Atímicos Rata Modelo de Evaluación de Ingeniería de ligamento cruzado anterior injertos

Summary

Animal models are important tools for the evaluation of tissue-engineered grafts. This paper presents the protocol for preparing an electrospun biodegradable polymer graft for use in anterior cruciate ligament tissue engineering, as well as a surgical protocol for implantation in a rat model.

Abstract

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without intervention. Current treatment strategies include ligament reconstruction with either autograft or allograft, which each have their associated limitations. Thus, there is interest in designing a tissue-engineered graft for use in ACL reconstruction. We describe the fabrication of an electrospun polymer graft for use in ACL tissue engineering. This polycaprolactone graft is biocompatible, biodegradable, porous, and is comprised of aligned fibers. Because an animal model is necessary to evaluate such a graft, this paper describes an intra-articular athymic rat model of ACL reconstruction that can be used to evaluate engineered grafts, including those seeded with xenogeneic cells. Representative histology and biomechanical testing results at 16 weeks postoperatively are presented, with grafts tested immediately post-implantation and contralateral native ACLs serving as controls. The present study provides a reproducible animal model with which to evaluate tissue engineered ACL grafts, and demonstrates the potential of a regenerative medicine approach to treatment of ACL rupture.

Introduction

La rotura del ligamento cruzado anterior (LCA) es una de las más comunes las lesiones de ligamentos de la rodilla ^1. Debido a la rotura de ligamento cruzado anterior de es incapaz de curar sin intervención quirúrgica, las limitaciones en las actividades de la vida diaria, así como la participación en deportes en coche más de 175.000 pacientes a someterse a cirugía cada año ^2, con un costo estimado de mil millones de dólares al año ^3. En la actualidad, ya sea autoinjerto o aloinjerto de tendón se utiliza para la reconstrucción del ligamento. Aunque altas tasas de éxito se puede lograr tanto con autoinjerto y aloinjerto de reemplazo, las complicaciones graves se asocian con estas opciones de reconstrucción ^4. Tejido autoinjerto se asocia con morbilidad del sitio donante y se limita la oferta, sobre todo en casos de re-ruptura o lesiones múltiples ligamentosa. Por otro lado, el tejido de aloinjerto está vinculado con la integración retardada del injerto, la respuesta inflamatoria adversa, el riesgo infeccioso teórico, y supl limitadaly ^5. Injertos no degradables sintéticos fueron desarrollados en los años 1970 y 1980, pero se vieron obstaculizados por la ruptura prematura del injerto, reacción de cuerpo extraño, osteolisis, y sinovitis ^6. Como resultado de estas graves preocupaciones, actualmente no hay injertos sintéticos disponibles para uso clínico en los Estados Unidos.

Debido a estas limitaciones con opciones de injerto existentes y a la evolución reciente de la biología, la ingeniería y la medicina regenerativa, ha habido un gran interés en una solución de ingeniería de tejidos para ACL injerto. Las estrategias de ingeniería de tejidos actuales emplean materiales biológicos y sintéticos degradables para permitir el crecimiento de tejido anfitrión evitando al mismo tiempo las limitaciones asociadas con la implantación de material sintético permanente ^7.

La policaprolactona (PCL) es un polímero biodegradable que es aprobado por la FDA para un número de aplicaciones médicas, incluyendo barrera de adhesión y un vendaje de heridas ^8, que ha sido used en una amplia variedad de aplicaciones, incluyendo vascular, hueso, cartílago, nervios, piel, y la ingeniería de tejido esofágico ^5,9-16. Biocompatibilidad favorable, relativamente larga in vivo la vida media, una resistencia mecánica adecuada, alta elasticidad y contribuyen a la popularidad de este polímero en la ingeniería de tejidos. En un modelo de roedor de la cicatrización de heridas, implantado PCL electrospun ha demostrado ser no inmunogénica y de integrarse en el tejido local sin reacciones adversas ^13. Una imagen SEM de electrospun PCL se muestra en la Figura 1.

Con actual de la FDA reguladora normas, la eficacia y la seguridad tanto en modelos animales pequeños y grandes que se requeriría para un PCL o cualquier otro injerto de LCA diseñado para moverse en ensayos clínicos en los Estados Unidos. Además, las condiciones in vivo a menudo pueden aumentar las propiedades de un injerto de tejido in vitro de ingeniería. Un modelo de rata de la reconstrucción del LCA autólogo con digitor flexorum tendón del se ha descrito anteriormente, en el que se rompió el ligamento cruzado anterior nativa, femoral y tibial túneles fueron perforados, y el injerto fue aprobada y se fija mediante sutura ^17-22. En este artículo, vamos a describir una modificación de este modelo para la evaluación de los reemplazos de ACL ingeniería en lugar de para la reconstrucción a base de autoinjerto (Figura 2).

Aunque existen muchos modelos animales para la ingeniería de tejido del ligamento, la rata es ventajoso en comparación con los modelos más grandes para un número de razones. Estas ventajas incluyen la cría y manejo más fácil, menos consideraciones éticas, y la reducción de ^17,23 costo. Además, el modelo de rata se ha usado extensivamente como un modelo para la regeneración de tejido ortopédico, incluyendo el cartílago, tendón, y la ingeniería de tejido óseo ^24. En particular, las ratas desnudos atímicos se eligieron debido a su falta de respuesta inmune mediada por células ^25, permitiendo la implantación eventual of células del donante xenogeneicos en este modelo para mejorar aún más el injerto de ingeniería en el futuro. En este documento métodos, se describe la fabricación y la implantación quirúrgica de un acelular, injerto de polímero biodegradable en un modelo de rata atímicos de reconstrucción del LCA.

Protocol

NOTA: Todas las cirugías animales fueron aprobadas por el personal y animal veterinaria comité uso local antes de comenzar los experimentos. 1. Preparación de electrohiladas policaprolactona Andamios Pesar y disolver éster de grado médico terminado poli (ε-caprolactona) en forma de gránulos en 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol para crear un 10% w / w solución del polímero PCL. Deje que el revuelo solución utilizando una placa de agitación durante al menos 3 horas para a…

Representative Results

En nuestra experiencia de 92 cirugías de rata por un solo cirujano, el tiempo medio operatorio desde la incisión hasta la finalización de la herida fue de 16,9 min, con una desviación estándar de 4,7 min. En el momento del sacrificio, ratas pesaban 356 ± 23 g. Todas las ratas toleraron la cirugía bien, y no experimentaron complicaciones. Inmediatamente después de la cirugía, se observaron las ratas para soportar el peso sobre la extremidad operativa, pero mostraron una leve cojera. Una semana después de la ope…

Discussion

Las lesiones del LCA son una condición común en la cirugía ortopédica deportes, con opciones limitadas para la reconstrucción en la actualidad. A fin de desarrollar un sustituto de tejido de ingeniería apropiado para la ACL que permitirá la regeneración in vivo, se requiere un modelo animal adecuado. En este estudio, la fabricación de un injerto de ingeniería biodegradable se describe, como es su implantación in vivo utilizando un modelo reproducible de la reconstrucción del LCA en una rata…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Medical grade ester terminated poly (ε-caprolactone), granule form (MW = 110,000)	Lactel Absorbable Polymers		Custom synthesized polymer to desired molecular weight
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol	Sigma-Aldrich	105228	Solvent for PCL polymer
18G x 1 1/2"bevel needle	BD Medical	305196
Remote Infuse/Withdraw Programmable Syringe Pump	Harvard Apparatus	702101
VersaLaser VLS2.30 Laser Engraver	Microgeo USA	VLS2.30
Expanded Plasma Cleaner 115V	Harrick Plasma	PDC-001	Plasma etch just prior to collagen coating for surface modification
PureCol  Collagen Standard Solution, 3 mg/ml	Advanced Biomatrix	5015-A	Mix 8:1:2.5 solution of PureCol, 10x PBS, 0.1N NaOH 1:9 in 1x PBS
Suture, 5-0 Vicryl	Henry Schein	1086471
Suture, 4-0 Vicryl	Henry Schein	6540072
Sharp-pointed Dissecting Scissors (Straight; 4.5 inch)	Fisher Scientific	8940
Buphrenorphine hydrochloride	Sigma-Aldrich	B9275	Use 0.03 mg/kg for both intra- and post-operatively for pain control
Ampicillin, injectable	Henry Schein	1185678	Use 25 mg/kg subcutaneously during the procedure
K-wire, 1.6 mm	Spectrum Surgical	SI040062
Keith Needle, Straight 1 1/2"	Delasco Dermatology Lab & Supply	KE-112
Immunocal Decalcifying Solution	Fisher Scientific	NC9491030
Opticryl Acrylic Resin Bone Cement (PMMA) (Monomer and polymer)	US Dental Depot	OPTICRYL 100410
Instron Model 5564 Tensile Testing Machine	Instron	5564	Any comparable tensile testing apparatus is suitable