Бестимусным Крыса модель для оценки инженерных передней крестообразной связки трансплантатов
Summary
Animal models are important tools for the evaluation of tissue-engineered grafts. This paper presents the protocol for preparing an electrospun biodegradable polymer graft for use in anterior cruciate ligament tissue engineering, as well as a surgical protocol for implantation in a rat model.
Abstract
Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without intervention. Current treatment strategies include ligament reconstruction with either autograft or allograft, which each have their associated limitations. Thus, there is interest in designing a tissue-engineered graft for use in ACL reconstruction. We describe the fabrication of an electrospun polymer graft for use in ACL tissue engineering. This polycaprolactone graft is biocompatible, biodegradable, porous, and is comprised of aligned fibers. Because an animal model is necessary to evaluate such a graft, this paper describes an intra-articular athymic rat model of ACL reconstruction that can be used to evaluate engineered grafts, including those seeded with xenogeneic cells. Representative histology and biomechanical testing results at 16 weeks postoperatively are presented, with grafts tested immediately post-implantation and contralateral native ACLs serving as controls. The present study provides a reproducible animal model with which to evaluate tissue engineered ACL grafts, and demonstrates the potential of a regenerative medicine approach to treatment of ACL rupture.
Introduction
Разрыв передней крестообразной связки (ACL) является одним из наиболее распространенных связок травмы коленного сустава 1. Потому что разрыв ACL, не в состоянии исцелить без хирургического вмешательства, ограничения в повседневной жизни, а также участия в спортивных привода на 175000 пациентов на операцию каждый 2 года, с ориентировочной стоимостью в один миллиард долларов в год 3. В настоящее время, либо аутотрансплантата или аллотрансплантата сухожилия используется для реконструкции связки. Хотя высокие темпы успех может быть достигнут и с аутотрансплантата и аллотрансплантата замены, серьезные осложнения, связанные с этими вариантов реконструкции 4. Аутотрансплантата ткани связано с донорского участка заболеваемости и ограничивается в поставках, особенно в случаях повторного разрыва или мульти-связочного травмы. С другой стороны, аллотрансплантата ткани связана с задержкой интеграции трансплантата, воспалительную реакцию вредного, теоретической инфекционного риска, а также ограниченного SuppLY 5. Синтетические Неразлагающиеся трансплантаты были разработаны в 1970-х и 1980-х годов, но были затруднены из-за преждевременного трансплантата разрыва, реакции инородного тела, остеолизом и синовита 6. В результате этих серьезных проблем, не существует в настоящее время нет синтетические трансплантаты, доступные для клинического применения в Соединенных Штатах.
Из-за этих ограничений с существующими опциями привитых и последних событиях в области биологии, инженерии и регенеративной медицины, возник большой интерес к ткани инженерное решение для ACL прививки. Современные стратегии тканевой инженерии используют разлагаемые биологическими и синтетическими материалами, чтобы обеспечить ткани хозяина врастания, избегая при этом ограничения, связанные с постоянным синтетического материала имплантации 7.
Поликапролактон (PCL) является биоразлагаемый полимер, который является FDA одобрило для ряда медицинских приложений, включая адгезии барьер и раневая повязка 8, который был UСЭД в широком диапазоне применений, включая сосудистых, кости, хряща, нерва, кожи и пищевода тканевой инженерии 5,9-16. Благоприятный биосовместимость, относительно длинной в естественных условиях период полураспада, достаточную механическую прочность и высокая эластичность способствуют популярности этого полимера в тканевой инженерии. В модели грызунов заживления ран, имплантированных electrospun PCL было показано, что неиммуногенным и интегрировать в локальной ткани без побочных реакций 13. СЭМ-изображение electrospun PCL представлен на рисунке 1.
При нынешней FDA нормативных стандартов, эффективности и безопасности в малых и больших животных моделях потребуется для PCL или любой другой инженерии ACL трансплантата переехать в клинических испытаниях в США. Кроме того, условия в естественных условиях часто может увеличить свойства в пробирке ткани инженерии ACL трансплантата. Крыса модель аутогенной реконструкции передней крестообразной связки с сгибателей digitorгм большого пальца стопы сухожилия было описано ранее, в которой родной ACL, были разорваны, бедра и голени туннели были пробурены, и трансплантат был принят и закреплен в месте с швом 17-22. В этой статье мы опишем модификацию этой модели для оценки инженерных замены ACL, а не для аутотрансплантата на основе реконструкции (рис 2).
Хотя многие животные модели существуют связки тканевой инженерии, крыса является предпочтительным по сравнению с более крупными моделями по ряду причин. Эти преимущества включают легче земледелие, погрузку и разгрузку меньше этические соображения, а также снижение 17,23 затрат. Кроме того, модель крысы широко используется в качестве модели для ортопедической регенерации тканей, в том числе хрящ, сухожилия и тканевой инженерии 24 костей. В частности, бестимусных голых крыс были выбраны из-за их отсутствия клеточного иммунного ответа 25, что позволяет в конечном итоге имплантации OF ксеногенные донорские клетки в этой модели для дальнейшего повышения инженерии трансплантата в будущем. В этом методы работе мы описываем изготовление и хирургической имплантации ацеллюлярную, биоразлагаемый полимер трансплантата в бестимусным крысиной модели реконструкции передней крестообразной связки.
Protocol
Representative Results
Discussion
ACL травмы общее состояние в ортопедической спортивной хирургии, с ограниченными возможностями для реконструкции в настоящее время. Для того, чтобы разработать соответствующий тканевой инженерии замену для ACL, что позволит регенерацию в естественных условиях, подходящая животная…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Габриэль Arom и Майкл Yeranosian для их технический вклад в более ранних итерациях проекта. Этот проект был профинансирован OREF клиницист Scientist субсидия на обучение (NL), HH Ли Хирургическое исследовательских грантов (NL), по делам ветеранов BLR & D заслуги отзыв 1 I01 BX00012601 (DM) и опорно-двигательного Трансплантация Фонд молодого исследователя Award (FP).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Medical grade ester terminated poly (ε-caprolactone), granule form (MW = 110,000) | Lactel Absorbable Polymers | Custom synthesized polymer to desired molecular weight | |
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol | Sigma-Aldrich | 105228 | Solvent for PCL polymer |
| 18G x 1 1/2"bevel needle | BD Medical | 305196 | |
| Remote Infuse/Withdraw Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702101 | |
| VersaLaser VLS2.30 Laser Engraver | Microgeo USA | VLS2.30 | |
| Expanded Plasma Cleaner 115V | Harrick Plasma | PDC-001 | Plasma etch just prior to collagen coating for surface modification |
| PureCol Collagen Standard Solution, 3 mg/ml | Advanced Biomatrix | 5015-A | Mix 8:1:2.5 solution of PureCol, 10x PBS, 0.1N NaOH 1:9 in 1x PBS |
| Suture, 5-0 Vicryl | Henry Schein | 1086471 | |
| Suture, 4-0 Vicryl | Henry Schein | 6540072 | |
| Sharp-pointed Dissecting Scissors (Straight; 4.5 inch) | Fisher Scientific | 8940 | |
| Buphrenorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | B9275 | Use 0.03 mg/kg for both intra- and post-operatively for pain control |
| Ampicillin, injectable | Henry Schein | 1185678 | Use 25 mg/kg subcutaneously during the procedure |
| K-wire, 1.6 mm | Spectrum Surgical | SI040062 | |
| Keith Needle, Straight 1 1/2" | Delasco Dermatology Lab & Supply | KE-112 | |
| Immunocal Decalcifying Solution | Fisher Scientific | NC9491030 | |
| Opticryl Acrylic Resin Bone Cement (PMMA) (Monomer and polymer) | US Dental Depot | OPTICRYL 100410 | |
| Instron Model 5564 Tensile Testing Machine | Instron | 5564 | Any comparable tensile testing apparatus is suitable |
Referências
- Fetto, J. F., Marshall, J. L. The natural history and diagnosis of anterior cruciate ligament insufficiency. Clin Orthop Relat Res. (147), 29-38 (1980).
- Kim, Y. M., Lee, C. A., Matava, M. J. Clinical results of arthroscopic single-bundle transtibial posterior cruciate ligament reconstruction: a systematic review. Am J Sports Med. 39 (2), 425-434 (2011).
- Andersson, C., Odensten, M., Gillquist, J. Knee function after surgical or nonsurgical treatment of acute rupture of the anterior cruciate ligament: a randomized study with a long-term follow-up period. Clin Orthop Relat Res. (264), 255-263 (1991).
- Klimkiewicz, J. J., Petrie, R. S., Harner, C. D. Surgical treatment of combined injury to anterior cruciate ligament, posterior cruciate ligament, and medial structures. Clin Sports Med. 19 (3), 479-492 (2000).
- Petrigliano, F. A., McAllister, D. R., Wu, B. M. Tissue engineering for anterior cruciate ligament reconstruction: a review of current strategies. Arthroscopy. 22 (4), 441-451 (2006).
- Groot, J. H., et al. Use of porous polyurethanes for meniscal reconstruction and meniscal prostheses. Biomaterials. 17 (2), 163-173 (1996).
- Leong, N. L., Petrigliano, F. A., McAllister, D. R. Current tissue engineering strategies in anterior cruciate ligament reconstruction. J Biomed Mater Res A. 102 (5), 1614-1624 (2014).
- Duling, R. R., Dupaix, R. B., Katsube, N., Lannutti, J. Mechanical characterization of electrospun polycaprolactone (PCL): a potential scaffold for tissue engineering. J Biomech Eng. 130 (1), 011006 (2008).
- Shao, Z., et al. Polycaprolactone electrospun mesh conjugated with an MSC affinity peptide for MSC homing in vivo. Biomaterials. 33 (12), 3375-3387 (2012).
- Tillman, B. W., et al. The in vivo stability of electrospun polycaprolactone-collagen scaffolds in vascular reconstruction. Biomaterials. 30 (4), 583-588 (2009).
- Wise, S. G., et al. A multilayered synthetic human elastin/polycaprolactone hybrid vascular graft with tailored mechanical properties. Acta Biomater. 7 (1), 295-303 (2011).
- Vargel, I., Korkusuz, P., Menceloğlu, Y. Z., Pişkin, E. In vivo performance of antibiotic embedded electrospun PCL membranes for prevention of abdominal adhesions. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 81 (2), 530-543 (2007).
- Cao, H., McHugh, K., Chew, S. Y., Anderson, J. M. The topographical effect of electrospun nanofibrous scaffolds on the in vivo and in vitro foreign body reaction. J Biomed Mater Res A. 93 (3), 1151-1159 (2010).
- Joshi, V. S., Lei, N. Y., Walthers, C. M., Wu, B., Dunn, J. C. Macroporosity enhances vascularization of electrospun scaffolds. J Surg Res. 183 (1), 18-26 (2013).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospun poly(epsilon-caprolactone) microfiber and multilayer nanofiber/microfiber scaffolds: characterization of scaffolds and measurement of cellular infiltration. Biomacromolecules. 7 (10), 2796-2805 (2006).
- Vaz, C. M., van Tuijl, S., Bouten, C. V., Baaijens, F. P. Design of scaffolds for blood vessel tissue engineering using a multi-layering electrospinning technique. Acta Biomater. 1 (5), 575-582 (2005).
- Kawamura, S., Ying, L., Kim, H. J., Dynybil, C., Rodeo, S. A. Macrophages accumulate in the early phase of tendon-bone healing. J Orthop Res. 23 (6), 1425-1432 (2005).
- Hays, P. L., et al. The role of macrophages in early healing of a tendon graft in a bone tunnel. J Bone Joint Surg Am. 90 (3), 565-579 (2008).
- Dagher, E., et al. Immobilization modulates macrophage accumulation in tendon-bone healing. Clin Orthop Relat Res. 467 (1), 281-287 (2009).
- Bedi, A., et al. Effect of early and delayed mechanical loading on tendon-to-bone healing after anterior cruciate ligament reconstruction. J Bone Joint Surg Am. 92 (14), 2387-2401 (2010).
- Bedi, A., Kawamura, S., Ying, L., Rodeo, S. A. Differences in tendon graft healing between the intra-articular and extra-articular ends of a bone tunnel. HSS J. 5 (1), 51-57 (2009).
- Fu, S. C., et al. Effect of graft tensioning on mechanical restoration in a rat model of anterior cruciate ligament reconstruction using free tendon graft. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 21 (5), 1226-1233 (2013).
- Fan, H., Liu, H., Wong, E. J., Toh, S. L., Goh, J. C. In vivo study of anterior cruciate ligament regeneration using mesenchymal stem cells and silk scaffold. Biomaterials. 29 (23), 3324-3337 (2008).
- Landis, J. R., Koch, G. G. The measurement of observer agreement for categorical data. Biometrics. 33 (1), 159-174 (1977).
- Joshi, S. M., Mastrangelo, A. N., Magarian, E. M., Fleming, B. C., Murray, M. M. Collagen-platelet composite enhances biomechanical and histologic healing of the porcine anterior cruciate ligament. Am J Sports Med. 37 (12), 2401-2410 (2009).
- Leong, N. L., et al. In vitro and in vivo evaluation of heparin mediated growth factor release from tissue-engineered constructs for anterior cruciate ligament reconstruction. J Orthop Res. 10, (2014).
- Seo, Y. K., et al. Increase in cell migration and angiogenesis in a composite silk scaffold for tissue-engineered ligaments. J Orthop Res. 27 (4), 495-503 (2009).
- Freeman, J. W., Woods, M. D., Laurencin, C. T. Tissue engineering of the anterior cruciate ligament using a braid-twist scaffold design. J Biomech. 40 (9), 2029-2036 (2007).
- Bashur, C. A., Shaffer, R. D., Dahlgren, L. A., Guelcher, S. A., Goldstein, A. S. Effect of fiber diameter and alignment of electrospun polyurethane meshes on mesenchymal progenitor cells. Tissue Eng Part A. 15 (9), 2435-2445 (2009).
- Dash, T. K., Konkimalla, V. B. Poly-є-caprolactone based formulations for drug delivery and tissue engineering: A review. J Control Release. 158 (1), 15-33 (2012).
- Yoshimoto, H., Shin, Y. M., Terai, H., Vacanti, J. P. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24 (12), 2077-2082 (2003).
- Xu, Y., Ao, Y. F. Histological and biomechanical studies of inter-strand healing in four-strand autograft anterior cruciate ligament reconstruction in a rabbit model. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 17 (7), 770-777 (2009).
- Shino, K., et al. Replacement of the anterior cruciate ligament by an allogeneic tendon graft. An experimental study in the dog. J Bone Joint Surg Br. 66 (5), 672-681 (1984).
- Stasiak, M. E., et al. A novel device to apply controlled flexion and extension to the rat knee following anterior cruciate ligament reconstruction. J Biomech Eng. 134 (4), 041008 (2012).
- Brophy, R. H., et al. Effect of short-duration low-magnitude cyclic loading versus immobilization on tendon-bone healing after ACL reconstruction in a rat model. J Bone Joint Surg Am. 93 (4), 381-393 (2011).
