Abstract
Oltre ai metodi affermati come Western blot, sono necessari nuovi metodi per quantificare rapidamente e facilmente malattia associata α-sinucleina (αS D) in modelli sperimentali di synucleopathies. Una linea di topi transgenici (M83) che sovra-esprimono i αS A53T umani e sviluppare spontaneamente una drammatica fenotipo clinico tra gli otto ei 22 mesi di età, caratterizzata da sintomi quali la perdita di peso, prostrazione e disabilità motoria grave, è stato utilizzato in questo studio. Per le analisi molecolari di αS D (αS associata a malattia) in questi topi, un test ELISA è stato progettato per quantificare specificamente αS D nei topi malati. Analisi del sistema nervoso centrale in questo modello di topo ha mostrato la presenza di αS D principalmente nelle regioni del cervello caudale e il midollo spinale. Non ci sono state differenze nella distribuzione αS D tra diverse condizioni sperimentali che portano alla malattia clinica, vale a dire, in uninoculated e normalmente invecchiamento topi transgenici e in topi inoculati con estratti di cervello di topi malati. La rilevazione specifica di αS D immunoreactivity utilizzando un anticorpo contro Ser129 fosforilata αS di ELISA essenzialmente correlati con quello ottenuto da Western Blot e immunoistochimica. Inaspettatamente, risultati simili sono stati osservati con diversi altri anticorpi contro la parte C-terminale di αS. La propagazione di αS D, suggerendo il coinvolgimento di un meccanismo di "prioni-like", può quindi essere facilmente monitorato e quantificata in questo modello murino utilizzando un approccio ELISA.
Protocol
Tutte le procedure ei protocolli che coinvolgono animali sono conformi alla direttiva 86/609 / CEE e ratificata da Cometh, il comitato nazionale francese per l'esame di etica nella sperimentazione animale (protocollo 11-0043), CE. Gli animali sono stati alloggiati e curati in Anses di impianti autorizzati sperimentali a Lione (approvazione B 69387 0801).
1. Preparazione di topi
- Euthanize topi da una iniezione intraperitoneale di dose letale di pentobarbital sodico.
- Recuperare l'intero cervello dal cranio del mouse e mettetelo in una capsula di Petri di plastica 35 millimetri in ghiaccio fino all'estrazione.
- Estrarre il midollo spinale cervicale.
NOTA: αS Estratto sia da una delle due metà del cervello dopo sezionamento sagittale o dal cervello dei topi sezionati, disponibile dopo gli esperimenti elencati nella tabella 1.
| Sperit | Mice Inoculo (equivalente cervello) | Periodo di sopravvivenza (Dpi) | Mediana / sopravvivenza massima (giorni) | αS d individuazione da ELISA / WB / IHC |
| 1 | Topo inoculato | 441 ± 166 | 419/736 | 8/8 |
| 2 | Topi inoculati (0,2 mg) | 150 ± 52 | 140/241 | 9/9 |
Tabella 1. Elenco degli esperimenti condotti sui topi M83. Vaccinazioni sono state eseguite a 6 settimane per l'esperimento 2 nella zona striato-corticale con 20 ml di un omogenato cervello di un topo malato (1% peso / volume in glucosata al 5%), dopo anestesia di sei settimane topi M83 omozigoti del 3% inalazione isoflurano. dpi: giorni dopo inoculzione.
2. αS estrazione da Brain Metà
- Sagittalmente tagliare il cervello per ottenere due metà. Pesare ogni metà in una provetta contenente ribolysis sfere di macinazione.
- Preparare sale elevato (HS) tampone contenente 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 750 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 1% fosfatasi e inibitori della proteasi cocktail. Aggiungere tampone Alta Sale le metà del cervello per ottenere il 20% (peso / volume) omogenati.
- Preparare campioni delle due metà del cervello con un omogeneizzatore meccanico a 6,0 m / s per 23 secondi per due volte. Dopo i primi 23 sec omogeneizzazione, posizionare i tubi contenenti i omogenati in ghiaccio per 2 minuti prima del secondo ciclo di 23 sec.
- Centrifugare i campioni a 1000 xg per 5 minuti per eliminare i frammenti cerebrali unground. Recuperare i supernatanti, dividerli in 200 microlitri aliquote e tenerli a -80 ° C per la successiva analisi ELISA.
3. αS Estrazione da sezionato regioni cerebrali
- Sezionare unintero cervello in un piatto di plastica Petri 35 millimetri sul ghiaccio con una lente d'ingrandimento a bassa potenza (8X ingrandimento) utilizzando due forcipes cui estremità sono tenuti insieme, tranne quando sezionare l'ippocampo. Non superare 10 minuti per preservare l'integrità del cervello. Posizionare il cervello destro rivolto verso l'alto e recuperare i seguenti regioni del cervello in questo ordine:
- Separate uno dei due bulbi olfattivi con pinze poste appena dietro la lampadina. Staccarlo dal cervello con un movimento verso il basso. Ripetere questa operazione per la seconda lampadina.
- Cuneo delicatamente la pinza tra le due cortecce e spostarlo in avanti per facilitare dissociazione delle due cortecce. Mantenere il cervello in posizione con una pinza, utilizzare un altro per separare corteccia dal ippocampo.
- Posizionare le pinze 2 millimetri al di sotto della corteccia. Mantenere una leggera pressione sulle pinze fino all'inizio della ippocampo è visibile. Rimuovere la prima parte della corteccia, e ripetere con la seconda parte. Utilizzare le pinze per separare le due corteccepartendo nell'ippocampo e procedendo verso la parte anteriore del cervello.
- Posizionare le pinze aperte intorno uno dei ippocampi. Chiudere la pinza sul fondo dell'ippocampo quindi rimuoverla, recuperando il più possibile. Ripetere la procedura per il secondo ippocampo.
- Posizionare le pinze aperte sotto uno dei striata e separare delicatamente dal cervello. Utilizzare le pinze per rimuovere ogni residuo corteccia dallo striato. Ripetere questa procedura per il secondo striato.
- Utilizzare le pinze per deprimere delicatamente da 2 mm, il contorno del cervelletto per facilitare la separazione del cervelletto dal cervello. Posizionare le pinze appena dietro il cervelletto e toglierlo muovendo la pinza in avanti.
- Utilizzare l'ampia parte della pinza per sollevare il mesencefalo per vedere chiaramente dove si unisce al tronco cerebrale. Effettuare una incisione verticale all'incrocio quindi rimuovere il tronco cerebrale.
- Posizionare le pinze dietro il mesencefalo, che hos composta da quattro strutture arrotondati. Incidere verticalmente fino mesencefalo è stato completamente separato dal cervello rimanente.
- Preparare omogenati di variabile% (peso / volume) in tampone HS, a seconda della quantità di tessuti disponibili, cioè, 5% omogenato per un peso compreso tra 10 e 30 mg, 10% per un peso compreso tra 30 e 80 mg, e 20% per un peso superiore a 80 mg.
- Aggiungere un volume adeguato di tampone HS alle regioni del cervello sezionati per ottenere l'atteso% dell'omogeneizzato.
- Vortex e controllare che i tessuti sono completamente immersi nel buffer HS.
- Omogeneizzare campioni preparati dalle regioni cerebrali sezionati o del midollo spinale cervicale con una smerigliatrice tessuto composto da un tubo di vetro borosilicato e due pestelli, A e B.
- Versare ciascuna regione del cervello di essere schiacciato direttamente nel tubo. Inserire pestello A nella provetta e ritrarlo. Ripetere il movimento circa dieci volte di dissociare il tessuto. Quindi utilizzare pestello B a continue molatura il tessuto con altri 20 movimenti. Trasferire le omogenati in una provetta da 1,5 ml con una pipetta 1 ml.
- Centrifugare i campioni a 1000 xg per 5 minuti a 4 ° C per eliminare eventuali frammenti cerebrali unground. Recuperare i supernatanti, li suddividere in 200 microlitri aliquote e tenerli a -80 ° C per la successiva analisi ELISA.
4. Individuazione di αS con metodo ELISA
- Diluire anticorpi di copertura di 0,01 ng / ml. Utilizzare policlonale di coniglio anti-αS o monoclonale clone 42 anticorpo in 50 mM Na 2 CO 3 / NaHCO3 tampone (pH 9,6).
- Rivestire la 96 pozzetti con 100 pl per pozzetto di questa soluzione di rivestimento, e lasciare a 4 ° CO / N. Utilizzare l'anticorpo policlonale di coniglio anti-αS nella soluzione di rivestimento per l'ELISA utilizzando anticorpi di rilevamento syn514, clonare 42, LB509, AS11, 4D6 e 8a5. Usare l'anti-αS anticorpo monoclonale clone 42 come una soluzione di rivestimentoin combinazione con anticorpo di rilevazione anti-pSer129 αS.
NOTA: Se necessario, le piastre possono essere conservati a 4 ° C per una settimana prima della ELISA viene eseguita. - Utilizzare una rondella piatto per lavare i piatti per cinque volte con 300 ml di PBS con 0,05% di Tween 20 (PBST) per pozzetto. Da questo punto in poi, l'incubazione è a RT.
- Aggiungere 200 ml di T20 PBS tampone di bloccaggio per pozzetto. Agitare per 1 ora a 150 rpm. Lavare le piastre per cinque volte con PBST.
- Diluire le omogenati di cervello (diluizione 1: 100 del omogenati 20%, 1:50 del 10% omogenati e 1:25 delle omogenati 5% in PBST BSA 1%), e aggiungere 100 ml di ogni bene. Poi incubare per 2 ore agitando a 150 rpm. Lavare le piastre per cinque volte con PBST.
- Aggiungere i diversi anticorpi di rilevamento αS in PBST con BSA 1% alle diluizioni indicate nella lista dei materiali. Incubare per 1 ora a 150 rpm. Lavare le piastre per cinque volte con PBST.
- Aggiungi sia contro-mouse o anti-coniglio coniugati IgG HRP diluito 1: 8.000 in PBST integrato con BSA 1% per 1 ora agitando a 150 rpm. Lavare le piastre per cinque volte con PBST.
- Aggiungere 100 ml di 3,3 ', soluzione 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) in ogni pozzetto e incubare per 15 minuti al buio agitando a 150 rpm.
- Arrestare la reazione aggiungendo 100 ml di HC1 per bene poi misurare l'assorbanza a 450 nm con il lettore per micropiastre.
- Per l'analisi dei dati, sottrarre il valore di assorbanza ottenuto in un pozzo con tutti i reagenti tranne i campioni di cervello di topo (Bianco) dai valori OD misurati per ciascuno dei campioni analizzati.
5. epitopi Mapping
- Eseguire la mappatura epitopi secondo il metodo descritto da Osman 16. In breve, i peptidi del punto della sequenza α-sinucleina umana contenente 12 aminoacidi su nitrocellulosa con 10 amminoacidi che si sovrappongono.
- Blocco con 50 mM Tris / NaCl 150 mM tampone pH 10 contenente 0,05% di Tween 20 e 5% di latte in polvere. Incubare l'anticorpo nel bloccare soluzione ad una concentrazione di 2 mg per ml dell'anticorpo a 2-10 ° CO / N.
- Lavare la membrana tre volte con 50 mM Tris / 150 NaCl mM tampone pH 10 contenente lo 0,05% di Tween 20. Incubare con la capra coniugato anti-topo IgG HRP. Lavare la membrana altre cinque volte usando lo stesso tampone poi macchia con un kit di colorazione macchia TMB occidentale.
6. Analisi statistica
- Utilizzare il pacchetto software R e nlme effettuare effetti misti regressioni per modellare OD. Per ogni confronto, eseguire un modello di regressione effetto misto. Utilizzare un effetto fisso per distinguere sintomatica da gruppi asintomatici.
- Utilizzare un effetto casuale per riflettere le variazioni di ripetizioni per un dato mouse. Controllare omoschedasticità esaminando i residui e, se necessario, utilizzare le funzioni di varianza per modellare la struttura della varianza degli errori all'interno del gruppo in linea con Pinheiro e Bates 1Impostare 0,05 come soglia di significatività P. 7.
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Representative Results
In questo studio, i test ELISA utilizzate specificatamente identificati associata a malattia αS (αS D) in omogenati di cervello preparate in un buffer Alta sale da malati topi M83. Utilizzando un anticorpo che riconosce specificamente pSer129 αS (p = 0,0074), ELISA distingue facilmente vecchi, topi malati (> 8 mesi) da giovani (2-5 mesi), i topi sani M83 (Figura 1). Molti altri anticorpi hanno mostrato segnali altrettanto elevati (> 0,6 OD) solo in omogenati di cervello di topi malati. Questo è il caso per 4D6 (p = 0,01), LB509 (p = 0,0047) e 8a5 (p <0,001) contro diverse sequenze della parte C-terminale della proteina (124-134, 115-122, e 129-140 rispettivamente) e, in misura molto minore, syn514 contro l'estremità N-terminale (2-12) della proteina (p = 0,0003). Inoltre, l'anticorpo monoclonale AS11 prodotto nel nostro laboratorio contro αS umani fibrillari ricombinanti 18 dopo l'immunizzazione di C57BL / 6S (B6 αS nulli) 19topi con una delezione del locus α-syn, ha mostrato segnali di altrettanto elevati (p <0,01), solo in omogenati cerebrali da topi malati. Questo anticorpo è stato ora dimostrato di riconoscere la sequenza (P) VDPDNEAY aminoacidi (E) di αS, corrispondente alla sequenza di 118-125 umano α-sinucleina.
Al contrario, in queste condizioni sperimentali, le analisi di omogenati di cervello con l'anticorpo rilevamento della clonazione 42 diretto contro una regione centrale di α-sinucleina (91-96 sequenza), ha mostrato un segnale molto basso per entrambi i mouse M83 malati e sani. Non poteva distinguere le due popolazioni di topi (p = 0,1158). I giovani topi M83 tuttavia mostrato una immunoreattività superiore ha fatto topi B6C3H non transgenici (M83 linea background genetico). Il contrasto è ancora più grande con C57BL / 6S (B6 αS-null) topi, che hanno una eliminato locus α-syn. Questo suggerisce che il leggero immunoreattività nei topi M83 corrisponde al rilevamento del segnale basso di αS normali. L'asensibilità nalytical di questa ELISA è stato valutato in confronto con un metodo precedentemente descritto Western blot 4 per il rilevamento di insolubile Ser129 fosforilata α-synuclein, esaminando, utilizzando sia metodi ELISA e Western Blot, diluizioni seriali di omogenati cerebrali preparati dalla stessa malato M83 cervello di topo (Figura 2). Approssimative 10 mg equivalenti di cervello sono stati sufficienti per ottenere un segnale positivo ELISA per l'omogeneizzato cervello da questo mouse malato, sia con LB509 e gli anticorpi PSer129. Al contrario, sono stati necessari almeno 200 equivalenti cerebrali ug per rilevare pSer129 αS nella frazione insolubile sarcosile analizzati mediante Western blot utilizzando lo stesso anticorpo PSer129 15. Ciò indica che la ELISA ha una sensibilità analitica alcuni 20 volte quella del metodo Western blot.
Nel malato e vecchio mouse M83 (figura 3A), omogenati cerebrali da mesencefalo, tronco encefalico e del midollo spinale sho wed contrassegnato immunoreactivity sia LB509 e gli anticorpi PSer129 in ELISA. Tuttavia, nessuna immunoreattività rilevabile è stata osservata nelle altre regioni del cervello, compreso il bulbo olfattivo, corteccia cerebrale, striato, ippocampo, talamo e ipotalamo. Il test ELISA ha dato un debole segnale per il cervelletto. L'immunoreattività nelle diverse regioni del cervello di topi M83 sviluppare una malattia clinica accelerata dopo l'iniezione di un estratto da un cervello malato M83 del mouse 4 (figura 3B) è indistinguibile da quella vista in età (> 8 mesi) non inoculata topi M83. Questi risultati sono pienamente coerenti con quelli ottenuti da Western Blot (Figura 3C) e immunoistochimica 15, mostrando una maggiore deposizione di Ser129 α-sinucleina nelle regioni caudale del cervello e del midollo spinale.
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Figura 1. ELISA rilevazione della malattia associata α-sinucleina (αS D) in tutto il cervello di topi omogenati M83. Il test ELISA combina coniglio anti-αS policlonale (coating) con syn514, LB509, AS11, 4D6, 8a5 (rilevamento) o clone 42 (coating) con anti-pSer129 αS (PSer129) anticorpi (rilevamento) distinguere i topi malati di topi sani M83, considerando ELISA con anti-αS policlonale di coniglio (coating) / clone42 (rilevamento) non lo fa. I sei malati, vecchi mouse M83 di età compresa da 11 a 16 mesi ha mostrato segni di immunoreattività con anticorpi anti-α-syn (tranne clone 42 anticorpi). Questo non era il caso sia per i sei giovani, topi sani di età compresa da 2 a 5 mesi di età, o con i comandi aggiuntivi, tra cui B6C3H (background genetico M83 topi) o αS-nulli B6 topi. Le barre di errore rappresentano SD Modificato da Bétemps 15.
Figura 2. Confronto tra la sensibilità analitica di rilevamento di αS D mediante test ELISA e Western Blot. A. Un segnale positivo è stato ottenuto con ELISA per 12,5 mcg equivalenti cervello sia con LB509 e anticorpi PSer129 da diluizioni doppie di omogenati di cervello da un malato topo. Il livello di cut-off stimato per la discriminazione dei topi malati e sani, corrispondente al mezzo ottenuti da campioni di topi sani M83 durante 5:57 ripetizioni di ELISA misure + 3 deviazioni standard, era 0,030 e 0,020 per LB509 e anticorpi di rilevamento PSer129 rispettivamente . Essi sono mostrati come una linea dello stesso colore di quello usato per ciascuna delle anticorpi. B. Con analisi Western blot delle frazioni insolubili ottenuti dopo ultracentrifugazione nella presence di sarcosile, sono stati necessari 200 mg equivalenti di cervello per rilevare αS D con lo stesso anticorpo PSer129. Marcatori di peso molecolare (in kDa) sono indicati sulla sinistra del blot. Ristampato con il permesso di Bétemps 15.
Figura 3. Rilevamento di malattia associata α-sinucleina (αS D) in diverse regioni cerebrali di topi M83 di ELISA e Western Blot. ELISA identificato αS D con anticorpi PSer129 o LB509 rilevamento in topi M83 durante il normale invecchiamento (A) (n = 1, 4 ripetizioni, media ± DS) o dopo l'inoculazione del 6 settimane di età topi M83 con un omogenato cerebrale da un M83 malato ( B) (n = 1, 4 ripetizioni, media ± DS). (C) αS D è stata identificata da Western macchia con l'anticorpo EP1536Y rilevazione PSer129 nelle stesse regioni neuro-anatomica in topi inoculati con un omogenato cerebrale da un malato M83 mouse. Marcatori di peso molecolare (in kDa) sono indicati sulla sinistra del pannello C. Uguali quantità di proteine totali sono stati utilizzati in ciascuna linea di carico equivalente su gel. Le otto regioni neuro-anatomica seguenti da malati topi M83 sono stati testati: OB: lampadina olfattiva, Cx: corteccia cerebrale, Max: ippocampo, St: striato, Me: mesencefalo, Cb: cervelletto, BS: tronco encefalico, Carolina del Sud: midollo spinale cervicale . Modificato da Bétemps 15.
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Discussion
L'uso di un ELISA è stato dimostrato per rilevare specificamente αS D direttamente da omogenati di cervello mouse durante la malattia nel modello di topo transgenico M83. In effetti, questo ELISA potrebbe facilmente distinguere malati topi M83 da topi sani M83 utilizzando solo intere omogenati di cervello in tampone alta Salt.
Le fasi più critiche per ottenere risultati di successo che utilizzano questo ELISA sono: dissezione correttamente le diverse regioni del cervello di topo con lo sviluppo della manualità necessaria per evitare danni durante la dissezione; l'esecuzione di diluizioni dei campioni esclusivamente in tampone HS; e la scelta di anticorpi, perché non tutti gli anticorpi funzionerà in un formato ELISA.
Alcuni variabilità dei livelli αS D è stato comunque evidente tra i diversi topi. Questi risultati sono equivalenti alla rilevazione Western Blot del tipico modello αS D rilevato solo in topi malati M83 con l'esame del sarkfrazioni osyl insolubili, dopo il rilevamento di un anticorpo contro Ser129 fosforilata αS 15. Ciò dimostra che ELISA immunoreattività corrisponde al rilevamento specifico di αS D.
In accordo con la precedente analisi Western blot 15, questa ELISA rilevato immunoreattività dopo la dissezione del cervello di topi malati M83 nelle parti caudali del cervello, cioè, il mesencefalo e tronco cerebrale, e nel midollo spinale cervicale. No immunoreattività è stata rilevata nel bulbo olfattivo, corteccia cerebrale, striato o l'ippocampo, coerente con indica che l'ippocampo è stata risparmiata dal processo patologico 6, a meno che a livelli molto bassi nel caso di topi che erano stati inoculati da alfa fibrillare dati precedenti -synuclein nell'ippocampo 15. La distribuzione dei αS D così apparso, qualunque siano le condizioni sperimentali complessive notevolmente uniformi, che included sia normale invecchiamento dei topi o accelerato lo sviluppo della malattia dopo l'inoculazione intracerebrale di omogenati cerebrali di topi malati M83.
Inoltre, le prestazioni del dosaggio è migliore rispetto al metodo Western blot precedentemente descritto. La sensibilità analitica del ELISA apparve alto, come mostrato dai limiti di rilevamento ottenuti in questo test utilizzando diluizioni seriali di un omogenato cerebrale da un mouse M83 malato (12,5 mcg per ELISA vs 200 ug per il saggio Western blot). La sensibilità del ELISA tuttavia rimasto inferiore a quello di rilevazione immunoistochimica, che rileva αS D in cellule singole e nelle regioni frontali del cervello come la corteccia cerebrale 15. La sensibilità del test potrebbe tuttavia essere ulteriormente migliorata utilizzando differenti anticorpi e / o sistemi di rilevamento ottimizzati, come il rilevamento chemiluminescente come descritto in precedenza 13.
È importantenotare che molti altri anticorpi che riconosce altre forme della proteina, e in particolare una forma non fosforilata (rilevato con l'anticorpo monoclonale 4D6 20) ha dato risultati simili usando questa ELISA, in aggiunta all'anticorpo monoclonale che riconosce specificamente pSer129 αS. Questo approccio ELISA anche rivelato immunoreattività con anticorpi che riconoscono αS specificamente umani (LB509) e, in misura molto inferiore, αS topo (D37A6) negli stessi animali malati e / o regioni cerebrali di topi malati 15. D'altro canto, non è stato osservato immunoreattività dall'analisi ELISA di topi M83 malati utilizzando l'anticorpo clone 42 contro una regione centrale di αS (91-96) 21,22, corrispondente ad un epitopo che potrebbe essere criptico in queste condizioni ELISA. Questo formato ELISA in grado di rilevare in M83 cervello di topo sia Ser129 αS fosforilata, come osservato da Foulds 11 nel plasma umano, e non fosforilata, eventuali forme oligomere, come descritto nella humun plasma e cerebrospinale 12,14 fluido. A differenza di ELISA pubblicati in precedenza, il nostro formato ELISA né utilizzato lo stesso anticorpo nella cattura e rilevamento per rilevare la forma oligomerica di αS, né anticorpi noti per essere conformazionale, come l'anticorpo 5G4 utilizzati negli studi di Unterberger.
A differenza del metodo Western blot precedentemente utilizzato per rilevare αS D in omogenati cerebrali da topi M83 4, l'ELISA non richiede una fase di concentrazione ad esempio mediante ultracentrifugazione con sarcosile per rilevare la proteina associata a malattia 23. ΑS malattia-associato precedentemente identificato nei topi M83 per estrazione sequenziale utilizzando tamponi di aumentare la forza 2,6. Da un punto di vista pratico, questo dosaggio quantitativo di risparmiare molto tempo e reagenti rispetto alla procedura Western blot.
In questo studio, αS dettagliate analisi molecolari utilizzando un approccio ELISA hanno consentito difacilmente quantificare immunoreattività con anticorpi diversi in malati topi M83. Si potrebbe far luce sui meccanismi molecolari coinvolti nella aggregazione αS durante synucleinopathies da un punto di vista quantitativo. Questo approccio ELISA potrebbe quindi fornire la base per uno strumento veloce e facile da individuare αS D in vari campioni biologici con un pennarello affidabile della patologia come Ser129 αS fosforilata che Foulds 11 crede spettacoli più promettente come marcatore diagnostico rispetto ai non-fosforilata proteine. Di recente, ha sottolineato il fatto che le misure di αS totale o, eventualmente, di αS non fosforilata potrebbero essere utilizzati come marker surrogato per la progressione della malattia nel PD, come il livello di αS totali tende ad aumentare nel tempo dopo la comparsa dei sintomi iniziali 24 .
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Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Damien Gaillard per vaccinazioni e il follow-up di esperimenti sugli animali. Questo lavoro è stato sostenuto da ANSES (Agenzia francese per l'Alimentazione, Ambiente e Salute e Sicurezza), e da una sovvenzione della Fondazione Parkinson Francia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB509 | Abcam | ab27766 | Detection antibody 1/2,000 |
| AS11 | Produced at Anses | Detection antibody 1/1,000 | |
| 4D6 | Abcam | ab1903 | Detection antibody 1/2,000 |
| PSer129 | Abcam | ab59264 | Detection antibody 1/3,000 |
| PSer129 EP1536Y | Abcam | ab51253 | Detection antibody 1/1,000 |
| syn514 | Abcam | ab24717 | Detection antibody 1/500 |
| clone 42 | BD Biosciences | 610787 | Coating and detection antibody (1/2,000) |
| 8A5 | Provided by Dr. Anderson | Detection antibody 1/2,000 | |
| polyclonal anti-αsyn antibody | Millipore | AB5038P | Coating antibody |
| Anti-mouse IgG HRP conjugate | Southern Biotech | 1010-05 | |
| Anti-rabbit IgG HRP conjugate | Southern Biotech | 4010-05 | |
| Goat anti-mouse IgG HRP conjugate | Dianova | 115-035-164 | |
| HS buffer | Adjust at pH 7.5 and keep at 4 °C | ||
|
Euromedex | 26-128-3094-B | |
|
Euromedex | 1112-A | |
|
Euromedex | EU0007-B | |
|
Sigma | 43815 | |
| PBS | Adjust at pH 7.5 | ||
|
Euromedex | 1309 | |
|
Euromedex | 2018 | |
|
Euromedex | 1112-A | |
|
Euromedex | P017 | |
| Tween 20 | Euromedex | 2001-C | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| DTT 1 mM | Sigma | 43815 | Stock solution 100 mM, toxic |
| 1% phosphatase cocktail | Pierce | 78428 | |
| 1% protease inhibitor cocktail | Roche | 04 693 132 001 | 50x concentrated |
| Microplate MaxiSorpTM | Thermo Scientific | 442404 | |
| Tampon carbonate 50 mM pH 9.6 | |||
|
Sigma | 71360 | 2.86 g/L |
|
Merk | 6329 | 3.36 g/L, pH 9.6 |
| Superblock T20 PBS blocking buffer | Pierce | E6423H | 10x concentrated |
| TMB | Sigma | T0440 | Used for ELISA |
| TMB | Analytik Jena AG | 847-0104200302 | Used for epitope mapping |
| HCl 1 N | Chimie plus | 40030 | |
| Ribolyser | Thermo | Fast prep FP120 | keep on ice at this step |
| Grinding tubes | Biorad | 355-1197 | |
| Plate washer | Tecan | Columbus Pro | |
| Plate reader | Biorad | Model 680 | |
| Low power magnifier | VWR | 630-1062 | 8X magnification |
| Forceps Dumont#7 | WPI | 14097 | For dissection steps |
| Transfer pipette 1ml Samso | Samso | 043231 | |
| 1.5 ml tubes | Dutscher | 033290 | |
References
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