Abstract
Western blot gibi bilinen metotlara ek olarak, yeni yöntemler hızlı ve kolay bir sinükleopatiler deneysel modellerinde hastalıkla ilişkili α-sinüklein (aS D) ölçmek için ihtiyaç vardır. Aşırı ifade eden insan A53T aS ve kendiliğinden kilo kaybı, bitkinlik, ve ağır motor bozukluğu dahil olmak üzere semptomlarla karakterize Sekiz ve 22 ay arasında bir dramatik klinik fenotip üreten bir transjenik fare soyu (M83), bu çalışmada kullanılmıştır. Bu farelerde aS D (hastalıkla ilişkili aS) moleküler analiz için, bir ELISA, özellikle hasta farelerde aS D ölçmek için tasarlanmıştır. Bu fare modeli, merkezi sinir sistemi analizi esas kaudal beyin bölgelerinde ve omurilikteki aS D varlığını göstermiştir. Yani klinik hastalığa yol açan farklı deneysel koşullar arasında aS D dağılımında farklılıklar uninocul de vardıated ve normal transgenik fareler yaşlanma ve hastalık farelerden alınan beyin özleri ile aşılanmış farelerde. Ser129 karşı bir antikor kullanılarak aS D imünoreaktivite spesifik tespiti esas olarak Western Blot ve immünohistokimya ile elde edilen korelasyon ELISA ile aS fosforile. Beklenmedik bir şekilde, benzer bir sonuç aS C-terminal kısmına karşı birkaç diğer antikorlar ile gözlendi. Bir "prion gibi" mekanizmasının rolünü düşündürmüştür aS D yayılması, böylece kolayca izlenebilir ve bir ELISA yaklaşımı kullanarak bu fare modelinde belirlenebilir.
Protocol
Tüm prosedürler ve hayvanları da içeren protokoller EC Direktifi 86/609 / EEC ve Cometh, hayvan deneyleri (protokol 11-0043) etik dikkate Fransız ulusal komitesi tarafından onaylanmış uygun idi. hayvanların barındırıldığı ve Anses en (0801 69387 onay B) Lyon deneysel tesisleri onaylı bakım için.
Fareler 1. Hazırlık
- Sodyum pentobarbital öldürücü dozun intraperitoneal enjeksiyonu ile farelere Euthanize.
- Fare kafatası tüm beyin almak ve ekstraksiyon kadar buz üzerinde 35 mm plastik Petri kabı yerleştirin.
- Servikal spinal kord ayıklayın.
NOT: Özü aS ya Tablo 1'de listelenen deneyler sonra kullanılabilir sagital kesit sonra veya disseke fare beyinleri beyin yarım birinden gelen.
| Experiment | Fareler Aşı (beyin eşdeğeri) | Survival dönemi (Dpi) | Medyan / maksimum sağkalım (Gün eski) | ELISA ile D algılama aS / WB / İHK |
| 1 | Aşılanmamış fareler | 441 ± 166 | 419/736 | 8/8 |
| 2 | Aşılanmış fareler (0.2 mg), | 150 ± 52 | 140/241 | 9/9 |
M83 fareler üzerinde gerçekleştirilen deneylerin Tablo 1. listesi. Aşılama sonrası, (glikoz içinde% 1 ağırlık / hacim,% 5), hasta bir fare beyin homojenatının 20 ul ile striato-kortikal bölgede Deney 2 6 hafta uygulandı % 3 izofluran inhalasyon yoluyla 6 haftalık homozigot M83 farelerin anestezi. dpi: gün inokülasyonu sonrasıtirme.
Beyin Yarısı 2. aS Ekstraksiyon
- Sagittally iki yarısını elde etmek için beyin kesti. Öğütme topları içeren bir ribolysis tüp içinde her yarım tartılır.
- 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 750 mM NaCI, 5 mM EDTA, 1 mM DTT,% 1 fosfataz ve proteaz inhibitörü kokteyli içeren yüksek tuz (HS), tampon hazırlayın. % 20 (ağırlık / hacim) homojenatları elde etmek için, beyin yarısı yüksek tuz tamponu ekleyin.
- 6.0 m mekanik homojenleştirici kullanarak beyin yarıları örnekleri hazırlayın / s 23 sn kez. Ilk 23 saniye homojenize edildikten sonra ikinci bir 23-sek çevriminden önce 2 dakika için buz üzerinde homojenatları içeren tüpleri.
- 5 dk öğütülmemiş beyin parçalarını ortadan kaldırmak için 1000 xg'de örnekleri santrifüj. 200 ul alikotlara bölünür ve daha sonra ELISA analizi için -80 ° C'de saklayın, süpernatantlar kurtarmak.
Dissected Beyin Bölgeler 3. aS Ekstraksiyon
- Teşrih biruçları, hipokampus kesme dışında bir arada tutulur, iki forcipes kullanarak düşük güç büyüteç (8 x büyütme) ile buz üzerinde 35 mm'lik plastik Petri tabağı içine tüm beyin. Beyin bütünlüğünü korumak için 10 dakika aşmayın. Beyin yerleştirin sağ yan ve bu sırayla şu beyin bölgelerinin almak:
- Sadece ampul arkasına yerleştirilen forseps kullanılarak iki koku ampuller Ayrı biri. Bir aşağı hareket ile beyinden ayırmak. İkinci ampul bu işlemi tekrarlayın.
- Yavaşça iki kortekste arasında forseps kama ve iki korteks ayrılmasını kolaylaştırmak için ileriye doğru hareket ettirin. Bir forseps ile yerine beyin tutulması, hipokampus gelen korteks ayırmak için başka kullanabilirsiniz.
- Forseps korteks altında 2 mm yerleştirin. Hipokampus üst görünür oluncaya kadar forseps üzerinde hafif bir baskı koruyun. Korteksin ilk bölümü soyulabilir ve ikinci bölümü ile tekrarlayın. İki korteks ayırmak için forseps kullanabilirhipokampus başlayan ve beynin ön tarafına doğru hareket.
- Hippocampi biri etrafında açık forseps yerleştirin. Daha sonra yavaşça mümkün olduğu kadar geri kazanılması, çıkarmak hipokamp altındaki forseps kapatın. İkinci hipokampus için prosedürü tekrarlayın.
- Striatasından birinin altındaki açık forseps yerleştirin ve yavaşça beynin ayırın. Striatum kalan korteks kaldırmak için forseps kullanın. İkinci striatum için bu yordamı yineleyin.
- Yavaşça beyin beyincik ayrılmasını kolaylaştırmak için, 2 mm beyincik konturu tarafından bastırmak için forseps kullanın. Sadece beyincik arkasında forseps yerleştirin ve ileri forseps hareket ettirerek çıkarın.
- Beyin sapını birleştiği yerde açıkça görmek için mesencephalon yükseltmek için forseps geniş kısmını kullanın. Kavşakta dikey kesi daha sonra beyin sapı çıkarın olun.
- , Mezensefalona arkasındaki forseps yerleştirin hangi idört yuvarlak yapılardan oluşur s. Mezensefalon tamamen geriye kalan beyin ayrılmış kadar dikey olarak İnsizyon.
- Değişken% HS tampon maddesi içinde (ağırlık / hacim), mevcut dokuların miktarına bağlı olarak, örneğin, 10 ve 30 mg arasında bir ağırlık için% 5 homojenat, 30 ve 80 mg arasında bir ağırlık için% 10 ve% 20 arasında homojenatları hazırlanması 80 mg üzerinde bir ağırlık.
- Homojenat beklenen% elde etmek için parçalandı beyin bölgelerine HS tamponu yeterli hacim.
- Vortex ve dokular tamamen HS tamponu dalmış olup olmadığını kontrol edin.
- Borosilikat cam tüp ve iki havan tokmaklarının, A ve B oluşan bir doku öğütücüsüyle kesilerek beyin bölgelerinde veya servikal spinal kord hazırlanabilir örnekleri homojenize
- Tüp içine doğrudan ezilmiş olan her beyin bölgesini dökün. Tüpe havaneli A yerleştirin ve geri çekin. Doku ayırmak Bu hareketi yaklaşık on kez tekrarlayın. Ardından c havaneli B kullanınBir başka 20 hareketleri ile doku taşlama ontinue. 1 ml transfer pipet ile 1.5 ml tüp içine homojenatları aktarın.
- Herhangi bir öğütülmemiş beyin parçaları ortadan kaldırmak için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1000 x g'de örnekleri santrifüjleyin. Süpernatanlar Al 200 ul alikotları bunları ayırmak ve daha sonra ELISA analizi için -80 ° C 'de muhafaza edin.
ELISA ile aS 4. Algılama
- 0.01 ng / ml kaplama antikorları sulandırmak. 50 mM Na-2 CO 3 / NaHCO 3 tamponu (pH 9.6), anti-aS tavşan poliklonal ya da monoklonal antikor klon 42 kullanın.
- Ceket 96 oyuklu mikro-plakalar bu kaplama çözeltisi, oyuk başına 100 ul ve 4 ° CO / N bırakın. Saptama antikorları syn514 kullanılarak ELISA kaplama çözeltisi içinde, anti-aS tavşan poliklonal antikoru kullanarak 42, LB509, AS11, 4D6 ve 8A5 klonu. Bir kaplama solüsyonu gibi anti-aS monoklonal antikor klon 42 kullanınAnti-pSer129 aS algılama antikoru ile kombinasyon halinde.
Not: plakalar ELISA önce bir hafta boyunca 4 ° C'de muhafaza edilebilir, gerekli ise gerçekleştirilir. - Oyuk başına% 0.05 Tween 20 (PBST) ile fosfat tamponlu tuz çözeltisi, 300 | il ile beş kez yıkamak için bir levha yıkayıcı kullanın. Başlar ve bu adımdan, inkübasyon, oda sıcaklığında yer almaktadır.
- T20 PBS kuyu başına tampon engelleme 200 ul ekleyin. 150 rpm'de 1 saat boyunca çalkalanır. PBST ile plakalar beş kez yıkayın.
- (% 20 homojenatlarının 100,% 10 homojenatlarının 1:50 ve PBST BSA% 1% 5 homojenatlarının 1:25 seyreltme 1) ve her bir kuyucuğa 100 ul Beyin homojen seyreltilir. 150 rpm'de çalkalanarak daha sonra 2 saat süreyle inkübe edin. PBST ile plakalar beş kez yıkayın.
- Malzeme Listesi'nde belirtilen sulandırmalarda BSA ile PBST% 1 farklı aS algılama antikorları ekleyin. 150 rpm'de 1 saat süreyle inkübe edin. PBST ile plakalar beş kez yıkayın.
- Anti-ya Ekle150 rpm'de çalkalanarak 1 saat boyunca% 1 BSA ile desteklenmiş PBST içinde 8000: -fare ya da anti-tavşan IgG HRP konjügatları 1 seyreltilmiştir. PBST ile plakalar beş kez yıkayın.
- Her oyuğa, 5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) çözeltisine 3,3 '100 ul ilave edin ve 150 rpm'de çalkalanarak karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edin.
- De o zaman mikro levha okuyucusu ile 450 nm'de absorbans ölçümü için 1 N HCI, 100 ul ilave ederek reaksiyonu durdurun.
- Veri analizi için, analiz edilen örneklerin her biri için, ölçülen OD değerleri herhangi bir fare beyin örneklerindeki (boş oyuk) dışındaki tüm reaktifleri ile iyi olarak elde edilen OD değerini çıkarın.
5. Epitop Haritalama
- Osman 16 tarafından tarif edilen metoda göre, epitop eşleme gerçekleştirin. Kısaca, 10 üst üste binen amino asitlerin nitroselüloz üzerinde 12 amino asidini ihtiva eden insan α-sinüklein dizisinin Noktası peptidler.
- 50 mM Tris / 150 mM NaCl tamponu, pH 1 ile bloke0% 0.05 Tween 20 ve% 5 süt tozu ihtiva etmektedir. 2-10 ° CO / H de ml başına 2 ug antikorun bir konsantrasyonda çözelti engelleme antikor inkübe edin.
- Membranı 50 mM Tris / 150 keçi anti-fare IgG HRP konjügatı ile% 0.05 Tween 20 ihtiva eden inkübe mM NaCI tampon pH 10 ile üç kez yıkayın. Daha sonra aynı tampon kullanarak başka beş kez bir Western Blot TMB boyama kiti kullanılarak leke membran yıkayın.
6. İstatistiksel Analiz
- OD model karışık etkiler regresyon gerçekleştirmek için R yazılım ve nlme paketi kullanın. Her bir karşılaştırma için, karışık bir etkisi regresyon modeli yerine getirir. Asemptomatik gruplardan semptomatik ayırt etmek için bir sabit efektini kullanın.
- Belirli bir fare tekrarlar değişkenliği yansıtacak şekilde rastgele efektini kullanın. Artıklar inceleyerek homoscedasticity edin ve gerekirse Pinheiro ve Bates 1 doğrultusunda grup içi hataların varyans yapısını modellemek için varyans işlevlerini kullanın7. P. önemi eşiği olarak 0.05 ayarla
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada kullanılan ELISA özel hasta M83 farelerden yüksek tuz tamponu içinde hazırlanan beyni homojenatlarında hastalıkla ilişkili aS (aS D) tanımlanmıştır. Özellikle pSer129 aS (p = 0,0074) tanıyan bir antikor kullanarak, ELISA kolaylıkla genç (eski 2-5 ay), sağlıklı M83 farelerde (Şekil 1) eski, hasta farelerin (> 8 aylık) ayırır. Birkaç diğer antikorlar benzer şekilde yüksek sinyaller sadece hasta farelerin beyin homojenatlanndaki (> 0.6 OD) gösterdi. Bu 4D6 durum (p = 0.01) proteini (124-134, 115-122 C-terminal parçasının, farklı dizileri karşı LB509 (p = 0.0047) ve 8A5 (p <0.001) ve 129-140 olan sırası ile) ve daha az bir ölçüde, protein (p = 0.0003), N-terminal ucunda (2-12) karşı syn514. Ayrıca, AS11 monoklonal antikor C57BL / 6S ve aşılamadan sonra insan fibriler rekombinant aS 18 (B6 aS-null) 19 karşı laboratuarda üretilenα-sin lokusunun bir delesyonu olan fareler, yalnızca hasta farelerin beyin homojenatlanndaki benzer yüksek sinyaller (p <0.01). Bu antikor, artık, insan α-sinüklein 118-125 dizisine karşılık gelen, aS amino asit sekansı (P) VDPDNEAY (E) tanımak için gösterilmiştir.
Bunun aksine, bu deney koşulları altında, α-sinüklein (91-96 dizi) bir merkezi bölgesine karşı yönlendirilmiş klon 42 algılama antikoru beyin homojenatlarının analiz, her ikisi de hasta ve sağlıklı M83 fareler için çok düşük bir sinyal gösterdi. Bu fareler iki popülasyonları (p = 0,1158) ayırt edemedi. Genç M83 fareler yine de olmayan transgenik fareler B6C3H yaptım daha yüksek immunoreaktivitesini (M83 genetik arka plan çizgisi) gösterdi. Kontrast C57BL / 6S ile silinen α-syn lokusunu var (B6 aS-null) fareler, daha da büyük oldu. Bu M83 farelerde hafif immünoreaktivite, normal aS düşük sinyal tespiti karşılık geldiğini göstermektedir. birBu ELİSA'nın Nalytical hassasiyeti göre değerlendirildi, daha önce ELISA ve Western blot yöntemleri, aynı hasta M83 hazırlanabilir beyin homojenatlarının seri dilüsyonları her ikisini birden kullanarak, incelenerek, çözünmeyen Ser129 fosforile α-sinüklein saptanması için Western Blot yöntemi 4 anlatılan fare beyin (Şekil 2). Yaklaşık 10 ug beyin eşdeğer LB509 ve PSer129 antikorları hem bu hasta fare beyin homojenatı için olumlu bir ELISA sinyali elde etmek için yeterli idi. Aksine, en az 200 ug, beyin eşlenik aynı PSer129 antikor 15 kullanılarak Western blot ile analiz sarkosil çözünmeyen fraksiyonda pSer129 aS tespit etmek için ihtiyaç duyulmaktadır. Bu ELISA, bir analitik hassasiyet Western lekeleme yöntemi bazı 20 kat sahip olduğunu gösterir.
Hasta ve yaşlı farelerin M83 (Şekil 3A), mezensefalona beyin homojenatlarında, beyin sapı ve omurilik sho evlenmek ELISA LB509 ve PSer129 antikorlar hem immünreaktivite işaretlenmiş. Bununla birlikte, hiç bir bulgulanabilir imüno koku ampul, serebral korteks, striatum, hipokampüs, talamus ve hipotalamus dahil olmak üzere diğer beyin bölgelerinde görülmüştür. ELISA beyincik için zayıf bir sinyal verdi. Hasta bir M83 fare 4 (Şekil 3B), bir beyin ekstresi enjeksiyonu takiben hızlandırılmış bir klinik hastalık geliştirme M83 farelerin farklı beyin bölgelerinde imünoreaktivitesi M83 fareler aşılanmamış yaş (eski> 8 aydır) içinde görülene farksızdı. Bu sonuçlar, beyin ve omurilik kaudal bölgelerinde Ser129 α-sinüklein çok daha büyük bir birikme gösteren Western blot (Şekil 3C) ve immünohistokimya 15 ile elde edilen, tamamen tutarlıdır.
/52752/52752fig1highres.jpg "Width =" 700 "/>
M83 fareden elde edilmiş tüm beyin homojenatlanndaki hastalıkla ilişkili α-sinüklein (aS D) 1. ELISA algılama Şekil. Syn514 ELISA birleştirerek tavşan anti-aS poliklonal (kaplama), LB509, AS11, 4D6, 8A5 anti-pSer129 aS (PSer129) ile (tespit) ya da klon 42 (kaplama) (algılama) antikorlar, sağlıklı M83 farelerin hasta farelerin ayırt Anti-aS tavşan poliklonal ile ELISA (kaplama) / clone42 (algılama) ise yok. 11 ila 16 ay arasında değişen altı hasta, yaşlı M83 fareler (klon 42 antikoru hariç), anti α-syn antikorlar ile imünoreaktivite belirtileri gösterdi. Bu 2 ila 5 aylık yaş arası ya altı genç, sağlıklı fareler için durum böyle değildi, ya da B6C3H veya B6 aS boş farelerde (M83 farelerin genetik arka plan) dahil olmak üzere ek kontroller ile. Hata çubukları Bétemps 15 den Modifiye SD temsil etmektedir.
Pozitif sinyal, hasta beyin homojenatlarının halde iki kat seyreltisi 12.5 ug hem LB509 beyin değerler ve PSer129 antikorlar için ELISA ile elde edilmiştir ELISA ve Batı beneği. A. aS D saptanması analitik hassasiyet Şekil 2. karşılaştırması fare. ELISA önlemleri + 3 standart sapmaların 3-6 tekrarlar sırasında sağlıklı M83 farelerin örneklerinden elde edilen araçlarla karşılık gelen hasta ve sağlıklı farelerin ayrımcılık için tahmini kesme seviyesi, sırasıyla LB509 ve PSer129 algılama antikorları için 0,030 ve 0,020 idi . Bu antikorların her biri için kullanılan ile aynı renkte bir çizgi olarak gösterilmiştir. B. presen ultrasantrifugasyon sonra elde edilen çözünür olmayan fraksiyonların Western blot analizi ileSarkosyl ve ce, 200 mikrogram beyin eşdeğer aynı PSer129 antikoru ile aS D algılamak için ihtiyaç vardı. (KDa cinsinden) Moleküler ağırlık belirteçleri blot solunda gösterilmiştir. Bétemps 15 izniyle.
ELISA ve Western Blot ile M83 farelerin beynin farklı bölgelerinde hastalıkla ilişkili α-sinüklein (aS D) Şekil 3. Algılama. ELISA PSer129 veya LB509 algılama normal yaşlanma (A) sırasında M83 farelerde antikor (n = 1, 4 tekrarlar, ortalama ± SD) ya da bir hasta M83 bir beyin homojenat ile 6 haftalık M83 farelerin aşılama sonrası ile aS D tespit ( B) (n = 1, 4 tekrarlar) ortalama ± SD. (C) aS D W ile tanımlandıestern hasta M83 fare beyin homojenat ile aşılanmış farelerde aynı nöro-anatomik bölgelerde PSer129 algılama antikoru EP1536Y ile kurulayın. (KDa cinsinden) Moleküler ağırlık belirteçleri, toplam Proteinlerin eşit miktarları daha jeli üzerinde eş yükleme için her hat kullanılmıştır paneli C solunda gösterilmiştir. Hasta M83 farelerden aşağıdaki sekiz nöro-anatomik bölgeler test edilmiştir: OB: Olfaktif ampul, Cx: serebral korteks, Hi: hipokampus, St: striatum, Me: mesencephalon, Cb: Beyincik, BS: beyin sapı, SC: Servikal omurilik . Bétemps 15 modifiye.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
bir ELISA kullanımı özellikle M83 transjenik fare modelinde hastalıktan sırasında fare beyni homojenatlarında şirketinden aS D tespit etmek için ortaya konmuştur. Nitekim, bu ELISA kolayca Yüksek Tuz tamponunda sadece tüm beyin homojenatları kullanarak sağlıklı M83 farelerden elde edilen hasta M83 fareler ayırt olabilir.
Bu ELISA kullanılarak başarılı sonuçlar için en kritik adımlar şunlardır: doğru diseksiyon sırasında zarar görmesini önlemek için gerekli el becerisi geliştirerek fare beyinleri farklı bölgelerini diseksiyon; münhasıran HS tamponu örnek dilüsyonları yapmak; ve antikorların seçimi, bütün antikorlar, bir ELISA formatında çalışır, çünkü.
AS D seviyelerinde bazı değişkenlik farklı fareler arasında yine belli oldu. Bu sonuçlar, sark incelenmesi ile, sadece hasta M83 farelerde tespit tipik aS D desen Western blot algılama eşdeğerdirSer129 karşı bir antikor ile tespit edildikten sonra nosil çözünmeyen fraksiyonlar aS 15 fosforile. Bu ELISA imüno aS D spesifik tespiti için uygun olup olmadığını göstermektedir.
Önceki Western Blot ile anlaşma 15 analizlerde, bu ELISA yanı sıra servikal spinal kord gibi, beyinde, yani mezensefalona ve beyin sapı kuyruk kısımlarında hasta M83 farelerin beyin diseksiyonu sonrası immunoreaktivitesini algılandı. Immünoreaktivite koku ampul, serebral korteks, striatum ve hipokampus fibriler alfa ile inoküle edilmiş fareler durumunda çok düşük seviyelerde sürece, patolojik sürecin 6 kurtulmuş olduğunu gösteren daha önceki verilere uygun olarak hipokamp, saptandı hipokampus 15 içine sinüklein. aS D dağılımı bu şekilde inc olan, son derece düzgün genel olarak, ne olursa olsun, deneysel koşullar ortayaiçermiştir ya farelerin normal yaşlanma veya hastalık M83 farelerden alınan beyin homojenatlarının içi beyin aşılamadan sonra hastalığın gelişimini hızlandırmıştır.
Ayrıca, tahlil performansı, daha önce tarif edilen VVestern blot yöntemi daha iyidir. Hasta bir M83 fare (Batı benek analizi için, 200 ug vs ELISA için 12.5 ug) bir beyin homojenatının seri dilüsyonları kullanılarak Bu testte elde edilen algılama sınırları ile gösterildiği gibi ELISA analitik hassasiyet, yüksek çıktı. ELISA hassasiyeti Ancak, serebral korteks 15 bireysel hücrelerde ve ön beyin bölgelerinde aS D tespit immünohistokimyasal tespiti, daha düşük kalmıştır. Testin duyarlılığı yine daha önce 13 tarif edildiği gibi chemiluminescent algılama gibi farklı antikorları ve / veya optimize tespit sistemleri kullanılarak geliştirilebilir.
Önemlidiğer bazı antikorlar, proteinin diğer şekillerini tanıma ve özellikle (4D6 monoklonal antikor 20 ile tespit edilir) olmayan bir fosforlu şekli özellikle pSer129 aS tanıyan monoklonal antikora ek olarak, bu ELISA kullanılarak benzer sonuçlar vermiştir unutmayın. Bu ELISA yaklaşımı, aynı zamanda, hasta farelerin 15, aynı hasta hayvanların ve / veya beyin bölgelerinde daha düşük bir ölçüde, spesifik olarak insan aS (LB509) ve tanıyan antikorlar, fare aS (D37A6) imünoreaktivite gösterdi. Diğer taraftan, herhangi bir imünoreaktivite bu ELISA koşullar altında şifreli olabilir bir epitopa karşılık gelen aS (91-96) 21,22 merkezi bölgesine karşı klon 42 antikoru kullanılarak hasta M83 farelerin ELISA analizi ile tespit edildi. Oligomerik formları insan plazmasında Foulds 11 tarafından gözlemlenen ve muhtemelen, fosforilatlanmamış olarak hum tarif edildiği gibi bu ELISA formatı, M83 Fare beyinleri hem Ser129 fosforile aS içinde algılayabilirBir plazma ve beyin omurilik sıvısı 12,14. Daha önce yayınlanmış ELISA'larda aksine, bizim ELISA formatında aS oligomerik formu algılamak için yakalama ve tespiti de aynı antikor kullanıldı, ne de bilinen antikorlar Unterberger çalışmalarda kullanılan 5G4 antikor gibi, şekilsel olarak.
Daha önce M83 fareler 4 beyin homojenatlanndaki aS D tespit etmek için kullanılan Western blot yöntemi aksine, ELISA hastalıkla ilişkili proteinin 23 tespit etmek için böyle bir sarkosil olan, ultrasantrifüj yolu ile bir konsantrasyon adımına gerek yoktu. Hastalık ile ilişkili aS, daha önce gücü 2,6 artan tamponlar kullanılarak sıralı ekstre M83 farelerde tespit edilmiştir. Bakış pratik bir bakış açısından, bu niceliksel tahlili, Western blot edilen prosedüre göre önemli zaman ve reaktifler kaydeder.
Bu çalışmada, bir ELISA yaklaşımı kullanılarak ayrıntılı aS, moleküler analizleri mümkün kılanKolayca hasta M83 farelerde farklı antikorlarla immünreaktivite ölçmek. Bu niceliksel bakış açısıyla sinükleinopatilerle sırasında aS toplama rol oynayan moleküler mekanizmalar ışık tutabilir. Bu ELISA yaklaşımı, bu nedenle Foulds 11 görünen programları olmayan fosforile daha tanısal belirteç olarak daha fazla söz inanıyor gibi Ser129 fosforile aS olarak patoloji güvenilir işaretleyici ile çeşitli biyolojik numunelerde aS D algılamak için hızlı ve kolay bir araç temelini sağlayabilir Protein. Son zamanlarda, o toplam aS seviyesi başlangıç semptomları 24 görünümünü sonra zamanla artış eğilimi muhtemelen fosforilatlanmamış aS toplam aS veya ölçüleri, PD hastalığın ilerlemesi için bir belirteç olarak kullanılabilir gerçeğini işaret .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar aşılar için Damien Gaillard teşekkür ve takibinde hayvan deneyleri istiyoruz. Bu eser Anses (Gıda, Çevre ve İş Sağlığı ve Güvenliği Fransız Ajansı) tarafından ve Vakıf Fransa Parkinson bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB509 | Abcam | ab27766 | Detection antibody 1/2,000 |
| AS11 | Produced at Anses | Detection antibody 1/1,000 | |
| 4D6 | Abcam | ab1903 | Detection antibody 1/2,000 |
| PSer129 | Abcam | ab59264 | Detection antibody 1/3,000 |
| PSer129 EP1536Y | Abcam | ab51253 | Detection antibody 1/1,000 |
| syn514 | Abcam | ab24717 | Detection antibody 1/500 |
| clone 42 | BD Biosciences | 610787 | Coating and detection antibody (1/2,000) |
| 8A5 | Provided by Dr. Anderson | Detection antibody 1/2,000 | |
| polyclonal anti-αsyn antibody | Millipore | AB5038P | Coating antibody |
| Anti-mouse IgG HRP conjugate | Southern Biotech | 1010-05 | |
| Anti-rabbit IgG HRP conjugate | Southern Biotech | 4010-05 | |
| Goat anti-mouse IgG HRP conjugate | Dianova | 115-035-164 | |
| HS buffer | Adjust at pH 7.5 and keep at 4 °C | ||
|
Euromedex | 26-128-3094-B | |
|
Euromedex | 1112-A | |
|
Euromedex | EU0007-B | |
|
Sigma | 43815 | |
| PBS | Adjust at pH 7.5 | ||
|
Euromedex | 1309 | |
|
Euromedex | 2018 | |
|
Euromedex | 1112-A | |
|
Euromedex | P017 | |
| Tween 20 | Euromedex | 2001-C | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| DTT 1 mM | Sigma | 43815 | Stock solution 100 mM, toxic |
| 1% phosphatase cocktail | Pierce | 78428 | |
| 1% protease inhibitor cocktail | Roche | 04 693 132 001 | 50x concentrated |
| Microplate MaxiSorpTM | Thermo Scientific | 442404 | |
| Tampon carbonate 50 mM pH 9.6 | |||
|
Sigma | 71360 | 2.86 g/L |
|
Merk | 6329 | 3.36 g/L, pH 9.6 |
| Superblock T20 PBS blocking buffer | Pierce | E6423H | 10x concentrated |
| TMB | Sigma | T0440 | Used for ELISA |
| TMB | Analytik Jena AG | 847-0104200302 | Used for epitope mapping |
| HCl 1 N | Chimie plus | 40030 | |
| Ribolyser | Thermo | Fast prep FP120 | keep on ice at this step |
| Grinding tubes | Biorad | 355-1197 | |
| Plate washer | Tecan | Columbus Pro | |
| Plate reader | Biorad | Model 680 | |
| Low power magnifier | VWR | 630-1062 | 8X magnification |
| Forceps Dumont#7 | WPI | 14097 | For dissection steps |
| Transfer pipette 1ml Samso | Samso | 043231 | |
| 1.5 ml tubes | Dutscher | 033290 | |
References
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H.
- Waxman, E. A., Giasson, B. I. Specificity and regulation of casein kinase-mediated phosphorylation of alpha-synuclein. J Neuropathol Exp Neurol. 67, 402-416 (2008).
- Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. J Biol Chem. 281, 29739-29752 (2006).
- Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33, 2225-2228 (2012).
- Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209, 975-986 (2012).
- Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34, 521-533 (2002).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, 949-953 (2012).
- Masuda-Suzukake, M., et al.
- Sacino, A. N., et al. Amyloidogenic alpha-synuclein seeds do not invariably induce rapid, widespread pathology in mice. Acta neuropathologica. 127, 645-665 (2014).
- Recasens, A., et al. Lewy body extracts from parkinson's disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Ann Neurol. , (2013).
- Foulds, P. G., et al. Phosphorylated alpha-synuclein can be detected in blood plasma and is potentially a useful biomarker for Parkinson's disease. FASEB J. 25, 4127-4137 (2011).
- El-Agnaf, O. M., et al. Detection of oligomeric forms of alpha-synuclein protein in human plasma as a potential biomarker for Parkinson's disease. Faseb J. 20, 419-425 (2006).
- Lee, H. J., et al. Enzyme-linked immunosorbent assays for alpha-synuclein with species and multimeric state specificities. J Neruosci Meth. 199, 249-257 (2011).
- Unterberger, U., et al. Detection of disease-associated alpha-synuclein in the cerebrospinal fluid: a feasibility study. Clin Neuropathol. 33, 329-334 (2014).
- Betemps, D., et al. Alpha-synuclein spreading in M83 mice brain revealed by detection of pathological alpha-synuclein by enhanced ELISA. Acta Neuropathol. (Berl). 2, 29 (2014).
- Osman, A. A., et al. A monoclonal antibody that recognizes a potential coeliac-toxic repetitive pentapeptide epitope in gliadins). Eur J Gastroenterol Hepatol. 13, 1189-1193 (2001).
- Pinheiro, J. C., Bates, D. M. Ch. 5. Mixed-Effects Models in S and S-PLUS. Chambers, J. 5, Springer. 206-225 (2000).
- Mougenot, A. L., et al. Production of a monoclonal antibody, against human alpha-synuclein, in a subpopulation of C57BL/6J mice, presenting a deletion of the alpha-synuclein locus. J Neruosci Meth. 192, 268-276 (2010).
- Specht, C. G., Schoepfer, R. Deletion of the alpha-synuclein locus in a subpopulation of C57BL/6J inbred mice. BMC Neurosci. 2, 11 (2001).
- Lee, B. R., Matsuo, Y., Cashikar, A. G., Kamitani, T. Role of Ser129 phosphorylation of alpha-synuclein in melanoma cells. J Cell Sci. 126, 696-704 (2013).
- Perrin, R. J., et al. Epitope mapping and specificity of the anti-alpha-synuclein monoclonal antibody Syn-1 in mouse brain and cultured cell lines. Neurosci Lett. 349, 133-135 (2003).
- Emmanouilidou, E., et al. Assessment of alpha-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma. PLoS One. 6, e22225 (2011).
- Mougenot, A. L., et al. Transmission of prion strains in a transgenic mouse models overexpressing human A53T mutated alpha-synuclein. J Neuropathol Exp Neurol. 70, 377-385 (2011).
- Foulds, P. G., et al. A longitudinal study on alpha-synuclein in blood plasma as a biomarker for Parkinson's disease. Sci Rep. 3, 2540 (2013).
