile ortaya hareketlerin grubu homojenize / ml büyükbaş hayvan serum albümini, 10 mg / ml löpeptin, 10 mg / ml aprotinin, 10 mg / ml soya fasulyesi tripsin inhibitörü, 10 mg / ml benzamidin, 1 mM PMSF, 1 mM sodyum vanadat.
- 10,000 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj örnekleri lipid (üst faz) ve zar (alt faz) f çıkarmak içinkasılma konsantrasyona. Protein konsantrasyonu belirlemek ve Laemmli veya Bis-Tris numune tamponu ile geri kalan tamamlamak için bir alikot depolamak, sitoplazmik bölümünü kazan (1: 1).
Not: Bis-Tris jelleri ve yükleme tamponu hidrolizinden proteinleri koruyan daha nötr pH değerine sahip - 10 dakika boyunca 95 ° C'de örneğin 20 ug ısıtın. Akrilamid jel kuyu içine her bir örnek yükleyin. Uygun tampon maddesi ile bir tankta jel yerleştirin.
- 200 V'de 1 saat boyunca bir elektroforez gerçekleştirme
- TBS pH bir WB 8,0 Gerçekleştirmek (Tris-HCl 15 mM, NaCl 150 mM Tween% 0.1;% 10 bovin serum albümini), bir keçi anti-Aurora A / eg2 (1: 3000, 2 saat) ile birlikte ya da bir tavşan anti-ile -Aurora A / eg2-P (1: 4 ° C 'de 1000, O / N), fare anti-ERK2 (1: 3000, 2 saat), keçi anti-ERK2-P (Tyr204) (1: 3000, 2 saat 10.000, 2 saat) ve tavşan anti-Rsk (1:), tavşan anti-ay (1: 5000, 4 saat), tavşan anti-GFP (1: 3000, 2 saat) antibodies.Use fare anti-V5 antikorları (1 : yükleme kontrolleri gibi 1000, 2 saat) ().
- YıkamaMembran 3 kez 10 dakika için TBS-Tween ile 1 saat inkübe edilir, 1 seyreltilerde bir anti-fare ya da anti-tavşan veya anti-keçi (IgM) bayır turpu peroksidazı etiketli ikincil antikor ya: 5000, 1: 7500 ve 1 : sırasıyla 5.000.
- TBS-Tween 10 dakika süren 3 yıkama yapın ve Advanced ECL Detection sistemi ile antijen antikorlarının kompleksleri tespit.
6. Poliadenilasyon Deneyi
- Örnek 1.5 ml koşulu başına 5 oosit. Nukleazsız PBS 1X (pH 7.4), 1 ml ile yıkanır. Aşağıdaki adımlar davlumbaz altında yapılacaktır.
- (Üretici talimatlarına bakın) klasik organik prosedür kullanılarak RNA ayıklayın.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüje (10000 x g) RNA kurtarmak. 10 dakika boyunca supernatant ve hava kuru RNA çıkarın.
- Nukleazsız H2O 30 ul içinde süspanse RNA topağı
- Yeni bir tüp içinde numunelerin 15 ul alın ve nukleazsız H 2 O 85 ul ekleyin Temizlemekse örnekleri, üreticinin talimatlarına uygun olarak silisyum dioksidin kolonu üzerinde kalitesini artırmak için. Nukleazsız H2O 30 ul kullanarak, RNA yı Zehir
- RNA bütünlüğü kontrol etmek için bir% 0.8 agaroz jeli üzerinde yükleme tamponu 5 ul numune 1 ul çalıştırın.
- Bir spektrofotometre kullanılarak RNA konsantrasyonu belirleyin.
- Koşul başına 2 ligasyon karışımları hazırlanması (örneğin, eIF4G1-WT, eIF4G1-DN ve H2O kontrol), aşağıdaki reaktifleri ile: RNA ligaz 10 U, 10X tampon maddesi 0.1 hacim, 1 mM ATP, 50 PEG8000,%% 10 , primer P1 (5'-P-GGTCACCTTGATCTGAAGC-NH2-3 ') 11 ve nukleazsız H2O ile 10 ul son hacim getirmek 0.1 ug PG uyarılma olmaksızın oosit elde edilen ilk karışım RNA ekleyin ve PG elde edilen ikinci karışım RNA oosit uyarılmış.
- Enzimler inaktive edildi, 65 ° C de 20 dakika ve sonra 37 ° C'de 1 saat süreyle inkübe edin.
- Bizeea cDNA Ters Transkripsiyon (RT) kiti. Tüp başına, RT karışım hazırlayın: 10X RT tamponu 0,1 hacim nukleazsız H primer P2 (5'-GCTTCAGATCAAGGTGACCTTTTT) 10, 4 mM dNTP karışımı, ters transkriptazın 50 U ve 0.1 ug tam bir nihai hacme 2 O 10 ul. Yukarıda elde edilen ligasyon reaksiyonunun 10 ul ekle. Üretici tarafından tarif edilen koşullar altında RT gerçekleştirin.
- (PCR) karışımı, tüp başına Polimeraz Zincir Reaksiyonu hazırlayın: tampon 10X 0.1 hacim, 1.5 mM MgCI2, 133 uM dNTP karışımı, 0.2 uM spesifik primer, 0.2 uM primer P2, 0.025 U Taq polimerazı, cDNA 1 ul ile komple nukleazsız 50 ul nihai hacme kadar H2O. Aşağıdaki koşullar altında PCR yapın: 50 ° C, 2 dakika, 10 dakika boyunca 95 ° C, [30 saniye için 1 dk için 95 ° C, 56 ° C, 30 sn için 72 ° C] için 40 döngü, 72 ° C 10 dakika 9. Şöyle spesifik primerler şunlardır: mos GTTGCATTGCTGTTTAAGTGGTAA Histon benzeri B4 AGTGACAAACTAGGCTGATATACT; Siklin A1, CATTGAACTGCTTCATTTTCCCAG; Siklin B1: GTGGCATTCCAATTGTGTATTGTT 9.
- % 3 agaroz jel hazırlayın. Her bir PCR ürünlerinin yükleme tamponu 10 ul ekle. Optimal göç 110 V numunelerin 10 ul jel çalıştırın. Tercümelerine için bir ön koşuldur kuyruk poli (A) ve böylece RNA olgunlaşma süresini yansıtan boyutta bir değişikliği gözlemek için 10 ve 20 dakika sonra jel analiz eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PG stimülasyon 24 saat (Şekil 2B, 2C) sonra, Xenopus oositlerde ve yüzde oosit GVBD belirlenmesi kinetik olgunlaşma
EIF4G1-DN mutasyon translasyon sonuçlarını incelemek için, Xenopus PG'ye yanıtı (2 H, O, GFP) eIF4G1-WT ve diğer kontrol koşulları mukayese edilir cRNA eIF4G1-DN microinjected oosit laevis. Kontroller bakılmaksızın enjekte cRNA veya eIF4G1 aşın doğanın oosit mikroenjeksiyon insidansını değerlendirmek için etkinleştirin.
Microinjected Kontrol koşulları ile karakterize 10 oosit (H2O ve GFP) kinetik matürasyon WT ile benzerdir ve GVBD geçiren sayısı PG uyarılması (Şekil 2B) sonra çok 12, birbirine yakın ve 24 saattir. 24 saat sonra, oosit olgunlaşması (Fi WT 95,7%, GFP için H2O ve% 97.5 için 97,1% ulaştığında şekil 2C). Bu nedenle, H 2, O ya da kontrol cRNAs ya eIF4G1 cRNAs sahip microinjections oosit mayoz Yayım üzerinde çok az etkisi vardır. Tersine 8 saat PG uyarıldıktan sonra, GVBD geçiren eIF4G1-DN cRNAs microinjected oositlerin sayısı eIF4G1-WT cRNAs (Şekil 2B) önemli ölçüde 85,8% oranında azalır eIF4G1-WT oositlerde karşı eIF4G1-DN .bir mayoz sürümüne göre, gecikmeli ve 12 saat sonra 77,4 ve% 24 saat, sırasıyla PG uyarılması (Şekil 2C) sonra. Bu 13 saat PG uyarıldıktan sonra, olgun oosit sayısı, maksimum PG uyarıldıktan sonra sadece 20 saat elde edildiği için eIF4G1-DN hariç tüm koşullar için bir maksimuma ulaşır olması da dikkat çekicidir. Bu nedenle, eIF4G1-DN mutasyonun varlığı eIF4G1-WT ile karşılaştırıldığında daha düşük oosit mayoz salınıma yol açar.
EIF4G1-WT (Şekil 2D) için eIF4G1-DN sayesinde varlığında oosit olgunlaşma Restorasyonu:
_content "> eIF4G1-DN cRNA mikroenjeksiyon bozulur veya bloke oosit olgunlaştırma, eIF4G1-WT ve eIF4G1-DN cRNAs farklı oranları-mikroenjeksiyon eş olup olmadığını belirlemek için. Bu koşullar altında, oosit olgunlaşmasının bir artış düzeyleri olarak gözlenen eIF4G1-WT cRNA yükseltmek ve eIF4G1-DN cRNA decrease.While olgunlaşma kişilerce eIF4G1-DN cRNAs bir doz gametlerin% 17.5 gözlenir, bu yüzde eIF4G1-WT cRNAs 3 doz eş mikroenjeksiyon ile 76,7% ulaştığında eIF4G1-WT cRNAs bir doz varlığı oosit olgunlaşma% 95 neden olur. Bu deney, eIF4G1-DN microinjected Xenopus oosit olgunlaşması kusur, geri dönüşü olmayan değildir ve kısmen geri de göstermektedir.Öncesi ve PG stimülasyon (Şekil 2E) sonra çeviri yeteneği bir göstergesi olarak WB gözlenen proteinleri sinyalizasyon İfade mos:
EIF4G1-WT ve eIF4G eksprese eden oositlerde, V5 etiketinin protein seviyesi1-DN benzer mikroenjeksiyon verimliliğini yansıtan benzer. Protein yükleme kontrolü olarak kullanılan Rsk protein seviyesi de daha önce ve PG, stimülasyon sonrasında tüm koşullarda benzerdir. GFP protein ekspresyonu uyarılmış ya da PG ile GFP cRNA ile microinjected oositlerde mevcuttur. Bu veriler, mikroenjeksiyon ve eF4G1 fazla sentezlenmesi GFP çeviri bozmayan gösterir. Bununla birlikte, hiçbir GFP protein ifadesi önce ve eIF4G1-DN eksprese eden oositlerde, PG uyarıldıktan sonra tespit edilebilir. Beklendiği gibi, endojen mos sentezleme PG uyarı olmadan saptanabilir. Buna ek olarak, mos ifade eIF4G1-WT görülmektedir ve H 2 O kontrol koşulları önceki sonuçlar eIF4G1-WT o aşın gösteren ile anlaşarak PG uyarıldıktan sonra endojen mos 16 küçük sonuçları vardır. Tersine, mos ifade hatırı sayılır bir düşüş PG uyarıldıktan sonra fark edilir.
Profesyonelkaskad sinyalizasyon mos bazı bileşenlerin tein ifadesi de test edilir. Örneğin, Aurora A / EG2 protein indüksiyon ve protein deregülasyon veya PG stimülasyonu görülmektedir sonra uyarılan onun fosforile formunun hiçbir algılama mos için yukarı hareket ediyor. Tersine, mos neden ERK2 fosforilasyonu bir serbestleşme eIF4G1-DN mevcudiyetinde gözlenmektedir.
Bu sonuçlar, protein ve mos bağımlı ERK2 aktivasyonu içine mos RNA 'nın endojen ekspresyonunun eIF4G1-DN sentezlenmesi tarafından etkilenmiştir ortaya koymaktadır.
mRNA Poliadenilasyon (Şekil 2F):
Xenopus için gerekli birçok mRNA (mos, Siklin A1, B1 Siklin ve Histone benzeri B4) poliadenilasyon mayoz kurtarma test edildi oocytes. Gerçekleştirilen deney, mRNA'nın poli (A) kuyruğunun uzunluğuna tekabül amplimer boyutunda bir artış PG uyarıldıktan sonra mevcut olup olmadığını belirlemek için olanak sağlar. Gerçekten de, PG uyarım, poli (A) kuyruğunun ilave eIF4G1-DN mutasyonu dahil olmak üzere, her durumda görülmektedir.
MAPK kaskad aktivasyon Şekil 1. şematik bakış. Hormonal stimülasyonu üzerine Aurora A / EG2 ve CPEB yolunun da dahil olmak üzere meydana birçok enzimlerin aktivitelerinde PG hızlı değişimlerin tarafından. Aurora A / EG2 hiperfosforilasyonu CPEB için (Sitoplazmik Poliadenilasyon Eleman Binding Protein) fosforlanmasını yol açar. Fosforile edilmiş CPEB, mos mRNA 3'UTR ilgili CPE (Sitoplazmik poliadenilasyon Element) tanır CPSF (Parçalama ve poliadenilasyon Özelliği Factor) acemi ve PAP (Poli (A) Polimeraz) mRNA poliadenilasyonu aktive eder. PG stimulasyon da PKA ve CDK1, Maskin / eIF4E disosiyasyon ve eIF4E / eIF4G1 esas hem de etkisi ile arka arkaya Maskin fosforilasyonunu teşvik etmektedir. eIF4G1 trans acemieIF4G1 ile etkileşim ve poli (A) kuyruğu dahil olmak üzere kabul PABP lasyon başlatma işbirliği yapmaktadır. Bir kez mos dönüşlerde, fosforilasyon ile ERK2 / MAPK aktive fosforilasyon tarafından MEK / MAPKK aktive sentezlenir. Bu sözde MAPK kaskadı M faz girişi kinetiği, mil morfojenezi ve DNA sentezini inhibe kontrol ederek mayoz süreçlerde rol oynamaktadır. Kaskad protein sentezini sürdüren pozitif geri besleme döngüsü gömülüdür. Bir o GVBD aktivasyonu için sentez istenen, sadece protein değildir mos not etmek gerekir, yani, Siklin B olgunlaşma başarı için Çevrilmesi için gereklidir.
Şekil 2. eIF4G1-DN mutant Xenopus laevis oosit olgunlaşmasını ve çeviri etkiler. V5-etiketli eIF4G1 proteinleri (WT ve DN) kodlayan plasmidler türetilmiş olan RNAXenopus microinjected oosit laevis. 15 saat sonra, oosit olgunlaştırma progesteron (PG) ile uyarılır (deneyler en az 3 kez yapıldı ve temsilci sonuçlar gösterilmiştir). (A) Schematicoverview deney protokolü. EIF4G1 ve / veya GFP cRNAs enjeksiyonları PG uyarılması önce ok başları tarafından temsil edilir. RNA ve proteinler analiz için örnekler 2 zaman noktasında (PG uyarılması ve GVBD kinetik sonunda) elde edilmiştir. GVBD karakterize 10 oosit (B) Kinetik olgunlaştırma PG uyarıldıktan sonra 24 saat boyunca test edilir. Oosit olgunlaşma gecikmesi eIF4G1-WT cRNAs microinjected kıyasla eIF4G1-DN cRNAs microinjected oositlerde görülmektedir 24 saat sonra, olgun oosit (C) Yüzde PG stimülasyonu (n = 4; * p <0.05).. Oosit olgunlaşmasında bir azalma eIF4G1-WT ile karşılaştırıldığında cRNAs eIF4G1-DN cRNAs microinjected olanlarda görülür. (D) ReversioeIF4G1-WT mutant eklendiğinde için makine hala işlevsel olduğunu gösteren eIF4G1-DN mutant cRNAs ve eIF4G1-WT cRNAs microinjected oositlerin n fenotipi değerlendirilmesi. (E) Proteins oositten çıkarılır ve bunların seviyeleri analizi imünolekeleme ile belirlenir . Gözlenir eIF4G1-DN koşullarında ERK2 fosforilasyon, mos ve GFP ifade tedirginlikler. (F) mos Poliadenilasyon, Siklin A1, oosit gelen Sikline B1 ve Histone gibi B4 mRNAlar PCR büyütmesi ve göç sonrası gözlenen PG ile stimüle veya % 3 agaroz jel. PG uyarıldıktan sonra, boyut> 100 poliadenilasyonun bir artış tüm koşullar için tespit edilir. İlk şerit merdivene karşılık gelir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tercüme birkaç nörodejeneratif hastalıklar dahil olmak üzere sayısız insan bozukluklarının patofizyolojisinde rol bir mekanizmadır. Parkinson hastalığında Örneğin çeşitli raporlar kalıtsal mutasyonlara 8,12,13 ile bağlantılı tercüme edilen değer göstermiştir.
Çeşitli hücresel modeller çeviri incelemek için kullanılabilir. Burada, eIF4G1 ve eIF4E mümkün 8 arasındaki etkileşimi azaltmak gibi baskın negatif mutasyonu hareket eIF4G1 bir mutasyon translasyonel sonuçlarını incelemek amacıyla, Xenopus oosit kullanılır laevis. Biyokimyasal deneyler için malzemenin önemli bir miktarı ile ön ve oosit olgunlaşma farklı fazların makroskopik gözlemler kolaylaştırmak sentetik mRNA mikroenjeksiyon kolaylaştıran tek tek ve dev hücre oluşmaktadır, çünkü bu model, basitlik avantajı vardır. Bu işlem stabil bir hücre ile karşılaştırıldığında, aynı zamanda bir zaman etkilidirhat nesil. Ayrıca, oosit hazırlanması ve RNA'nın microinjections çeşitli protokoller önce, hücre döngüsü ve Nükleositoplazmik taşıma 14,15 incelenmesi için özel olarak tarif edilmiştir. Çeviri çalışma bu protokollerin sınırları ile ilgili olarak, belirli bir ilgi mRNA konsantrasyonu ilgili alınmalıdır. Bu konsantrasyon çeviri sürecini doyurmak etmemek için yüksek (120 nl maksimum yüksek olmayan 30 ng) için olmamalıdır. Dikkate alarak bu elemanı, Xenopus oosit EIF4G1 transkriptin bir mutant formu ile, Şekil 2'de sunulan veriler tarafından onaylanmış protein çevirisini incelemek için çekici bir modeldir.
Gerçekten de, mutasyona uğramış eIF4G1 varlığında, Pt proteininin çeviri değer görülmektedir ve WT ve koşullarını kontrol etmek için karşılaştırıldığında GVBD% 90 bir azalma ile ilişkilidir. Tersine, eIF4G1-WT aşırı ekspresyonu seviyesi o modifikasyon ile sonuçlanmamıştırliteratür verileri 16,17 ile anlaşarak f mos çeviri.
Çeşitli biyolojik değişiklikler bu sonuçları açıklayabilir. Bu mRNA anne kökenlidir ve zaten PG tarafından mayoz aktivasyonundan önce transkripsiyonu mos bilerek, tedirgin mekanizmalar transkripsiyon ve çeviri aşamaları arasında gerçekleşmelidir. Dikkate değer, Pt için kendi çeviri 18,19 PG stimülasyon sonrasında kuyruk ilavesinden poli (A) kuyruğu olmayan bir latent mRNA'dan başlangıç molekül edilen bir olay grubuyla sonucudur. Böylece, birkaç senaryo da dahil olmak üzere mümkündür: çeviri başlatılması kusurları bu başarısızlığın nedeni olarak şüphelenilen olabilir, ya da kendisi tarafından mRNA poliadenilasyonu veya mos transkript mRNA polidenilasyondan varsayılan mos yol açan faktörün fosforilasyon kusurları bir neden olabilir translasyonel azalma.
Bu son 2 mekanizmaları değerlendirmek için, WB tarafından bu faktörlerin ifadesi incelenmiştir. EkspresCPEB fosforilasyonundan sorumlu fosforile Aurora A / eg2 iyon seviyesi, mutasyona uğramış eIF4G1 varlığında hiçbir rahatsızlık gösterdi. Aynı şekilde, mRNA veya başka bir poliadenilasyon mRNA poliadenilasyon mos PG uyarılması (Şekil 2F) sonra, mutasyona uğramış eIF4G1 mevcudiyetinde gözlenmektedir. Ayrıca Northern blot deneyleri tavsiye olacağını poliadenilasyon profili teyit yanı sıra ribozoma mRNA işe 16 oluşabilir olup olmadığını belirlemek amacıyla polizom sakaroz degrade izolasyonunu gerçekleştirmek için.
Yani, çağlayan ilk ve son elemanları inceleyerek, tedirgin sahne polidenilasyondan oluşma aşağı olduğu düşünüldü. Bu mos ifade kusur ERK2 fosforilasyonu üzerinde beklenen etkiyi verdi olmadığını test etmek için de önemlidir. Mutasyon varlığında, mos ifade azalma fosforile ERK2 seviyesinde bir azalmaya ve bunun sonucu olarak, bir kusurlu yolGVBD ilerlemesi (Şekil 1 ve 2E). Bu nedenle, eIF4G1 mutasyonu mos çeviri beklenen azalmaya ilişkilidir. Daha önce eIF4F kompleks oluşumunu bozacak olabilecek bir ko-immünopresipitasyon çalışması 8 tarafından önerilen eiF4G1-DN eIF4G1 sırayla eIF4E bağlanma alanının silinmesi, muhtemelen eIF4G1 / eIF4E etkileşimleri bir azalma sorumludur.
Bu protokol hücre biyolojisi birçok ilginç uygulamalar vardır. Daha iyi başlatma faktörlerinin belirli etki rolünü anlamak ve in vivo çeviri veya oosit olgunlaşma için gerekli olanları tanımlamak için: Bu set-up gibi hücre biyolojisi temel soruların bir dizi için ön incelemeler olarak idealdir. Bu bağlamda, Wakiyama ve ark. (2000) eIF4E ve PABP 17 için bağlanma alanlarını içeren eIF4G1 amino-terminal bölgesinin oosit olgunlaşmasında önemli olduğunu göstermiştir; splic çalışmainisiyasyon ing 20 faktörleri; kap-bağımsız bir şekilde 21 tercüme onların mRNA, bir kap-bağımlı çeviri ve IRES yapıların önlenmesi ile örneğin eIF4G1 bölünme yoluyla kendi amaçları için konak çevirisi makineleri kaçırma virüsler tarafından kullanılan mekanizmalar deşifre; oosit böyle çalışmanın 22 için tercih edilen modeller beri hücre döngüsünde çeviri faktörlerinin mutasyon rolünü incelemek için; çeviri yani başlamasını düzenleyen ana mekanizmaları incelemek için, kap-bağımlı ve kap-bağımsız bir veya birkaç sistemleri protein sentezi rahatsızlık katılan olup olmadığını tanımlamak için kullanılır. Geçerli protokol çeşitli varyasyonları kolayca Sunset method23 veya raportör mRNA mikroenjeksiyon yoluyla çeviri etkinliğinin belirlenmesi de dahil olmak üzere, bu amaçlara ulaşmak için uygulanabilir. Örneğin, bir birinci cistron ihtiva eden bir bisistronik mRNA raportör olarak kullanılması ve bunun Renilla lusiferaz kap bağımlı çevrilecektirFirefly lusiferaz içeren ikinci cistron IRES aracılığıyla tercüme edilecektir oysa yapılar çeviri homeostazı korumak için ileriye ince kusurları ve / veya tazminatlar koymak başlamanın modunu tanımlamak için imkan vermelidir. Buna ek olarak, bu tür lusiferaz muhabiri RNA deneyleri insanla eksik koruma mekanizmaları nedeniyle potansiyel bozan uzman gelişim mekanizmalarına güvenmeyin avantaj sunuyoruz.
Bu temel sorulara paralel olarak, bu tür protokol nörolojik bozukluklar katkıda bulunabilecek zararlı koşulları ele alan bir ilk adım olarak uygulanabilir. Fizyolojik koşullar altında, çeviri başlatma adımlar, oksidasyon, hipoksi, sıcaklık değişimi, ışınlama ve besin yoksunluğu kadar sert koşulları altında dahi düzenlemelerin ayrıcalıklı hedeflerdir. Bu koşullarda, transkript seçici çeviri strese karşı gerekli olan ve hücre sağkalım meydana proteinleri kodlayan.Bu süreç bunalmış zaman, gerilme patolojik hale gelir ve aktif çeşitli nörolojik sevgisini gelişimine katılır. Hücresel stres, Alzheimer ve Parkinson hastalıkları, amiyotrofik lateral skleroz ya da prion hastalığı (Creutzfeldt-Jakob) 24 ve bu gerilimler Katlanmamış Protein yanıt (EPD) aktivasyonunu uyarmaktadır gibi çok sayıda nörodejeneratif hastalıklarda rol oynamaktadır. Bu UPR mekanizmaların bir dikmek aktivasyonu yoluyla bir azalma çeviri ve 25 kompleksleri eIF4F ve 43S arasındaki bağlanma engelleyerek çeviri durdurma sonuçlarıyla eIF2α alt biriminin fosforilasyonuna yol açar. Xenopus oositleri oksidatif maddeler ve / veya bilinen mutasyon geçirmiş genlerin eklenmesi, bu gerilmeler taklit ve mutasyona uğramış genler için işlemleri etki olup olmadığının tespit olur bu patolojilerde ilişkili. Örneğin Parkinson hastalığı, Xenop bölgesindeki eIF4G1 p.R1205H giriş bölümündeBize oosit ilişkili veya stresörleri veya fizyopatolojisi 26 çeviri katılımı sorusuna cevap verebilir mRNA polysomal profilleri genom analizi oksidatif değil.
Oosite tatbik edilen tüm bu uygulamalar, böylelikle, şimdi nörodejeneratif hastalıkların dahil olmak üzere çeşitli duygularına ilişkili olduğu bilinen rahatsızlıkların için çalışma olasılıklar geniş bir görüş alanı temsil etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine methane sulphonate | Sandoz | MS-222 | oocytes handling |
| Forceps | Moria | Dumont MC40 | |
| Streptomycin/penicillin | Sigma | 781 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Tetracyclin | Sigma | T7660 | |
| Veterinarian absorbable Vicryl thread | Johnson&Johson Intl | JV1205 | |
| Collagenase A | Roche diagnostics | 10103586001 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560S | Preparation of synthetic mRNA |
| DNAse/RNAse free H2O | Life Technologies | 10977 | |
| Sodium Acetate | Merck | 6268 | |
| Absolute ethanol | Sigma | 02854 | |
| Nano Drop | Thermo Scientific | ||
| TBE 10X | Eppendorf | 0032006.507 | |
| Ethidium bromide 10 mg/ml | Life Technologies | 15585-011 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion by Life Technologies | AM1344 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EDTA | Fluka | 03609 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| Formaldehyde 37% | Merck | 1.04003.1000 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | |
| Gel Doc Imager | Biorad | ||
| Oocyte Pipet with 100 8" Glass Capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-510-X | microinjection |
| Replacement Glass 8" | Drummond Scientific Company | 3-000-210-G8 | |
| 0.45 µm filter | Millipore | SLHA025NB | |
| Progesterone | Sigma | P0130 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | Western Blot |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| SDS | Biorad | 161-0301 | |
| MgCl2 | Sigma | A3294 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4612 | |
| leupeptin | Sigma | L8511 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6506 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| sodium vanadate | Sigma | S6508 | |
| Laemmli buffer | Biorad | 161-0737 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | |
| SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGX | Biorad | 456-1036 and -1096 | |
| horizontal semi-dry blotting system | W.E.P. Compagny | ||
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Tris-HCl | Biorad | 161-0719 | |
| Hybond ECL Membrane | Amersham Life Science | 10401180 | |
| Methanol | VWR | 20846-292 | |
| Ponceau Red (0.5%) | Sigma | P3504 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | |
| anti-V5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58052 | |
| anti-Eg2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-27884 | |
| anti-Eg2-P | Cell Signaling | C39D8 | |
| anti-ERK2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1647 | |
| anti-ERK2-P (Tyr204) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7976 | |
| anti-Rsk | Santa Cruz Biotechnology | sc-231 | |
| anti-mos | Santa Cruz Biotechnology | sc-86 | |
| anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2812 | |
| anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2378 | |
| Advanced ECL Detection System | Amershan Life Science | RPN2135 | |
| PBS 1x | Sigma | P4417 | polyadenylation assay |
| TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent) | Qiagen | 79306 | |
| Chloroform | Sigma | 31998-8 | |
| Isopropanol | Sigma | 278475-1L | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| RTL buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNAse free DNAse set | Qiagen | 79254 | |
| Primers | Eurogentec | ||
| T4 RNA ligase 1 | New England Biolabs | M0204S | |
| High capacity c-DNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems, Life Technologies | 4368813 | |
| Taq polymerase | Life Technologies | 10342020 |
References
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Bio. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lopez-Lastra, M., Rivas, A., Barria, M. I. Protein synthesis in eukaryotes: the growing biological relevance of cap-independent translation initiation. Biol Res. 38 (2-3), 121-146 (2005).
- Terenin, I. M., Andreev, D. E., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N. A novel mechanism of eukaryotic translation initiation that is neither m7G-cap-, nor IRES-dependent. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1807-1816 (2013).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
- Van der Knaap, M. S., Leegwater, P. A., Könst, A. A., Visser, A., Naidu, S., Oudejans, C. B., Schutgens, R. B., Pronk, J. C. Mutations in each of the five subunits of translation initiation factor eIF2B can cause leukoencephalopathy with vanishing white matter. Ann Neurol. 51 (2), 264-270 (2002).
- Senée, V., Vattem, K. M., Delépine, M., Rainbow, L. A., Haton, C., Lecoq, A., et al. Wolcott-Rallison Syndrome: clinical, genetic, and functional study of EIF2AK3 mutations and suggestion of genetic heterogeneity. Diabetes. 53 (7), 1876-1883 (2004).
- Chartier-Harlin, M. C., Dachsel, J. C., Vilariño-Güell, C., Lincoln, S. J., Leprêtre, F., Hulihan, M. M., et al. Translation initiator EIF4G1 mutations in familial Parkinson disease. Am J Hum Genet. 89 (3), 398-406 (2011).
- Charlesworth, A., Cox, L. L., MacNicol, A. M. Cytoplasmic polyadenylation Element (CPE)- and CPE-binding Protein (CPEB)-independent mechanisms regulate early class maternal mRNA translational activation in Xenopus oocytes. J Biol Chem. 279 (17), 17650-17659 (2004).
- Dumont, J. N.
- Rassa, J. C., Wilson, G. M., Brewer, G. A., Parks, G. D. Spacing constraints on reinitiation of paramyxovirus transcription: the gene end U tract acts as a spacer to separate gene end from gene start sites. Virology. 274, 438-449 (2000).
- Lin, W., Wadlington, N. L., Chen, L., Zhuang, X., Brorson, J. R., Kang, U. J. Loss of PINK1 attenuates HIF-1α induction by preventing 4E-BP1-dependent switch in protein translation under hypoxia. J Neurosci. 34 (8), 3079-3089 (2014).
- Martin, I., Kim, J. W., Lee, B. D., Kang, H. C., Xu, J. C., Jia, H. 2, Stankowski, J., et al. Ribosomal protein s15 phosphorylation mediates LRRK2 neurodegeneration in Parkinson's disease. Cell. 57 (2), 472-485 (2014).
- Cohen, S., Au, S., Panté, N.
- Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. (69), e4449 (2012).
- Keiper, B. D., Rhoads, R. E. Translational recruitment of Xenopus maternal mRNAs in response to poly(A) elongation requires initiation factor eIF4G-1. Dev Biol. 206 (1), 1-14 (1999).
- Wakiyama, M., Imataka, H., Sonenberg, N. Interaction of eIF4G with poly(A)-binding protein stimulates translation and is critical for Xenopus.oocyte maturation. Curr Biol. 10 (18), 1147-1150 (2000).
- Sheets, M. D., Wu, M., Wickens, M. Polyadenylation of c-mos mRNA as a control point in Xenopus meiotic maturation. Nature. 374 (6522), 511-516 (1995).
- Gebauer, F., Richter, J. D. Synthesis and function of Mos: the control switch of vertebrate oocyte meiosis. Bioessays. 19 (1), 23-28 (1997).
- Le Sommer, C., Lerivray, H., Lesimple, M., Hardy, S. Xenopus as a model to study alternative splicing in vivo. Biol Cell. 99 (1), 55-65 (2007).
- Au, S., Cohen, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis.oocytes as a system for studying nuclear transport of viruses. Methods. 51 (1), 114-120 (2010).
- Gotoh, T., Villa, L. M., Capelluto, D. G., Finkielstein, C. V. Regulatory pathways coordinating cell cycle progression in early Xenopus development. Results Probl Cell Differ. 53, 171-199 (2011).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
- Moreno, J. A., Halliday, M., Molloy, C., Radford, H., Verity, N., Axten, J. M., et al. Oral treatment targeting the unfolded protein response prevents neurodegeneration and clinical disease in prion-infected mice. Sci Transl Med. 5 (206), 206ra138 (2013).
- Doyle, K. M., Kennedy, D., Gorman, A. M., Gupta, S., et al. Unfolded proteins and endoplasmic reticulum stress in neurodegenerative disorders. J Cell Mol Med. 15 (10), 2025-2039 (2011).
- Gandin, V., Sikström, K., Alain, T., Morita, M., McLaughlan, S., Larsson, O., Topisirovic, I. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), e51455 (2014).
