Abstract
I tillegg til etablerte metoder som Western blot, nye metoder for å raskt og enkelt kvantifisere sykdomsassosierte α-synuclein (aS D) i eksperimentelle modeller av synucleopathies. En transgen mus linje (M83) over-uttrykker den humane A53T aS og spontant utvikle en dramatisk kliniske fenotype mellom åtte og 22 måneders alder, karakterisert ved symptomer som omfatter vekttap, utmattelse, og alvorlig motorfunksjon, ble anvendt i denne studien. For molekylære analyser av aS D (sykdomsassosierte aS) i disse musene, ble en ELISA designet spesielt kvantifisere aS D i syke mus. Analyse av det sentrale nervesystemet i denne musemodellen viste tilstedeværelse av aS D hovedsakelig i kaudal områder av hjernen og ryggmargen. Det var ingen forskjeller i aS D fordeling mellom ulike eksperimentelle forhold som fører til klinisk sykdom, dvs. i uninoculrerte og normalt aldrende gene mus og hos mus inokulert med hjerne utdrag fra syke mus. Den spesifikke påvisning av aS D-immunreaktivitet ved hjelp av et antistoff mot Ser129 fosforylert aS ved ELISA i det vesentlige korrelerte med det som ble oppnådd ved Western blot og immunhistokjemi. Uventet, ble lignende resultater observert med flere andre antistoffer mot den C-terminale delen av aS. Utbredelsen av aS D, noe som tyder på involvering av en "prion-like" mekanismen, kan således lett overvåkes og kvantifisert i denne musemodellen ved anvendelse av en ELISA-metode.
Protocol
Alle prosedyrer og protokoller som involverer dyr var i samsvar med EU-direktiv 86/609 / EEC og ratifisert av kommer, den franske nasjonale komiteen for vurdering av etikk i dyreforsøk (protokoll 11-0043). Dyrene ble huset og tatt vare på i Anses godkjente eksperimentelle fasiliteter i Lyon (godkjenning B 69387 0801).
1. Fremstilling av mus
- Avlive mus ved intraperitoneal injeksjon av en dødelig dose av natriumpentobarbital.
- Hente hele hjernen fra musen skallen og legg den i en 35 mm plast petriskål på is inntil utvinning.
- Pakk ut cervical ryggmargen.
MERK: Utdrag aS enten fra en av hjernehalvdelene etter sagittal seksjonering eller fra dissekert mus hjerner, tilgjengelig etter forsøkene oppført i tabell 1.
| Experiment | Mus Inoculum (hjernen tilsvarende) | Overlevelse perioden (Ppt) | Median / maksimal overlevelse (dager gamle) | aS d deteksjon av ELISA / WB / IHC |
| 1 | Uinokulert mus | 441 ± 166 | 419/736 | 8/8 |
| 2 | Vaksinert mus (0,2 mg) | 150 ± 52 | 140/241 | 9/9 |
Tabell 1. Liste over eksperimenter utført på M83 mus. Inokuleringer ble utført ved 6 uker for eksperiment 2 i Striato-cortical område med 20 ul av en hjernehomogenat av den syke mus (1% vekt / vol glukose 5%), etter anestesi av seks uker gamle homozygot M83 mus med 3% isofluran innånding. dpi: dager etter inoculasjon.
2. aS Utvinning fra Brain halvdeler
- Sagittally kutte hjernen til å få to halvdeler. Veie hver halvdel i en ribolysis rør som inneholder slipe baller.
- Forbered høyt salt (HS) buffer inneholdende 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 750 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 1% fosfatase og protease-inhibitor cocktail. Legg buffer med høyt saltinnhold til hjernehalvdelene for å oppnå 20% (vekt / volum) homogenat.
- Forberede prøver fra hjernehalvdelen med en mekanisk homogenisator på 6,0 m / s for 23 sec to ganger. Etter den første 23 sek homogenisering, plasserer rørene inneholdende homogenater på is i 2 minutter før den andre 23-sek syklus.
- Sentrifuger prøvene ved 1000 xg i 5 minutter for å eliminere umalt hjerne fragmenter. Gjenopprette supernatantene, dele inn i 200 mL alikvoter og holde dem ved -80 ° C for etterfølgende ELISA-analyser.
3. aS Utvinning fra dissekert hjerneregioner
- Dissekere enhele hjernen i en 35 mm plast petriskål på isen med et lavt strømforbruk forstørrelsesglass (8X forstørrelse) bruker to forcipes som ender holdes sammen, bortsett fra når dissekere hippocampus. Ikke overstige 10 min å bevare hjernen integritet. Plasser hjernen høyre side opp og hente følgende områder av hjernen i denne rekkefølgen:
- Separate en av de to olfactory pærer med tang plassert like bak pære. Løsne den fra hjernen ved en bevegelse nedover. Gjenta denne operasjonen for den andre pæren.
- Forsiktig kile pinsett mellom de to cortexes og bevege den fremover for å lette adskillelse av de to cortexes. Holde hjernen på plass med en tang, for å bruke et annet skille cortex fra hippocampus.
- Plasser pinsett 2 mm under hjernebarken. Opprettholde et forsiktig press på tang til toppen av hippocampus er synlig. Skrelle av første del av hjernebarken, og gjenta med den andre delen. Bruk pinsett for å skille de to cortexesstarter på hippocampus, og beveger seg mot fronten av hjernen.
- Plasser den åpne tang rundt en av de hippocampi. Lukker tangen i bunnen av hippocampus deretter forsiktig fjerne den, utvinne så mye som mulig. Gjenta fremgangsmåten for den andre hippocampus.
- Plasser de åpne tenger under et av striata og forsiktig skille det fra hjernen. Bruk pinsett til å fjerne eventuelle gjenværende cortex fra striatum. Gjenta denne fremgangsmåten for den andre striatum.
- Bruk pinsett til å trykke forsiktig ved 2 mm konturen av lillehjernen for å lette separasjon av cerebellum fra hjernen. Plasser tang like bak lillehjernen og fjern den ved å flytte tang fremover.
- Bruk den brede delen av pinsett til å heve mesencephalon for å tydelig se hvor det blir hjernestammen. Lag en vertikal innsnitt i krysset deretter fjerne hjernestammen.
- Plasser tang bak mesencephalon, som jegs sammensatt av fire avrundede strukturer. Incise vertikalt inntil mesencephalon er fullstendig adskilt fra den gjenværende hjernen.
- Forbered homogenater av variable% (vekt / volum) i HS-buffer, avhengig av mengden av tilgjengelige vev, dvs. 5% homogenat for en vekt mellom 10 og 30 mg, 10% for en vekt mellom 30 og 80 mg, og 20% for en vekt over 80 mg.
- Legg et tilstrekkelig volum av HS-buffer til de dissekerte områder av hjernen for å oppnå den forventede% av homogenat.
- Vortex og kontroller at vev er fullstendig oppslukt i HS buffer.
- Homogenprøver tilberedt av de dissekerte hjerneregioner eller cervical ryggmargen med en vevsmaler består av en borsilikatglass rør og to pestles, A og B.
- Hell hver hjerneregion for å bli knust direkte inn i røret. Sett stampe A inn i røret og trekke den tilbake. Gjenta denne bevegelsen omtrent ti ganger for å distansere vevet. Så bruker stampe B til Csliping, rediger vevet med en ytterligere 20 bevegelser. Overfør homogenater i et 1,5 ml rør med en 1 ml pipette overføring.
- Sentrifuger prøvene ved 1000 xg i 5 min ved 4 ° C for å eliminere eventuelle umalt hjerne fragmenter. Hente supernatantene, dele dem opp i 200 mL alikvoter og holde dem ved -80 ° C for etterfølgende ELISA-analyser.
4. Påvisning av aS med ELISA
- Fortynn belegg antistoffene til 0,01 ng / ml. Bruk enten anti-aS kanin polyklonale eller monoklonale antistoff-klon 42 i 50 mM Na 2 CO 3 / NaHCO3 buffer (pH 9,6).
- Coat 96-brønners mikrotiterplater med 100 ul per brønn av denne beleggløsningen, og forlater ved 4 ° CO / N. Bruk av anti-aS kaninpolyklonalt antistoff i beleggoppløsningen ved hjelp av ELISA for deteksjon-antistoffer syn514, klon 42, LB509, AS11, 4D6 eller 8A5. Bruk av anti-aS monoklonalt antistoff klon 42 som en beleggsløsningi kombinasjon med anti-pSer129 aS deteksjonsantistoff.
MERK: Hvis nødvendig kan platene holdes ved 4 ° C i en uke før de ELISA utføres. - Bruk en platevasker for å vaske platene fem ganger med 300 ul fosfatbufret saltvann med 0,05% Tween 20 (PBST) per brønn. Fra dette trinn videre, er inkubasjon ved RT.
- Tilsett 200 ul PBS-T20 blokkeringsbuffer per brønn. Rist i 1 time ved 150 rpm. Vask platene fem ganger med PBST.
- Fortynn hjernehomogenisater (fortynning 1: 100 til 20% homogenater, 01:50 til 10% homogenater og 01:25 av de 5% homogenater i PBST BSA 1%), og tilsett 100 ul til hver brønn. Deretter inkuberes i 2 timer under rysting ved 150 rpm. Vask platene fem ganger med PBST.
- Legg de ulike aS deteksjons antistoffer i PBST med BSA 1% på fortynninger nevnt i Materials List. Inkuber i 1 time ved 150 rpm. Vask platene fem ganger med PBST.
- Legg enten anti-mouse eller anti-kanin-IgG-HRP-konjugater ble fortynnet 1: 8000 i PBST supplementert med 1% BSA i 1 time under rysting ved 150 rpm. Vask platene fem ganger med PBST.
- Tilsett 100 ul av 3,3 ', 5,5'-tetrametylbenzidin (TMB) løsning til hver brønn og inkuberes i 15 min i mørket under rysting ved 150 rpm.
- Stopp reaksjonen ved å tilsette 100 pl 1 N HCl pr brønn deretter måle absorbansen ved 450 nm med en mikroplateleser.
- For dataanalyse, Trekk OD verdien oppnådd i en brønn med samtlige reagenser unntatt noen musehjerneprøver (blank brønn) fra OD-verdiene som måles for hver av de analyserte prøver.
5. Epitopkartlegging
- Utføre epitopkartlegging i henhold til metoden beskrevet av Osman 16. I korthet, Spot peptider i human α-synuclein sekvens inneholdende 12 aminosyrer på nitrocellulose med 10 overlappende aminosyrer.
- Blokker med 50 mM Tris / 150 mM NaCl-buffer pH 10 inneholdende 0,05% Tween 20 og 5% melkepulver. Inkuber antistoffet i blokkeringsløsning ved en konsentrasjon på 2 pg antistoff per ml ved 2-10 ° CO / N.
- Vask membranen tre ganger ved anvendelse av 50 mM Tris / 150 mM NaCl-buffer, pH 10 inneholdende 0,05% Tween 20. Inkuber med geit anti-mus IgG HRP-konjugat. Vask membranen ytterligere fem ganger med den samme buffer deretter flekken ved hjelp av en Western blot TMB farging kit.
6. Statistisk analyse
- Bruk R programvare og nlme pakke for å utføre blandede-effekter regressions å modellere OD. For hver sammenligning, utføre en blandet effekt regresjonsmodell. Bruk en fast effekt å skille symptomatisk fra asymptomatiske grupper.
- Bruk en vilkårlig effekt for å reflektere den variasjon av repetisjoner for en gitt mus. Sjekk homoscedasticity ved å undersøke restene og om nødvendig bruke variansen funksjoner til å modellere variansen strukturen innen-gruppe feil i tråd med Pinheiro og Bates 17. Sett 0,05 som betydningen terskelen til P.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne studien, ELISA brukes spesifikt identifisert sykdomsassosierte aS (aS D) i hjernen homogenates utarbeidet i en High Salt buffer fra syke M83 mus. Ved hjelp av et antistoff som spesifikt gjenkjenner pSer129 aS (p = 0,0074), ELISA lett skiller gamle, syke mus (> 8 måneder gammel) fra unge (2-5 måneder gammel), sunne M83 mus (figur 1). Flere andre antistoffer viste tilsvarende høye signaler (> 0,6 OD) bare i hjernen homogenates fra syke mus. Dette er tilfellet for 4D6 (p = 0,01), LB509 (p = 0,0047) og 8A5 (p <0,001) mot forskjellige sekvenser av den C-terminale del av proteinet (124-134, 115-122, og 129-140 henholdsvis) og, i mye mindre grad, syn514 mot den N-terminale ende (2-12) av proteinet (p = 0.0003). Videre AS11 monoklonalt antistoff produsert i vårt laboratorium mot menneske fibrillar rekombinante aS 18 etter immunisering av C57BL / 6S (B6 aS-null) 19mus med en delesjon av α-syn-locus, viste tilsvarende høye signaler (p <0,01) bare i hjernehomogenisater fra syke mus. Dette antistoffet har nå blitt vist å gjenkjenne aminosyresekvens (P) VDPDNEAY (E) av aS, svarende til 118-125 sekvensen av human α-synuclein.
I motsetning til dette, under disse forsøksbetingelser, analyser av hjernehomogenisater med klon 42 påvisningsantistoff rettet mot et sentralt område av α-synuclein (91-96 sekvens), viste et meget lavt signal både for syke og friske mus M83. Det kunne ikke skille de to populasjoner av mus (p = 0,1158). Unge M83 mus likevel viste en høyere immunoreaktivitets enn gjorde ikke transgene B6C3H mus (M83 genetisk bakgrunn linje). Kontrasten var enda større med C57BL / 6S (B6 aS-null-mus), som har en slettet α-syn-locus. Dette tyder på at svak immunoreaktivitets i M83 mus tilsvarer lav signal deteksjon av normale aS. A-ennalytical følsomheten av denne ELISA ble vurdert i forhold til en tidligere beskrevet Western blot fremgangsmåte 4 for påvisning av uoppløselige Ser129 fosforylert α-synuclein, ved undersøkelse, ved hjelp av både ELISA og Western blot-metoder, seriefortynninger av hjerne-homogenater fremstilt fra den samme syke M83 mus hjernen (figur 2). Tilnærmet 10 pg hjerne midler er tilstrekkelig til å oppnå et positivt ELISA-signal for hjernehomogenat fra denne syke mus, med både LB509 og PSer129 antistoffer. Tvert imot ble minst 200 ug hjerne ekvivalenter nødvendig for å oppdage pSer129 aS i sarkosyl-uoppløselige fraksjon analysert ved Western blot ved anvendelse av den samme PSer129 antistoff 15. Dette indikerer at ELISA er en analytisk følsomhet noen 20 ganger den for Western blot-metoden.
I syke og gamle M83 mus (figur 3A), hjerne homogenates fra mesencephalon, hjernestammen og ryggmargen sho ons merket immunoreaktivitets med både LB509 og PSer129 antistoffer i ELISA. Imidlertid ble ingen påvisbar immunoreaktivitet observert i de andre områder av hjernen, inkludert luktelappen, cerebral cortex, striatum, hippocampus, thalamus og hypothalamus. ELISA ga et svakt signal for cerebellum. Immunreaktiviteten i de forskjellige hjerneregioner av M83-mus utvikler en akselerert klinisk sykdom etter injeksjon av en hjerneekstrakt fra en syk M83 4 mus (figur 3B) var umulig å skille fra det som ses hos eldre (> 8 måneder gammel) M83-inokulert mus. Disse resultatene er i full overensstemmelse med dem som ble oppnådd ved Western blot (figur 3C) og immunhistokjemi 15, viser en mye større avsetning av Ser129 α-synuclein in kaudal regioner av hjernen og ryggmargen.
/52752/52752fig1highres.jpg "Width =" 700 "/>
Figur 1. ELISA påvisning av sykdomsassosierte α-synuclein (aS D) i hele hjernen homogenates fra M83 mus. ELISA kombinere kanin anti-aS polyclonal (coating) med syn514, LB509, AS11, 4D6, 8A5 (gjenkjenning) eller klone 42 (coating) med anti-pSer129 aS (PSer129) (gjenkjenning) antistoffer skille syke mus fra friske M83 mus, mens ELISA med anti-aS kaninpolyklonalt (coating) / clone42 (deteksjon) ikke. De seks syke, gamle M83 mus i alderen fra 11 til 16 måneder viste tegn til immunoreaktivitet med anti α-syn antistoffer (unntatt klone 42 antistoff). Dette var ikke tilfelle for enten de seks unge, friske mus i alderen fra 2 til 5 måneder gammel, eller med ekstra kontroller inkludert B6C3H (genetisk bakgrunn av M83 mus) eller B6 aS-null mus. De feilfelt representerer SD Modifisert fra Bétemps 15.
Figur 2. Sammenligning av den analytiske sensitiviteten for påvisning av aS D ved hjelp av ELISA og Western blot. A. Et positivt signal ble oppnådd med ELISA for 12,5 ug hjernen ekvivalenter med både LB509 og PSer129 antistoffer fra to-gangers fortynninger av hjernehomogenisater fra en syk musen. Den estimerte cut-off nivå for diskriminering av syke og friske mus, tilsvarende midler hentet fra prøver av friske M83 mus under 3-6 ganger i ELISA måler + 3 standardavvik, var 0.030 og 0.020 for LB509 og PSer129 deteksjons antistoffer henhold . De er vist som en linje i samme farge som den som benyttes for hver av antistoffene. B. Ved Western blot-analyse av de uoppløselige fraksjoner oppnådd etter ultrasentrifugering i presentace av sarkosyl, ble 200 ug hjerne ekvivalenter nødvendig for å oppdage aS D med den samme PSer129 antistoff. Molekylvektmarkører (i kDa) er vist på venstre side av blot. Gjengitt med tillatelse fra Bétemps 15.
Figur 3. Påvisning av sykdomsassosierte α-synuclein (aS D) i ulike områder av hjernen av M83 mus ved ELISA og Western blot. ELISA identifisert aS D med PSer129 eller LB509 deteksjons antistoffer i M83 mus i løpet av normal aldring (A) (n = 1, 4 gjentagelser, middelverdi ± SD) eller etter inokulering av seks uker gamle M83-mus med en hjerne-homogenat fra en syk M83 ( B) (n = 1, 4 rapporter, gjennomsnitt ± SD). (C) aS D ble identifisert ved Western klatt med PSer129 deteksjonsantistoff EP1536Y i de samme nevro anatomiske regioner i mus inokulert med en hjernehomogenat fra en syk M83 mus. Molekylvektmarkører (i kDa) er indikert på venstre side av panelet C. Like mengder av de totale proteinene ble benyttet i hver linje for ekvivalent lasting på gel. Følgende åtte nevro anatomiske regioner fra syke M83 mus ble testet: OB: olfactive pære, Cx: cerebral cortex, Hi: hippocampus, St: striatum, Me: mesencephalon, Cb: cerebellum, BS: hjernestammen, SC: cervical ryggmargs . Modifisert fra Bétemps 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruken av et ELISA ble vist å spesifikt gjenkjenne aS D direkte fra musehjerne-homogenater under sykdommen i M83 transgen musemodell. Faktisk kan dette ELISA lett skille syke M83 mus fra friske M83 mus med bare hele hjernen homogenates i High Salt buffer.
De mest kritiske stegene for vellykkede resultater ved hjelp av denne ELISA er: riktig dissekere de ulike regionene i musen hjernen ved å utvikle den nødvendige fingerferdighet for å hindre skade under disseksjon; utføre prøvefortynninger utelukkende i HS buffer; og valg av antistoffer, fordi ikke alle antistoffene vil fungere i et ELISA-format.
Noen variasjon i aS D-nivåer var likevel tydelig mellom ulike mus. Disse resultatene er ekvivalent med Western blot påvisning av typiske aS D mønster bare detektert i M83 syke mus ved undersøkelse av Sarkosyl-uløselige fraksjoner etter påvisning med et antistoff mot Ser129 fosforylert aS 15. Dette viser at ELISA-immunoreaktivitet tilsvarer spesifikk påvisning av aS D.
I overensstemmelse med foregående Western blot-analyser 15, denne ELISA påvises immunreaktivitet etter disseksjon av hjernen av syke M83 mus i kaudal deler av hjernen, dvs. mesencephalon og hjernestammen, samt i den cervikale ryggmargen. Ingen immunreaktivitet ble detektert i luktelappen, cerebral cortex, hippocampus og striatum, i samsvar med tidligere data som indikerer at den hippocampus ble spart ved den patologiske prosess 6, med mindre ved meget lave nivåer i tilfelle av mus som var blitt inokulert med fibrillær alfa -synuclein inn i hippocampus 15. Fordelingen av aS D dermed dukket bemerkelsesverdig ensartet ordnede, uansett eksperimentelle forhold, som included enten normal aldring av mus eller akselerert utvikling av sykdommen etter intra-cerebral inokulering av hjerne homogenates fra syke M83 mus.
Videre er målemetoden bedre enn den tidligere beskrevne Western blot-metoden. Den analytiske sensitiviteten for ELISA synes større, som vist ved deteksjonsgrensene oppnådd i dette forsøket ved bruk av seriefortynninger av en hjernehomogenat fra en syk M83 mus (12,5 ug for ELISA vs 200 ug for Western blot-analyse). Følsomheten av ELISA forble imidlertid lavere enn den for immunhistokjemisk deteksjon, som oppdager aS D i individuelle celler, og i frontale hjerneområder slik som cerebral cortex 15. Følsomheten av forsøket kan ikke desto mindre bli ytterligere forbedret ved hjelp av forskjellige antistoffer og / eller optimaliserte deteksjonssystemer, for eksempel kjemiluminescent detektering som tidligere beskrevet 13.
Det er viktigå merke seg at en rekke andre antistoffer som gjenkjenner andre former av proteinet, og spesielt en ikke-fosforylert form (påvist med monoklonale antistoff 4D6 20) ga lignende resultater ved hjelp av denne ELISA, i tillegg til det monoklonale antistoff som spesifikt gjenkjenner pSer129 aS. Dette ELISA tilnærming også avdekket immunoreaktivitets med antistoffer som gjenkjenner spesifikt menneskelige aS (LB509) og, til en mye lavere grad, mus aS (D37A6) i de samme syke dyr og / eller hjerneregioner av syke mus 15. På den annen side ble ingen immunreaktivitet observert ved hjelp av ELISA-analyse av M83 syke mus ved å klone 42 antistoff mot et sentralt område av aS (91-96) 21,22, som svarer til en epitop som kan være kryptiske under disse ELISA-betingelser. Denne ELISA-format kunne påvise i M83 mus hjerner begge Ser129 fosforylerte aS, som observert av Foulds 11 i humant plasma, og ikke-fosforylert, eventuelt oligomere former, som beskrevet i humen plasma og spinalvæske 12,14. I motsetning til tidligere publiserte ELISA, vår ELISA format verken brukt samme antistoff i fangst og gjenkjenning for å oppdage oligomert form av aS, og heller ikke antistoffer kjent for å være conformational, som 5G4 antistoff som brukes i Unterberger studier.
I motsetning til Western blot-metoden som tidligere ble brukt for å detektere aS D i hjernehomogenisater fra M83 4 mus, ble ELISA ikke krever et konsentrasjonstrinn, for eksempel ved ultrasentrifugering med sarkosyl å detektere den sykdomsassosierte protein 23. Sykdomsassosierte aS ble tidligere identifisert i M83 mus ved sekvensiell ekstraksjon ved hjelp av buffere med økende styrke 2,6. Fra et praktisk synspunkt, dette sparer kvantitative analysen betydelig tid og reagenser i forhold til Western blot prosedyren.
I denne studien, detaljerte aS molekylære analyser ved bruk av en ELISA-metode gjorde det mulig ålett kvantifisere immunoreaktivitets med forskjellige antistoffer i syke M83 mus. Det kunne kaste lys over de molekylære mekanismene som er involvert i aS aggregering under synucleinopathies fra et kvantitativt synspunkt. Dette ELISA tilnærming kan derfor gi grunnlag for en rask og enkelt verktøy for å oppdage aS D i ulike biologiske prøver med en pålitelig markør for patologi som Ser129 fosforylerte aS som Foulds 11 mener viser mer lovende som en diagnostisk markør enn ikke-fosforylert protein. Nylig påpekte han at målinger av de totale aS, eller eventuelt ikke-fosforylerte aS kunne brukes som en surrogatmarkør for sykdomsprogresjon hos PD, som nivået av total aS en tendens til å øke over tid etter forekomsten av første symptomene 24 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Damien Gaillard for vaksiner og oppfølging av dyreforsøk. Dette arbeidet ble støttet av Anses (fransk Agency for mat, miljø og Occupational Health & Safety) og av et stipend fra stiftelsen Frankrike Parkinson.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB509 | Abcam | ab27766 | Detection antibody 1/2,000 |
| AS11 | Produced at Anses | Detection antibody 1/1,000 | |
| 4D6 | Abcam | ab1903 | Detection antibody 1/2,000 |
| PSer129 | Abcam | ab59264 | Detection antibody 1/3,000 |
| PSer129 EP1536Y | Abcam | ab51253 | Detection antibody 1/1,000 |
| syn514 | Abcam | ab24717 | Detection antibody 1/500 |
| clone 42 | BD Biosciences | 610787 | Coating and detection antibody (1/2,000) |
| 8A5 | Provided by Dr. Anderson | Detection antibody 1/2,000 | |
| polyclonal anti-αsyn antibody | Millipore | AB5038P | Coating antibody |
| Anti-mouse IgG HRP conjugate | Southern Biotech | 1010-05 | |
| Anti-rabbit IgG HRP conjugate | Southern Biotech | 4010-05 | |
| Goat anti-mouse IgG HRP conjugate | Dianova | 115-035-164 | |
| HS buffer | Adjust at pH 7.5 and keep at 4 °C | ||
|
Euromedex | 26-128-3094-B | |
|
Euromedex | 1112-A | |
|
Euromedex | EU0007-B | |
|
Sigma | 43815 | |
| PBS | Adjust at pH 7.5 | ||
|
Euromedex | 1309 | |
|
Euromedex | 2018 | |
|
Euromedex | 1112-A | |
|
Euromedex | P017 | |
| Tween 20 | Euromedex | 2001-C | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| DTT 1 mM | Sigma | 43815 | Stock solution 100 mM, toxic |
| 1% phosphatase cocktail | Pierce | 78428 | |
| 1% protease inhibitor cocktail | Roche | 04 693 132 001 | 50x concentrated |
| Microplate MaxiSorpTM | Thermo Scientific | 442404 | |
| Tampon carbonate 50 mM pH 9.6 | |||
|
Sigma | 71360 | 2.86 g/L |
|
Merk | 6329 | 3.36 g/L, pH 9.6 |
| Superblock T20 PBS blocking buffer | Pierce | E6423H | 10x concentrated |
| TMB | Sigma | T0440 | Used for ELISA |
| TMB | Analytik Jena AG | 847-0104200302 | Used for epitope mapping |
| HCl 1 N | Chimie plus | 40030 | |
| Ribolyser | Thermo | Fast prep FP120 | keep on ice at this step |
| Grinding tubes | Biorad | 355-1197 | |
| Plate washer | Tecan | Columbus Pro | |
| Plate reader | Biorad | Model 680 | |
| Low power magnifier | VWR | 630-1062 | 8X magnification |
| Forceps Dumont#7 | WPI | 14097 | For dissection steps |
| Transfer pipette 1ml Samso | Samso | 043231 | |
| 1.5 ml tubes | Dutscher | 033290 | |
References
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H.
- Waxman, E. A., Giasson, B. I. Specificity and regulation of casein kinase-mediated phosphorylation of alpha-synuclein. J Neuropathol Exp Neurol. 67, 402-416 (2008).
- Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. J Biol Chem. 281, 29739-29752 (2006).
- Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33, 2225-2228 (2012).
- Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209, 975-986 (2012).
- Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34, 521-533 (2002).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, 949-953 (2012).
- Masuda-Suzukake, M., et al.
- Sacino, A. N., et al. Amyloidogenic alpha-synuclein seeds do not invariably induce rapid, widespread pathology in mice. Acta neuropathologica. 127, 645-665 (2014).
- Recasens, A., et al. Lewy body extracts from parkinson's disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Ann Neurol. , (2013).
- Foulds, P. G., et al. Phosphorylated alpha-synuclein can be detected in blood plasma and is potentially a useful biomarker for Parkinson's disease. FASEB J. 25, 4127-4137 (2011).
- El-Agnaf, O. M., et al. Detection of oligomeric forms of alpha-synuclein protein in human plasma as a potential biomarker for Parkinson's disease. Faseb J. 20, 419-425 (2006).
- Lee, H. J., et al. Enzyme-linked immunosorbent assays for alpha-synuclein with species and multimeric state specificities. J Neruosci Meth. 199, 249-257 (2011).
- Unterberger, U., et al. Detection of disease-associated alpha-synuclein in the cerebrospinal fluid: a feasibility study. Clin Neuropathol. 33, 329-334 (2014).
- Betemps, D., et al. Alpha-synuclein spreading in M83 mice brain revealed by detection of pathological alpha-synuclein by enhanced ELISA. Acta Neuropathol. (Berl). 2, 29 (2014).
- Osman, A. A., et al. A monoclonal antibody that recognizes a potential coeliac-toxic repetitive pentapeptide epitope in gliadins). Eur J Gastroenterol Hepatol. 13, 1189-1193 (2001).
- Pinheiro, J. C., Bates, D. M. Ch. 5. Mixed-Effects Models in S and S-PLUS. Chambers, J. 5, Springer. 206-225 (2000).
- Mougenot, A. L., et al. Production of a monoclonal antibody, against human alpha-synuclein, in a subpopulation of C57BL/6J mice, presenting a deletion of the alpha-synuclein locus. J Neruosci Meth. 192, 268-276 (2010).
- Specht, C. G., Schoepfer, R. Deletion of the alpha-synuclein locus in a subpopulation of C57BL/6J inbred mice. BMC Neurosci. 2, 11 (2001).
- Lee, B. R., Matsuo, Y., Cashikar, A. G., Kamitani, T. Role of Ser129 phosphorylation of alpha-synuclein in melanoma cells. J Cell Sci. 126, 696-704 (2013).
- Perrin, R. J., et al. Epitope mapping and specificity of the anti-alpha-synuclein monoclonal antibody Syn-1 in mouse brain and cultured cell lines. Neurosci Lett. 349, 133-135 (2003).
- Emmanouilidou, E., et al. Assessment of alpha-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma. PLoS One. 6, e22225 (2011).
- Mougenot, A. L., et al. Transmission of prion strains in a transgenic mouse models overexpressing human A53T mutated alpha-synuclein. J Neuropathol Exp Neurol. 70, 377-385 (2011).
- Foulds, P. G., et al. A longitudinal study on alpha-synuclein in blood plasma as a biomarker for Parkinson's disease. Sci Rep. 3, 2540 (2013).
